Name: 母体クリスパントによる初期発生における母体発現遺伝子の役割の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶ母体CRISPR-Cas9法による初期発生における母体効果遺伝子の同定。マルチプレックスガイドRNAを用いてゼブラフィッシュDanio rerioの1世代で新規表現型を発見し、早期胚発生の分子メカニズム解明に貢献する。

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過去および現在のペレグリ実験動物飼育スタッフの方々に、水生施設の世話をしてくれたことに感謝します。また、ライアン・トレヴェナとダイアン・ハンソンによる原稿に対するコメントと洞察にも感謝しています。資金はNIH助成金からFPに提供されました(GM065303)

<ol><li>Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+factors+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Maternal factors in zebrafish development.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).</li>
<li>Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+interacts+with+Bucky+ball+to+form+germ+cells+and+is+required+to+pattern+the+zebrafish+body+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis.</a> Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).</li>
<li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aura+%28mid1ip1l%29+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).</li>
<li>He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+W-X+%22RNA%22">RNA</a>. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).</li>
<li>Burger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mutagenesis+with+solubilized+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).</li>
<li>Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li>
<li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li>
<li>Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-directed+gene+editing+for+the+generation+of+loss-of-function+mutants+in+high-throughput+zebrafish+F0+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).</li>
<li>Trubiroha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+CRISPR%2FCas-based+mutagenesis+assay+in+zebrafish+for+identification+of+genes+involved+in+thyroid+morphogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).</li>
<li>Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+method+for+directed+gene+knockout+for+screening+in+G0+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish.</a> Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).</li>
<li>Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maternal-effect+genes+in+zebrafish+using+maternal+crispants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants.</a> Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).</li>
<li>Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+primordial+germ+cells%3A+morphology+and+early+distribution+of+vasa+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).</li>
<li>Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation%2C+segregation%2C+and+dispersal+of+homotypic+germ+plasm+RNPs+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo.</a> Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).</li>
<li>Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+conserved+region+in+the+vasa+3%27UTR+targets+RNA+translation+to+the+germ+cells+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish.</a> Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).</li>
<li>Gagnon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mutagenesis+by+Cas9+protein-mediated+oligonucleotide+insertion+and+large-scale+assessment+of+single-guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs.</a> PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP%3A+a+CRISPR%2FCas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).</li>
<li>Moravec, C. E., Pelegri, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accessible+protocol+for+the+generation+of+CRISPR-Cas9+knockouts+using+INDELs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).</li>
<li>White, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+mRNA+expression+time+course+of+embryonic+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish.</a> eLife. 6, 30860(2017).</li>
<li>Aanes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mRNA+sequencing+deciphers+novelties+in+transcriptome+dynamics+during+maternal+to+zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition.</a> Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ensembl+gene+annotation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Database%3A+The+Journal+of+Biological+Databases+and+Curation%22%5BJournal%5D)">The Ensembl gene annotation system.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li>
<li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+and+identification+of+CRISPR%2FCas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969(2018).</li>
<li>Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((efficient+multiple+genome+modifications+induced+by+the+crRNAs%2C+tracrRNA+and+Cas9+protein+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish.</a> PloS One. 10 (5), 0128319(2015).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115(2009).</li>
<li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microinjection into zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, Clifton, N.J. 125-132 (1999).</li>
<li>Biology Mouse,, Zebrafish,, Chick, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%3A+Mouse%2C+Zebrafish%2C+and+Chick.+Zebrafish+Microinjection+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques.</a> JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>D'Agostino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+cheap+methodology+for+CRISPR%2FCas9+zebrafish+mutant+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening.</a> Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).</li>
<li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).</li>
<li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13d+induces+efficient+mRNA+knockdown+in+animal+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li>
<li>Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+haploid+zebrafish+embryos+by+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).</li>
<li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).</li>
<li>Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+Bucky+ball-GFP+transgene+visualizes+germ+plasm+in+living+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%3A+GEP%22%5BJournal%5D)">A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
</ol>

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

この原稿で提示されたプロトコルは、順方向および逆方向の遺伝学的手法の両方に必要な複数世代ではなく、単一世代における母性効果表現型の同定および一次分子特性評価を可能にする。現在、多くの母体発現遺伝子の役割は不明です。この知識の欠如は、母性効果遺伝子を特定する際に表現型を視覚化するために必要な余分な生成に一部起因しています。過去には、ゼブラフィッシュの母体効果遺伝子の迅速な同定は、翻訳をブロックするモルホリノオリゴヌクレオチドを培養卵母細胞に注入することによって達成できました32。この方法は、複数の既知の母体効果遺伝子を表現コピーすることで成功したことが証明されましたが、未熟な卵母細胞を操作することは、繊細で時間のかかる実験になる可能性があります。母体RNAは、CRISPR-RfxCas13d複合体を用いて分解の標的とすることもできるが、これらの複合体を1細胞胚に注入しても、母体から提供されたタンパク質33を標的にすることはできません。最近では、CRISPR-Cas9が生殖細胞系列に二対立遺伝子変異を誘導できることが発見され、単一世代で新しい母体...

母体寄託産物(RNA、タンパク質、その他の生体分子など)のプールは、胚の接合子ゲノムが活性化されるまでのすべての初期の細胞プロセスに必要です1。卵母細胞からのこれらの産物の時期尚早の枯渇は、典型的には胚性致死性である。発生におけるこれらの遺伝子の重要性にもかかわらず、多くの母体発現遺伝子の役割は現在不明です。CRISPR-Cas9などのゼブラフィッシュの遺伝子編集技術の進歩により、母体発現遺伝子の標的化が可能になりました2,3,4。ただし、母性効果表現型の同定には、接合子表現型と比較して余分な生成が必要であり、したがって、より多くのリソースが必要です。最近、CRISPR-Cas9の双対立遺伝子編集機能は、「クリスパント」として知られる注射された(F0)胚の体細胞組織における胚表現型のスクリーニングに使用されています5,6,7,8,9,10。クリスパント技術は、体細胞内の候補遺伝子の資源効率の高いスクリーニングを可能にし、発生における特定の側面の理解を容易にします。この論文で説明されているプロトコルは、単一の世代11で母性効果表現型、または「母体クリスパント」の同定を可能にします。このスキームは、ガイドRNAを単一の遺伝子にマルチプレックスし、生殖細胞系列における双対立遺伝子編集イベントを促進することによって達成可能です。これらの母体のクリスパント胚は、肉眼的形態学的表現型によって識別することができ、細胞境界の標識やDNAパターニングなどの一次特性評価を受けることができます11。誘導されたINDELの観察可能な表現型と基本的な分子特性を組み合わせた解析により、初期発生における標的遺伝子の役割を予測することができます。
ゼブラフィッシュでは、受精後最初の24時間(hpf)の間に、細胞の小さなグループが生殖系列12,13,14,15の前駆細胞である始原生殖細胞に発達します。F0雌が産んだクラッチでは、回収される母体のクリスパント胚の割合は、標的遺伝子に双対立遺伝子編集イベントを含む生殖細胞の数によって異なります。一般に、編集イベントが胚で早く発生するほど、生殖系列でCRISPR-Cas9変異が観察される可能性が高くなります。ほとんどの場合、母体のクリスパント胚の表現型は、発生中の卵母細胞に存在する2つの母体の対立遺伝子の機能の喪失に由来します。卵母細胞が減数分裂を終了すると、母体の対立遺伝子の1つが極体を介して胚から押し出され、もう一方の対立遺伝子が母体の前核に取り込まれます。複数の母体のクリスパント一倍体の配列決定は、表現型11に寄与する生殖細胞系列に存在する突然変異(挿入および/または欠失(INDEL))の混合物を表します。
以下のプロトコルでは、母体効果遺伝子にCRISPR-Cas9変異を作成し、母体クリスパントアプローチを使用して対応する表現型を特定するために必要な手順を説明しています(図1)。セクション1では、ガイドRNAを効果的に設計および作成する方法を説明しますが、セクション2と3には、マイクロインジェクションによって母体のクリスパンを作成するための重要なステップが含まれています。CRISPR-Cas9混合物を注入した後、注入された胚はPCRを介して体細胞編集についてスクリーニングされます(セクション4)。注入されたF0胚が発達して性的成熟に達すると、F0メスは野生型のオスに交配され、その子孫は母親効果表現型についてスクリーニングされます(セクション5)。セクション6には、CRISPR-Cas9誘発INDELを特定するためにサンガーシーケンシングと組み合わせることができる母体のクリスパント一倍体の作成に関する指示が含まれています。さらに、ディスカッションには、この方法の感度とパワーを高めるためにプロトコルに加えることができる変更が含まれています。

母体クリスパントによる初期発生における母体発現遺伝子の役割の決定

Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants

初期の発生は、卵形成中に成熟卵母細胞に組み込まれた母性因子のプールに依存し、接合子ゲノムが活性化されるまで発生に必要なすべての細胞機能を実行します。典型的には、これらの母性因子の遺伝的標的化は、母性効果表現型を同定するために追加の世代を必要とし、発生中の母体発現遺伝子の役割を決定する能力を妨げる。CRISPR-Cas9の双対立遺伝子編集機能の発見により、注入された胚または「クリスパント」の体細胞組織における胚表現型のスクリーニングが可能になり、発生プログラムにおいて接合体発現遺伝子が果たす役割の理解が深まりました。この記事では、クリスパントメソッドの拡張であるプロトコルについて説明します。この方法では、生殖細胞の二対立遺伝子編集により、単一世代で母性効果表現型、または「母体クリスパント」を単離することができます。単一の標的への多重化ガイドRNAは、母体クリスパントの効率的な生産を促進し、母体クリスパント一倍体の配列解析は、母体効果表現型を生成する遺伝的病変を裏付ける簡単な方法を提供します。母体クリスパントの使用は、母体発現必須遺伝子の迅速な同定をサポートし、したがって早期発生の理解を容易にする。

このプロトコルに記載されている実験的アプローチにより、母性効果表現型を迅速かつ資源効率の高い方法で同定することができます(図1)。
母体のクリスパントの生成: 単一の母体効果遺伝子候補を標的とする4つのガイドRNAを設計する場合、ガイドRNAがDNAに結合する場所に特別な配慮が必要です。一般に、それらはすべて、最初の予測タンパク質ドメインの開始時にガイドRNA間の重複領域が最小限またはまったくない状態でクラスター化する必要があります(図2A)。ガイドRNAをこのドメインに標的化すると、インフレームとアウトオブフレームの両方のINDELがタンパク質の機能に影響を与える可能性が高くなります。ガイドRNAを設計する際に考慮すべき他の変数は、切断効率とゲノム内のオフターゲットサイトの数です。
CRISPR-Cas9溶液を注入した後、アガロースゲル上で約100 bpの小さなPCR...

初期の開発は母性遺伝製品に依存しており、これらの製品の多くの役割は現在不明です。ここでは、CRISPR-Cas9を使用して、単一世代で母性効果表現型を特定するプロトコルについて説明しました。

Early development depends on a pool of maternal factors incorporated into the mature oocyte during oogenesis that perform all cellular functions necessary ...

発生初期における多くの母体発現遺伝子の役割は現在不明である。この母体CRISPR技術は、母性効果遺伝子および発生におけるそれらの役割の迅速な同定を可能にする。RNAを単一の遺伝子に導く多重化により、研究者は単一世代で新しい母性効果表現型を特定することができます。この研究は、初期の胚発生に必要な配偶子のmRNA転写産物の機能を理解するのに有益です。この技術の鍵は、1細胞期の早い段階で胚をマイクロインジェクションし、注入された胚に体細胞変異を起こすことができるガイドRNAの大部分を確認することです。各遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのガイドRNAテンプレートを作成するために、一定のオリゴヌクレオチドに分析物、T4 DNAポリメラーゼでオーバーハングを充填する。4つのガイドRNAテンプレートを組み立てた後、DNAクリーンアップおよび濃縮キットを使用してそれらを精製および濃縮します。in-vitro T7転写キットを使用して、プールされたガイRNAテンプレートからsgRNA混合物を合成し、原稿に記載されているようにin vitro転写を実行します。sgRNAの完全性を検証するために、ミリリットルあたり0.5マイクログラムの1%アガロース、臭化エチジウムトリス-ホウ酸-EDTAゲルをキャストします。固化したゲルをトリス-ホウ酸-EDTAランニングバッファーに入れます。1マイクロリットルのsgRNA混合物と1マイクロリットルのRNAゲルローディングバッファーを混合します。このサンプルをゲルに入れ、ゲルを100ボルトで5分間実行します。紫外線を使用してバンドを視覚化します。野生型の交配とゼブラフィッシュの交配ボックスを設定します。オスとメスの魚を同じ水槽に入れますが、交配ボックスの仕切りを使用するか、ここに示すように、メスを産卵インサートの中に入れて分離します。注射カクテルを組み立てた後、交配ボックスの仕切りを取り外すか、ここに示すように、オスをメスと同じ産卵インサートに入れて、オスとメスを交尾させます。胚を同期させるには、プラスチックストレーナーを使用して10分後に胚を収集し、1XE3培地を使用してペトリ皿にすすぎます。10〜15個の胚を取り除き、それらを別のペトリ皿に入れて、注射されていない対照として保管します。残りの胚を注射プレートウェルに移します。1ナノリットルのタンパク質sgRNA溶液を、1細胞胚の発育中の芽球椎間板に注入します。鉗子を使用して詰まった針の先端を壊し、針を再調整して1ナノリットルのボーラスを排出します。注射の翌日、注射されていないプレートから6つの健康な注射胚と2つの対照胚を収集します。各胚をPCRストリップチューブの単一ウェルに個別に入れ、チューブの上部にラベルを付けます。CRISPR-Cas9標的部位を含む100〜110塩基対のDNA断片を増幅するために、ガイド部位ごとに独自のスクリーニングプライマーを設計します。可能であれば、ターゲット部位を増幅されたフラグメントの中央に配置し、より大きな欠失を識別できるようにします。4つのガイドターゲット部位のそれぞれについて、調製した5マイクロリットルの単一胚ゲノムDNAと20マイクロリットルのPCRミックスを使用して8つの25マイクロリットルのPCR反応を設定し、特異的スクリーニングプライマー混合物をガイドして、標的部位の体細胞変異を特定します。幅約0.625センチメートルのウェルを作成する櫛を使用して、2.5%アガロース、0.5マイクログラム/ミリリットルのエチジウムブロマイドトリス-ホウ酸-EDTAゲルをキャストします。次いで、固化したゲルをトリス-ホウ酸-EDTAランニングバッファーを含む電気泳動チャンバーに入れる。5マイクロリットルの6Xローディング色素をPCR産物に加えます。この混合物を25マイクロリットルゲルにロードし、注入されたサンプルと対照サンプルが同じゲル列で実行されていることを確認します。すべてのサンプルをロードしたら、トリス-ホウ酸-EDTAランニングバッファー1リットルあたり5マイクロリットルの臭化エチジウムをゲルボックスの正端に追加します。DNA禁止が解決するか、DNAがレーンの終わりに近づくまで、ゲルを120ボルトで実行します。母性効果表現型と母体CRISPRの胚を特定するために、実験前の午後に野生型の雄に対してF0注射された雌を設定し、標準的なゼブラフィッシュの交配ボックスで野生型の交配を対照します。オスとメスの魚を同じ水槽に入れますが、交配ボックスの仕切りで分けるか、産卵インサートの中にメスを入れます。実験の朝に、交配ボックスの仕切りを取り外すか、オスをメスと同じ産卵インサートに入れて、オスとメスが交尾を開始できるようにします。産卵インサートを新鮮なシステム水を含む新しい交配タンクの底に移動して10分ごとに胚を収集し、個々のF0メスを識別するタグでタンクにラベルを付けます。古い交配タンクを取り、Tストレーナーを通して水を注ぎ、1人の個々の10分間クラッチから胚を収集します。超越光源を備えた解剖顕微鏡の下で、発生中の胚を1時間ごとに、最初の6〜8時間、そして次の5日間は毎日観察します。潜在的な母体のCRISPR胚を1XE3培地を含むペトリ皿に移し、受精後24時間で形態学的表現型をアッセイし、受精後5日目に生存率をアッセイします。実験前の午後、野生型のオスをメスから物理的に離しておくか、交配ボックスディバイダーを使用するか、メスを産卵インサートに入れることにより、F0メスの交配ペアを設定します。実験の朝に、物理パーティションを取り外して嵌合を開始します。産卵の最初の兆候で、オスとF0メスを分離して繁殖を中断し、分離されたF0メスをそれぞれ個別の交配ボックスに保管します。体外受精後、母体のCRISPR表現型が観察されるまで一倍体胚を発達させ、それらの胚を別のペトリ皿に入れます。母体のCRISPR一倍体胚が特定されたら、受精後少なくとも6時間発生させます。少なくとも10個の母体CRISPR一倍体胚からゲノムDNAを抽出するには、単一の一倍体胚をPCRストリップチューブの個々のウェルに入れ、ウェルから余分なE3培地を取り除き、50マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムを追加します。胚を摂氏95度で20分間インキュベートし、摂氏4度まで冷却します。次に、pH 7.5の1モルの三塩化三塩化酸を5マイクロリットル加え、5〜10秒間ボルテックスします。どのガイドサイトにインデルが含まれているかを特定するには、4つのCRISPR/Cas9ターゲットサイトすべてを含むDNAフラグメントを増幅するシーケンシングプライマーを設計します。準備した5マイクロリットルのゲノムDNAとシーケンシングプライマーを使用して、胚ごとに25マイクロリットルのPCR反応をセットアップします。PCRが終了したら、DNAクリーンアップおよび濃縮キットを使用して2つのサンプルを精製および濃縮し、フォワードシーケンシングプライマーおよびリバースシーケンシングプライマーを使用してDNAフラグメントをサンガーシーケンシングに送信します。ガイドRNAはすべて、母体CRISPRの生成中にガイドRNA間のオーバーラップ領域を最小限に抑えてクラスター化する必要があります。インデルが作成された場合、アガロースゲルに注入されたサンプルでは塗抹標本が観察されますが、注入されていないコントロールでは観察されません。母体CRISPR法は、モトリー、tmi、およびオーラなどの既知の母体効果変異を表現コピーするために使用することができる。母体のCRISPR表現型に寄与する遺伝的病変を特定するために、UV処理された精子と体外受精を組み合わせて、母体のCRISPR一倍体を作成します。一倍体の作成により、母体の対立遺伝子のサンガーシーケンシング、および母体のCRISPRインデルの同定が可能になります。非母性効果表現型を特定する場合、表現型がオフターゲットまたは非特異的効果ではなく、機能の喪失によって引き起こされる可能性を高めるため、複数のF0女性でそれを観察できることが不可欠です。母体効果表現型が同定された後、母体CRISPR胚を使用して、洞骨格やDNA分離など、初期胚発生のさまざまな側面への影響を調べることができます。これにより、研究者は表現型の分子的原因を理解することができます。この方法は、未知の母体発現遺伝子の機能を1世代で直接テストし、初期胚発生中に作用するプロセスの理解を促進します。

determining-role-maternally-expressed-genes-early-development-with

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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