DNA-タンパク質相互作用を研究するためのCD分光法
2022年2月10日
ATP依存クロマチンリモデラーとDNAリガンドとの相互作用は、CD分光法を用いて説明されている。生成されたピークによって分析された遺伝子プロモーター上の誘導された立体構造変化を使用して、転写調節のメカニズムを理解することができる。
このプロトコルにより、ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質によって誘導されるDNAの再構成の変化を可視化することができます。DNA構造の変化は、転写調節と相関させることができる。これは、少量の純粋なDNAを使用してオリゴヌクレオチドの構造変化を記録する、簡単で高感度な技術です。
この方法は、ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質によって媒介される転写調節に関する洞察を提供することができる。まず、バッファーおよび他の反応成分の働く濃度を新たに調製し、反応を設定する前に摂氏4度に保ち、NADH結合酸化アッセイを用いて異なるDNA分子の存在下でタンパク質のATPase活性を測定する。0.1ミリモルADAAD、2ミリモルATP、10ナノモルDNA、1X REGバッファーを96ウェルプレートに250マイクロリットルの最終体積に混合します。
次に、37°Cインキュベーターで30分間反応をインキュベートし、次にマイクロプレートリーダーと一緒に提供されるソフトウェアを使用してNAD+の量を測定する。340ナノメートルで吸光度を測定するには、NADHアッセイをクリックし、機器のプレートホルダーに96ウェルプレートを置き、読み取りプレートボタンをクリックして吸光度を記録します。高透明性のクオーツキュベットでCDスペクトルを収集します。
長方形または円筒状のキュベットを使用します。キュベットをきれいにするには、水で数回洗浄してから、キュベット内の水またはバッファーのスキャンを行い、清潔かどうかを確認します。反応に対しては、PAGE精製DNAオリゴヌクレオチドを使用する。
速い冷却のために、熱ブロックで3分間摂氏94度でDNAを加熱し、すぐに氷の上で冷却します。ゆっくり冷却する場合は、DNAを摂氏94度で3分間加熱した後、1分間に1度の速度で室温まで冷却します。ベースラインスペクトルを記録するには、1.5ミリリットル遠心管に1つずつ5つの制御反応を設定します。
すべての反応で300マイクロリットルで反応量を保ちます。CDスペクトルを記録するために、1.5ミリリットル遠心管に1つずつ5つの実験反応を設定する。スキャンを記録するには、ガスの電源を入れ、CD分光器のスイッチを入れます。
10~15分後、ランプのスイッチを入れ、水浴のスイッチを入れ、ホルダーの温度を摂氏37度に設定します。次に、CDスペクトルソフトウェアを開き、温度を摂氏37度、波長範囲を180~300ナノメートル、ポイント当たりの時間を0.5秒、スキャン数を5に設定し、プロデータビューアをクリックして新しいファイルを作成し、実験の詳細と日付に変更します。次に、ピペット処理によりベースライン反応と実験反応を混合し、反応ミックスを1つずつキュベットに慎重に移し、気泡がないことを確認します。
タイムコース実験を行う場合は、必要な時間に摂氏37度で反応をインキュベートし、スキャンを行います。DNA、ATP、マグネシウム、およびタンパク質を含むバッファーにEDTAを加え、ATP加水分解を停止します。ATPase活性を完全に阻害するには、EDTA濃度およびインキュベーション時間を増加させる。
ソフトウェアの対応する反応からベースラインを引き、CDスペクトルソフトウェアまたはデータプロットソフトウェアのいずれかでデータを平滑化し、平均残基楕円度に対して波長のグラフをプロットし、ピークを分析します。M折り畳みは、MYC DNAの両方の鎖が茎ループ状の構造を形成できることを示した。G四重体GECEを含む前進および逆DNA配列のM折り構造をここに示す。
ATPとADAADの不在時に急速に冷却されたGECEのCDスペクトルは、ADAADが258ナノメートルで1つと210ナノメートルで他の2つの正のピークを誘発することを示した。EDTAの追加は、この立体構造変化を和らげる。CDスペクトルは現在、負の210ナノメートルのピークと230と250ナノメートルでピークを持つ広い正のバンドを持っています。
QGRSマッパーおよびM折り解析は、DROSHA、DGCR8およびDICERのプロモーター領域が、G四重体およびステム様構造を形成する可能性を有することを示した。DROSHAペア5のCDスペクトルは、ADAADが210ナノメートルで負のピークを誘導し、260ナノメートルで正のピークを誘発することを示した。このスペクトルはADNAの特徴です。
DGCR8ペア1のCDスペクトルは、210ナノメートルで正のピークを示し、260ナノメートルで広い負のピークを示した。このスペクトルはBからXへの遷移の特徴である。DGCR8ペア7では、210ナノメートルと270ナノメートルで強い正のピークと250ナノメートルでの負のピークが見られました。
このスペクトルは、並列G四重体DNA構造の特徴である。最後に、DICERペア1では、210ナノメートルで正のピークと2つの負のピーク、1つは230ナノメートル、もう1つは260ナノメートルで観察された。これらのピークは、AからXへのDNA転移の特徴である。
DNAとタンパク質の純度が99%以上であることを確認してください。キュベットは清潔で、ベースラインは1ミリ程度未満でなければなりません。すべての試薬は、背景が1ミリ度未満になるように純粋でなければなりません。
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概要
この研究では、CD分光法を用いてATP依存性クロマチンリモデラーとDNAリガンドの相互作用について説明します。遺伝子プロモーターで観察される構造変化は、転写調節メカニズムへの洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学分野
- クロマチンリモデリング
- 転写調節
- 構造生物学
背景
- ATP依存性クロマチンリモデラーは遺伝子発現に重要な役割を果たします。
- DNAの構造変化を理解することは転写メカニズムの解明に不可欠です。
- CD分光法はDNA構造を分析するための感度の高い技術です。
- 少量のDNAを使用して詳細な構造研究を行うことができます。
研究目的
- クロマチンリモデリングタンパク質によって引き起こされるDNA構造の変化を視覚化する。
- 構造変化と転写調節とを相関させます。
- CD分光法を用いてこれらの相互作用を研究するためのプロトコルを提供します。
使用された方法
- バッファーと反応成分の作業濃度の調製。
- 様々なDNA分子の存在下でのATPアーゼ活性の測定。
- NADHカップリング酸化アッセイの使用。
- ADAAD、ATP、DNA、REGバッファーを特定の濃度で96ウェルプレートで混合。
主要な結果
- CD分光法を用いてDNAの構造変化を成功裏に視覚化しました。
- DNA構造と転写調節の相関関係を確立しました。
- この方法は簡単で高感度であることが証明されました。
- ATP依存性クロマチンリモデリングタンパク質の役割への洞察を得ました。
結論
- この研究は転写調節メカニズムへの理解を深めます。
- CD分光法はDNAの構造変化を分析するための効果的なツールです。
- 将来の研究はこれらの発見に基づいてクロマチンダイナミクスをさらに探求することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Circular dichroism (CD) spectroscopy enables high-sensitivity detection of DNA conformational changes induced by chromatin remodeling proteins, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach supports predictive confidence in transcriptional regulation studies, facilitating risk-adjusted decisions at key inflection points in the biopharma pipeline. Its minimal sample requirements and quantitative outputs make it a scalable asset for portfolio-wide interrogation of DNA-protein interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of DNA structural changes upon protein binding, clarifying regulatory mechanisms.
- Supports functional validation of chromatin remodelers as drug targets by linking conformational shifts to transcriptional outcomes.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing sequence-specific and affinity-driven interactions.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven triage of candidate targets.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, quantitative readouts of DNA-protein interaction dynamics for assay standardization.
- Supports development of robust screening platforms by validating biological system readiness and minimizing background noise.
- Enables rapid assessment of mutant DNA sequences to probe specificity and optimize assay conditions.
- Facilitates platform reuse across multiple target classes due to minimal sample and instrumentation requirements.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling chromatin dynamics at gene promoters implicated in transcriptional regulation.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling structural biomarker identification.
- Supports risk-adjusted advancement by correlating in vitro conformational changes with potential in vivo regulatory effects.
Pipeline & Workflow Integration
CD spectroscopy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early mechanistic interrogation, assay development, and translational biomarker exploration for DNA-protein interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on chromatin remodeling and transcriptional regulation by visualizing DNA conformational shifts.
- Screening: Provides quantitative, reproducible spectra for comparing protein-DNA binding across conditions and mutants.
- Analytics: Outputs wavelength-resolved ellipticity data, enabling statistical comparison of structural states.
- Translational Research: Connects in vitro conformational signatures to disease-relevant promoter dynamics.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, low-input workflow adaptable across multiple gene targets and protein classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in chromatin biology.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible measurements with minimal sample requirements.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient triage of early-stage targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of transcriptional regulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biophysical analysis and chromatin biology for data interpretation.
- Needs access to high-sensitivity CD spectrometers and clean, high-purity reagents.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and baseline controls.
- Adaptable to various DNA sequences and chromatin remodelers with protocol optimization.
- Limited by the need for highly pure DNA and protein samples to minimize background signal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
ATPase Activity
1:35
Preparation of Circular Dichroism (CD) Cuvettes and DNA Oligonucleotides
2:19
Setting up the Experiments and Recording the Scan
4:10
Results: CD Spectra of MYC, DROSHA, DGCR8, and DICER Oligonucleotides in the Presence of ATP and ADAAD
6:18
Conclusion
