Name: 細胞ソーティングなしでスナップ凍結された不均一な組織サンプルから細胞種特異的RNAを単離(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶ細胞ソーティング不要でスナップ凍結した不均一組織から細胞種特異的RNAを単離する方法。NuTRAPマウスモデルとGLPプルダウンを用いて、リボソーム結合RNAを抽出し、精巢のLeydig細胞とSertoli細胞の遺伝子発現を解析する。

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この作業は、NIH R00HD082686によって部分的にサポートされていました。内分泌学会サマーリサーチフェローシップのH.S.Zに感謝します。また、マウスのコロニーの繁殖と維持について、Yuan Kang博士にも感謝します。

実施されたすべての動物実験は、オーバーン大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルに従いました。
注:次のプロトコルは、 Gli1-CreERT2のP28で1つの精巣(約100 mg)を使用します。NuTRAP マウス(ムスムスクルス)。試薬の量は、サンプルの種類と組織の数に基づいて調整する必要がある場合があります。
1.組織収集
<ol><li>CO2チャンバーを用いてマウスを安楽死させ、腹部表面を70%エタノールで消毒する。</li>
	<li>ハサミで下腹部を開き、精巣を取り除きます。液体窒素(LN2)を使用して、精巣をすぐに急速凍結します。</li>
	<li>サンプルは、使用するまでLN2 の気相に保管してください。</li>
</ol>2.試薬とビーズの準備
<ol><li>ホモジナイズストック溶液を調製する:50 mM トリス(pH 7.4)、12 mM MgCl2、100 mM KCl、1% NP-40、および1 mg/mLヘパリンを加えます。使用まで溶液を4°Cで保存してください(最大1ヶ月)。</li>
	<li>使用前に新たにストック溶液からホモジナイズ作業バッファーを調製します(ステップ2.1):DTT(最終濃度:1 mM)、シクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mL)、組換えリボヌクレアーゼ(最終濃度:200ユニット/mL)、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(最終濃度:1x)をホモジナイズストック溶液に加えて、必要量のホモジナイズ作業バッファーを作ります。作りたての作業バッファーは、使用するまで氷上に保管してください。</li>
	<li>低塩および高塩洗浄バッファーを準備します。<ol><li>50 mM トリス(pH 7.4)、12 mM MgCl2、100 mM KCl、および1% NP-40の低塩洗浄バッファーミックスを調製した。使用前にDTT(最終濃度:1 mM)とシクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mL)を加えてください。</li>
		<li>高塩洗浄バッファーミックス50mMトリス(pH 7.4)、12mMMgCl2、300mM KCl、1%NP-40を調製した。使用前にDTT(最終濃度:2 mM)とシクロヘキシミド(最終濃度:100 μg/mL)を加えてください。</li>
	</ol></li>
	<li>プロテインGビーズを準備する(材料の表):<ol><li>各サンプルには50 μLのプロテインGビーズが必要です。必要量のビーズを1.5 mLの遠沈管に入れ、磁気ラックを使用してチューブをラックに30〜60秒間置いて、ビーズを溶液から分離します。</li>
		<li>ピペッティングにより上清を除去する。毎回1 mLの氷冷減塩洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。</li>
	</ol></li>
</ol>3.組織の溶解と均質化
<ol><li>2 mLの氷冷ホモジナイズ作業バッファー(ステップ2.2で新たに調製)をガラスティッシュグラインダーセットに加えます。凍結したサンプルをグラインダーにすばやく入れ、緩い乳棒を使用して氷上で30ストロークで組織を均質化します。</li>
	<li>ホモジネートを2 mLの丸底チューブに移し、12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を新しい2 mLチューブに移します。100 μLを「入力」として1.5 mLチューブに保存します。</li>
	<li>2 mLチューブ内の上清を抗GFP抗体(5 μg/mL; 1:400)とともに、エンドオーバーエンドローテーター(24 rpm)上で4°Cで一晩インキュベートします。</li>
</ol>4. 免疫沈降
<ol><li>ホモジネート/抗体混合物を、ステップ2.4で洗浄したプロテインGビーズを含む新しい2 mLの丸底チューブに移します。エンドオーバーエンドローテーター(24 rpm)で4°Cで2時間インキュベートします。</li>
	<li>マグネットラックを使用して磁気ビーズを上澄みから分離します。上清を「陰性画分」として保存します。陰性画分は、(1)EGFP陰性細胞におけるRNAおよび(2)リボソームに結合していないEGFP陽性細胞におけるRNAを含有する。</li>
	<li>1 mLの高塩分洗浄バッファーをビーズに加え、チューブを短時間ボルテックスしてビーズを洗浄します。チューブをマグネットラックに入れます。</li>
	<li>洗浄バッファーを取り外します。洗浄手順をさらに2回繰り返します。ビーズには、EGFP陽性細胞由来のビーズ-リボソーム-RNA複合体が含まれるようになりました。</li>
</ol>5. RNA抽出
注:次の手順は、RNA分離キット(材料表)から採用されています。各フラクション(インプット、ポジティブ、ネガティブ)を独立したサンプルとして扱い、RNAを個別に分離します。
<ol><li>ステップ 4.4 のビーズを 50 μL の抽出バッファー (RNA 分離キットから) とともにサーモミキサー (42 °C、500 rpm) で 30 分間インキュベートし、ビーズから RNA を放出します。</li>
	<li>マグネットラックでビーズを分離し、ビーズ-リボソーム-RNA複合体を含む上清を1.5 mLチューブに移します。</li>
	<li>チューブを3000 x g で2分間遠心分離し、上清を新しい1.5 mLチューブにピペットで移します。このチューブには、TRAPステップの「正の割合」が含まれています。 注:インプットフラクションとネガティブフラクションについては、1 mLの抽出バッファーを使用して25 μLのサンプルからRNAを抽出します。サーモミキサー(42°C、500 rpm)で30分間インキュベートします。</li>
	<li>RNA精製カラムの事前コンディショニング:250 μLのコンディショニングバッファーを精製カラムにピペットで移します。室温(RT)で5分間インキュベートします。カラムを16,000 x g で1分間遠心分離します。</li>
	<li>ステップ5.3から上清に等量の70%EtOHをピペットする(陽性画分については約50μLの70%EtOH、投入画分および陰性画分については70%EtOHの1mL)。上下にピペッティングしてよく混ぜます。</li>
	<li>ステップ5.4の混合物をカラムにピペットで入れます。</li>
	<li>カラムを100 x gで2分間遠心分離して、カラム内のメンブレンにRNAが結合できるようにしてから、すぐに16,000 x gで30秒間遠心分離を続けます。フロースルーを破棄します。 注:インプットフラクションとネガティブフラクションについては、毎回250μLの混合物をカラムに追加します。すべての混合物が使用されるまで、手順5.6と5.7を繰り返します。</li>
	<li>洗浄バッファー1(W1)100 μLをカラムにピペットで入れ、8,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。</li>
	<li>ピペット75 μLのDNase溶液を精製カラムメンブレンに直接混合します。RTで15分間インキュベートします。</li>
	<li>40 μLのW1をカラムにピペットで入れ、8,000 x g で30秒間遠心分離します。フロースルーを破棄します。</li>
	<li>洗浄バッファー2(W2)100 μLをカラムにピペットで入れ、8,000 x g で1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。</li>
	<li>100 μLのW2をカラムにピペットで入れ、16,000 x g で2分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。同じカラムを16,000 x g で1分間再遠心分離し、溶出ステップの前に洗浄バッファーの痕跡をすべて除去します。</li>
	<li>カラムを新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	<li>12 μLのRNaseフリー水を精製カラムのメンブレンに直接ピペットで貼り付けます。ピペットの先端が膜に触れないようにしてください。RTで1分間インキュベートし、1000 x g で1分間遠心分離します。その後、16,000 x g で1分間遠心分離を続け、RNAを溶出します。</li>
</ol>6. RNAの濃度と品質
<ol><li>バイオアナライザーを使用して、抽出されたRNA10の質と量を評価します。</li>
</ol>7.保管とさらなる分析
<ol><li>さらなる分析(マイクロアレイ、定量的PCR(qPCR)、RNA-seqなど)まで、RNAを-80°C(最大1年間)で保存します。 注:cDNA合成を含むqPCR分析の詳細については、Lyuら11を参照してください。qPCR用のプライマーは材料 表に記載されています。</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-rc%2C+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).</li>
<li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28trap%29+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).</li>
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</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

全組織トランスクリプトーム解析の有用性は、特に複雑な不均一組織を研究する場合、損なわれる可能性があります。細胞種特異的RNAをいかに入手するかは、強力なRNA-seq技術を解き放つための緊急の必要性となっています。細胞種特異的RNAの単離は、通常、マイクロマニピュレーション、蛍光活性化セルソーティング(FACS)、またはレーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)を用いた特定の種類の細胞の収集に依存しています18。他の最新のハイスループット単一細胞収集方法および機器も開発されている19。これらの方法は通常、マイクロフルイディクス技術を使用して、単一細胞に続いて単一細胞RNA-seqをバーコード化します。細胞解離は、懸濁した細胞溶液を得るために必要なステップであり、その後、細胞選別機またはマイクロ流体デバイスのいずれかを通過して各細胞にバーコードを付けます。細胞解離ステップは、酵素処理が組織を破壊するだけでなく、細胞の生存率と転写プロファイルにも影響を与えるため、細胞タイプ特異的研究のためのこれらの方法に課題をもたらします<sup cl...

RNAシーケンシング(RNA-seq)やマイクロアレイなどのハイスループットアプローチにより、ゲノムワイドレベルで遺伝子発現プロファイルを調べることが可能になりました。心臓、脳、精巣などの複雑な組織の場合、細胞タイプ固有のデータは、組織全体からのRNAの使用を比較する詳細を提供します1、2、3。細胞の不均一性の影響を克服するために、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法が2010年代初頭から開発されてきました4。TRAPは、組織を解離することなく、特定の細胞タイプからリボソーム結合RNAを単離することができます。この方法は、ショウジョウバエ胚5の非常にまれな筋細胞集団の標的化、モデル植物シロイヌナズナ6のさまざまな根細胞の研究、哺乳類7の内皮細胞のトランスクリプトーム解析など、さまざまな生物のトランスラトーム(翻訳のためにリボソームにリクルートされるmRNA)分析に使用されています。
TRAPは、モデル生物のリボソームにタグを付けるための遺伝子改変を必要とする。今回、Evan Rosenたちの研究グループは最近、核タグ付けと翻訳リボソーム親和性精製(NuTRAP)マウス8と呼ばれるマウスモデルを開発したが、これは2017年からジャクソン研究所で入手できる。Creマウス株と交配することにより、研究者はこの NuTRAP マウスモデルを使用して、細胞を選別することなく、Cre発現細胞からリボソーム結合RNAおよび細胞核を単離することができます。 NuTRAP 対立遺伝子も持つCre発現細胞では、EGFP/L10aタグ付きリボソームにより、アフィニティープルダウンアッセイを使用して翻訳mRNAを単離できます。同じ細胞では、ビオチンリガーゼ認識ペプチド(BLRP)タグ付き核膜(これもmCherry陽性)であり、アフィニティーまたは蛍光ベースの精製を使用して核分離を可能にします。同じ研究チームはまた、核膜がビオチン8なしでmCherryのみで標識される同様のマウス系統を生成しました。これらの2つの遺伝子改変マウス株は、関心のある特定のタイプの細胞のペアのエピゲノムおよびトランスクリプトミクスプロファイルを特徴付けるためのアクセスを提供します。
ハリネズミ(Hh)シグナル伝達経路は、組織発生において重要な役割を果たします9。GLIファミリーのメンバーであるGLI1は、転写活性化因子として作用し、Hhシグナル伝達を媒介します。Gli1+細胞は、副腎や精巣を含む多くのホルモン分泌器官に見られます。NuTRAPマウスモデルを用いてGli1+細胞から細胞型特異的DNAおよびRNAを単離するために、Gli1-CreERT2マウスをNuTRAPマウスと交配した。Shh−CreERT2マウスはまた、音波ハリネズミ(Shh)発現細胞を単離することを目的としたNuTRAPマウスと交配した。次のプロトコルは、Gli1-CreERT2を使用する方法を示しています。NuTRAPマウスは、成体マウス精巣中のGli1+細胞からリボソーム結合RNAを単離します。

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>qPCRプライマー</td><td>ATGGAGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (フォワードプライマー/リバースプライマー)</td></tr><tr><td>バイオアナライザー</td><td>Agilent</td><td>2100 バイオアナライザー Instrument</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Millipore</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>cycloheximide</td><td>Millipore</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>qPCR プライマー</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (フォワードプライマー/リバースプライマー)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT、ジチオスレイトール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>ガラスグラインダー セット</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>heparin</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><<tr><td>em>Hsd3b</td><td>eurofins</td><td>qPCR プライマー</td><td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (フォワードプライマー/リバースプライマー)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ 2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Clariom S Assay microarrays</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Microarray service</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Millipore</td><td>492018-50 Ml</td><td></td></tr><tr><td>oligo (dT)20</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA 単離キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>プロテイン G ダイナビーズ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td>growcells</td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT 組換えリボヌクレアーゼ阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Sox9</td><td>eurofins</td><td>qPCR プライマー</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (フォワードプライマー/リバースプライマー</td></tr><tr><td>Superscript IV reverse transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins</td><td>qPCR プライマー</td><td>GAATGTGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (フォワードプライマー/リバースプライマー)</td></tr><tr><td>トリス</td><td>アルファ Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞ソーティングなしでスナップ凍結された不均一な組織サンプルから細胞種特異的rnaを単離(英語)

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

細胞の不均一性は、トランスクリプトームレベルで複雑な組織の機能を理解する上で課題をもたらします。細胞種特異的RNAを使用することで、組織の不均一性によって引き起こされる潜在的な落とし穴を回避し、強力なトランスクリプトーム解析を解き放ちます。ここで説明するプロトコルは、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法を使用して、細胞を選別することなく、複雑な組織内の少量のEGFP発現細胞からリボソーム結合RNAを単離する方法を示しています。このプロトコルは、最近入手可能な NuTRAP マウスモデルを使用して細胞タイプ特異的RNAを単離するのに適しており、EGFP発現細胞からRNAを単離するためにも使用できます。

Gli1-CreERT2マウス(ジャクソンラボストック番号:007913)を最初にNuTRAPレポーターマウス(ジャクソンラボストック番号:029899)と交配して、二重変異マウスを生成しました。遺伝子操作された両方の遺伝子対立遺伝子(すなわち、Gli1-CreERT2およびNuTRAP)を有するマウスに、タモキシフェンを1日1回、1日おきに3回注射した。組織サンプルは、注射の1日目の後の7日目に収集された。免疫蛍光分析により、EGFPが精巣の間質細胞で発現していることが示されました(図1)。この副腎被膜は、Gli112,13の別の細胞集団陽性であることが知られている。EGFPは、Gli1-CreERT2の副腎莢膜細胞にも見られました。NuTRAPマウス(<stro...

このプロトコルは、NuTRAPマウスモデルを使用して細胞型特異的翻訳リボソームmRNAを単離することを目的としています。

細胞ソーティングなしでスナップ凍結された不均一な組織サンプルから細胞種特異的RNAを単離(英語)

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

このプロトコルは、細胞を選別することなく、複雑な組織内の少数の細胞から高品質の細胞種特異的RNAを取得することを目的としています。最近入手可能なマウスモデルを採用しており、研究者はGLPプルダウンを使用してリボソーム結合RNAを単離することができます。この方法は、任意のEGFP発現細胞からリボソーム結合RNAを単離するのにも適している。まず、2ミリリットルの氷冷均質化作業バッファーをガラスティッシュグラインダーセットに追加します。凍結したサンプルをグラインダーにすばやく入れ、緩い乳棒を使用して氷上で30ストロークで組織を均質化します。ホモジネートを2ミリリットルの丸底チューブに移し、摂氏4度で10分間12, 000gで遠心分離します。次に、ペレットを乱すことなく上清を新しい2ミリリットルのチューブに移し、入力として100マイクロリットルを予約します。上清を抗GFP抗体とともに摂氏4度でエンドオーバーエンドローテーターで一晩インキュベートします。ホモジネートと抗体の混合物を、洗浄したプロテインgビーズを含む新しい2ミリリットルの丸底チューブに移し、ローテーター上で摂氏4度、24 RPMで2時間インキュベートしました。磁気ラックを使用して磁気ビーズを上澄みから分離します。上清を、EGFP陰性細胞のRNAおよびリボソームに結合していないEGFP陽性細胞のRNAを含む陰性画分として保存する。1ミリリットルの高塩分洗浄バッファーをビーズに加え、チューブを短時間ボルテックスしてビーズを洗浄します。次に、チューブを磁気ラックに入れます。洗浄バッファーを除去し、洗浄ステップをさらに2回繰り返して、EGFP陽性細胞からビーズリボソームRNA複合体を得た。RNA分離キットからの50マイクロリットルの抽出バッファーでビーズをサーモミキサーで30分間インキュベートし、ビーズからRNAを放出します。磁気ラックでビーズを分離し、上清を1.5ミリリットルのチューブに移します。チューブを3000gで2分間遠心分離します。次に、上清を新しい1.5ミリリットルのチューブにピペットで入れます。RNA精製カラムをプレコンディショニングするには、250マイクロリットルのコンディショニングバッファーを精製カラムにピペットで移し、室温で5分間インキュベートします。次にカラムを16, 000 gで1分間遠心分離します。等量の70%エタノールを細胞抽出液にピペットで入れ、ピペッティングでよく混ぜます。最大200マイクロリットルの混合物を、予め調整されたRNA精製カラムにピペットで入れます。サンプルの損失を減らすために、カラムをその容量の80%を超えて満たさないでください。すべてのRNAが各フラクションの同じカラムに収集されるまで、この手順を数回繰り返します。カラムを2分間遠心分離して、RNAをカラム内のメンブレンに結合させます。その後、遠心分離を30秒間続けます。フロースルーを廃棄し、100マイクロリットルの洗浄バッファー1をカラムにピペットで入れます。1分間遠心分離してから、フロースルーを廃棄します。ピペット75マイクロリットルのDNA溶液を精製カラム膜に直接混合します。室温で15分間インキュベートします。次いで、40マイクロリットルの洗浄バッファー1をカラムにピペットで入れ、さらに30秒間遠心分離する。フロースルーを破棄します。100マイクロリットルの洗浄バッファー2液をカラムにピペットし、8, 000 gで1分間遠心分離します。フロースルーを破棄します。PET100マイクロリットルの洗浄バッファー2をカラムに入れ、16, 000 gで2分間遠心分離します。フロースルーを廃棄し、同じカラムを16, 000 gで1分間再遠心分離して、洗浄バッファーの痕跡をすべて除去します。カラムを新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。12マイクロリットルのRNase遊離水を精製カラムのメンブレンに直接ピペットで送り、ピペットチップがメンブレンに触れないようにします。室温で1分間インキュベートし、1000 gで1分間遠心分離します。その後、16, 000 Gで1分間RNAを溶出します。バイオアナライザーを使用して、抽出されたRNAの質と量を評価します。RNAを80度の冷凍庫に保存するか、さらなる分析のために送り出します。遺伝子操作された遺伝子対立遺伝子であるGli1-CreERT2とNuTRAPの両方を持つマウスに、タモキシフェンを1日1回、1日おきに3回注射します。採取した組織の免疫蛍光分析は、EGFPが精巣の間質細胞で発現したことを示しています。EGFPは、NuTRAPマウスであるGli1-CreERT2の副腎莢膜細胞にも見られました。ソニックヘッジホッグ-CreERT2では、NuTRAPマウス EGFP陽性細胞集団は、カプセルの下の副腎の外皮質に存在し、EGFP事前発現細胞の発現を確認した。細胞種特異的RNAの抽出後、抽出したRNAをマイクロアレイ解析のために送った。結果は、陰性画分の遺伝子と比較して、約3000個の遺伝子が陽性画分で濃縮されたのに対し、陰性画分では約4, 000個の遺伝子が富化されていることを示した。差次発現遺伝子のうち、ライディッヒ細胞関連遺伝子Hsd11b1およびHsd3b6は陽性画分に富んでいた。陰性画分では、セルトリ細胞関連遺伝子デザートヘッジホッグおよびGstm6が富化されていた。陰性画分と入力を比較することで、発現差のある遺伝子はごくわずかしか同定されなかった。リアルタイム定量RT-PCRを使用して、陽性および陰性画分における主要遺伝子の発現を確認しました。マイクロアレイアッセイで見出されたものと同様に、ステロイド生成酵素3−βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびコレステロール側鎖切断酵素が陽性画分において富化されていた。一方、セルトリ細胞マーカーSRYボックス転写因子9種および生殖細胞マーカーシナプトン複合体タンパク質3種は陰性画分に富化していた。このプロトコルを試みる場合、使用前にのみDTT、シクロヘキシミド組換えリボヌクレアーゼ、およびプロテイナーゼ阻害剤カクテルをホモジナイズストック溶液に加える新鮮なホモジナイズ作業バッファーを調製することが重要です。使用前に新鮮な低塩および高塩洗浄バッファーを準備することも重要です。

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JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、ラット初代ニューロン培養とaRNAの増幅を使用して、その後のトランスクリプトーム解析から単一細胞の収穫のための簡単​​な方法を説明します。このアプローチは、任意の細胞型への一般化です。...

単一細胞のトランスクリプトーム解析

特定の組織中の細胞のサブセットの遺伝子発現解析は、主要な課題である。この記事では、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで迅速な免疫標識法を組み合わせることにより、特定の細胞集団から高品質のトータルRNAを分離する方法について説明します。...

迅速な免疫標識と合わせてレーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用して、細胞特異的な亜集団からのRNAの単離

ここでは、転写プロファイリングのための特定の植物細胞タイプのレーザー支援マイクロダイセクションのためのプロトコルを提示します。このプロトコルはさまざまな種や細胞タイプに適していますが、焦点は、アブラナ科Boechera属の有性生殖およびアポミティック生殖に重要な雌性生殖細胞の非常にアクセスしにくい細胞にあります。...

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

ここでは、急速に下流の並列 RNA 配列のため新鮮なまたは冷凍組織から高品質の核を分離するためのプロトコルを提案する.我々...

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

このプロトコルでは、高深度単一細胞 RNA 配列のため mRNA...

絶対数のシーケンス (Seq 歌姫) と手動並べ替えおよび二重の in Vitro転写を使用してマウスの蛍光に分類されたニューロンの単一細胞 RNA シーケンス

骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、レーザー捕捉微細解剖(LCM)プロトコルが開発されました。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、任意の硬質組織の細胞における遺伝子発現を研究するために使用することができる。...

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

この出版物は、成熟したアディポサイトからの核の単離、蛍光活性化分類による精製、および単一細胞レベルのトランスクリプトミクスのためのプロトコルを記述する。...

単細胞ゲノムアプリケーションのための脂肪組織核の分離

単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。...

洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

ここでは、一核RNA-seq、ATAC-seq、およびジョイントマルチオミクス(RNA-seqおよびATAC-seq)について、瞬間凍結されたアーカイブされた肝臓組織から核を単離するためのプロトコルを紹介します。...

シングルセルマルチオミクスのための瞬間凍結肝臓組織からの核の単離

ここでは、細胞核の調製を説明するプロトコルを提示します。心臓組織のマイクロ解剖および酵素的解離の後、前駆細胞を凍結し、続いて純粋な生細胞を単離し、単一核RNAシーケンシングおよびハイスループットシーケンシング分析によるトランスポゼーゼアクセス可能なクロマチンの単一核アッセイに使用しました。...

シングルセル分解能でのエピゲノムおよび遺伝子発現プロファイリングのためのマウス心臓前駆細胞からの核分離(英語)

この研究では、下流の単一核RNAシーケンシングのために、凍結した哺乳類組織から高品質の核を単離するための、シンプルで迅速、かつ部分的に自動化されたプロトコルについて説明しています。...

単一核の配列のための凍結した哺乳類ティッシュからの単一核の隔離のための簡単で、速く、部分的に自動化されたプロトコル

学ぶ細胞ソーティング不要でスナップ凍結した不均一組織から細胞種特異的RNAを単離する方法。NuTRAPマウスモデルとGLPプルダウンを用いて、リボソーム結合RNAを抽出し、精巢のLeydig細胞とSertoli細胞の遺伝子発現を解析する。

細胞ソーティングなしでスナップ凍結された不均一な組織サンプルから細胞種特異的RNAを単離(英語)

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