ゾヌラー繊維の粘弾性特性を決定するための生物学的調製と機械的技術

私たちの方法の重要性は、ゾーンファイバー、眼の中のレンズを吊り下げる繊維の粘弾性特性は何ですか?我々の技術の主な利点は、標的遺伝子改変の有無にかかわらず、マウス由来の小さく繊細なゾーン状繊維の粘弾性特性を定量できることである。ミクロフィブリルタンパク質をコードする遺伝子の変異は、いくつかの遺伝性シンドローム状態の根底にある。

我々の技術を用いて、特定の変異がミクロフィブリルの生体力学的特性をどのように変化させるかを調べることができる。まず、マウスを安楽死させた後、細かい鉗子を使って目を取り除きます。固定針の先端を目の壁から挿入し、レンズを傷つけないように注意しながら、硝子体液の中心に置きます。

4%パラホルムアルデヒドとリン酸緩衝生理食塩水で満たされたチューブに、突き刺さった目を慎重に移します。固定期間中、眼内の水銀の15〜20ミリメートルに相当する陽圧を維持する試料の上方25センチメートルに位置する固定リザーバに針を接続するバルブを開き、試料を一晩固定したままにする。翌日、固定針を外し、リン酸緩衝生理食塩水で10分間眼を洗った。

眼科手術用はさみと実体顕微鏡を採用することで、視神経頭付近の眼壁に全厚切開を行います。切断を赤道に向かって前方に伸ばし、次に目の赤道周囲の周りに伸ばし、繊細な毛様体プロセスと関連するゾーン状繊維を慎重に保存します。地球儀の裏側を取り外して、レンズの後面を露出させます。

鉗子を使用して解剖した目を緩衝液から取り除き、角膜を下向きにしてドライタスクワイプの上に置きます。角膜をワイプの表面上にそっとドラッグして乾燥させます。50ミリメートルのペトリ皿の底にインスタント接着剤の滴を適用し、それにプラットフォームを固定します。

実体顕微鏡のステージプレートに皿を置き、接着剤の入った井戸が見えるようにします。ペトリ皿のプラットフォームウェルに目を収容するために、3マイクロリットルのインスタント接着剤を加える。慎重に井戸に入れ、レンズの背面が上を向くように素早く調整します。

レンズの露出した側を、ドライワイプの角で優しく吸い取って乾かします。ゾーン粘弾性応答を測定するには、スケールをオンにし、シャーレをスケールの上に置き、スケールロギングプログラムとカメラソフトウェアを起動します。サーボモータコントローラの電源を入れます。

コンピューターでコントローラー・アプリケーションを起動し、モーション・パラメーターを 50 マイクロメートル単位で設定します。キャピラリーロッドに90度の曲げを作成します。曲がったキャピラリーをキャピラリープローブホルダーに滑り込ませ、固定ネジを締めます。

毛細血管先端に、UV硬化接着剤の小さなビーズを加える。マニピュレータの手動調整を使用してキャピラリープローブの先端を動かし、レンズの上部に直接配置します。顕微鏡カメラを用いた正面目視検査と側面図により、UV接着剤の底部がレンズの上部の中央に見えることを検査する。

カメラを覗き込みながら、UV接着剤がレンズに接触し、上面の1/3~1/2を覆うまでプローブ先端を下げます。波長380~400ナノメートル、強度約1ミリワットの指向性近可視UV光源を用いて接着剤を硬化させる。目が少なくとも2ミリメートルの深さまで覆われるまで、PBS溶液をペトリ皿に加える。

シリンドリカルレンズを顕微鏡の前に置き、ペトリ皿に触れることなくシャーレに近づけます。同時に、タイマープログラムでロギングを開始します。カメラを使って目とプローブの写真を撮ります。

60 秒後、50 マイクロメートルの変位を開始します。すべてのゾーン状繊維の破断によって示されるように実験が完了するまで、60秒ごとに繰り返す。実行の完了時にスケールログデータを保存し、互換性のあるスプレッドシート形式にエクスポートします。

また、走行中に取得したレンズ画像も保存します。データをスプレッドシートにインポートします。最初と最後のスケールの読み取り値を使用して、蒸発によるバックグラウンド読み取り値の時間の経過に伴うドリフトを補間し、各時点の読み取り値から補間された背景を減算します。

蒸発についてのアッセイおよび補正を行った後、粘弾性データのグラフを反転させる。瞬間的および緩和された力の大きさは、約1,000秒までの各ステップで増加し、その後、ゾーン状繊維が壊れ始めると、すべての繊維が破壊された1,500秒の時点に達するまで低下する。この実証のために、野生型およびMAGP−1欠損マウスについての粘弾性応答も比較した。

ゼロ〜600秒の初期時間において、グラフは互いに類似しており、ゾーン状繊維の粘弾性特性が有意に変化しなかったことを示唆している。しかし、MAGP-1ノックアウトマウスでは、繊維が早期に壊れます。ゾーン状繊維破断力は、1ヶ月および1歳の段階でMAGP-1対野生型マウスのプルアップ法で得られた。

結果は、野生型マウスの繊維の強度が加齢とともに増加することを示した。これらのステップ中に誤ってシャーレに接触すると、眼壁が眼レンズに対してシフトし、帯状繊維が損傷する可能性があります。このプルアップアッセイは、ミクロフィブリルの引張強度に寄与するタンパク質の同定に役立ちます。

この情報を使用して、ゾーン状ファイバーの内部のよりリアルなモデルを構築します。