メラノーマ転移の新規メディエーターの同定のための堅牢な発見プラットフォーム

このプロトコルは、メラノーマ転移の候補調節因子のインビボ効果を評価するために使用することができる連続ワークフロー内の一連の技術を記述するが、他の固体悪性腫瘍の転移のも評価する。当社の体系的なワークフローの主な利点は、堅牢で標準化されたin vivoモデルおよび技術によるデータの再現性の向上です。このパイプラインは、オミックスデータから推測される候補を試験するか、またはin vivo環境でインビトロアッセイを行うことによって、標的発見および治療法開発のための経路を提供する。

このプロトコルで提示された技術に関連する学習曲線は、提供された材料を使用し、ステップを実践するときに詳細な説明に従うことによって短縮される。この手順の実証を手伝うのは、The Preclinical Imaging Coreの研究科学者であるOrlando Aristizabalと、私の研究室のインストラクターであるRan Moubarakです。皮内注射の場合は、無菌状態を維持しながら、バイオセーフティキャビネット内で生後8~10週間のマウスを麻酔して剃毛します。

次に、針刺しの軌道に対して皮膚を後方につかんで引っ込め、長さ6ミリメートル、31ゲージのインスリン注射針を用いて、斜めを上に向けて鋭角に皮膚を優しく穿刺する。ドーム型の車輪が観察されるまで、30マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液をゆっくりと注入する。腫瘍の成長、体重減少、および全体的な健康状態の進行を監視します。

これらのモニタリングセッション中に、ノギスで測定を行い、腫瘍の長さと幅の寸法を使用して体積を計算します。心臓内注射のために、麻酔をかけられたマウスを超音波装置の加熱されたプラットフォーム上に移す。次いで、低アレルギー性テープを用いて、マウスを鼻円錐に固定する。

まっすぐなカミソリの刃またはメスの刃で胸部を剃り、30度の角度で傾け、10%ポビドンヨウ素で処置領域の周りの皮膚をきれいにする。次に、超音波プローブをマウスの左側に胸郭の中央に配置し、水平方向の窓を撮像し、左心室の断面図を得た。プローブの長軸を上に向けて、プローブを50度の角度で固定し、加熱されたプラットフォームを20度の角度で固定してから、プローブとサポートフレームをその位置にロックします。

安全キャビネット内で作業しながら、30ゲージの1インチ針を備えたツベルクリン1ミリリットルの注射器に細胞懸濁液を引き出します。シリンジ内に存在する気泡をすべて取り除きます。シリンジを定位インジェクターにロックします。

次いで、超音波誘導下で、胸壁を通って心臓の左心室に針を前進させ、100〜250マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液をゆっくりと注入する。段階的な生存手術のために、麻酔をかけられたマウスを温暖化パッドの上に置き、10%ポビドンヨウ素溶液で処置領域の周りの皮膚をきれいにする。滅菌された個人用保護具と手袋を着用した後、動物の体の上に滅菌ドレープを置きます。

次に、アイリスハサミまたはメスを使用して皮膚を切開し、腫瘍の端から5〜7ミリメートルの切除マージンを維持する。皮内腫瘍の場合は、周囲皮膚とともに腫瘍を切除する。皮下腫瘍の場合は、皮膚下の腫瘍を解剖して除去する。

腫瘍切除後、9ミリメートルのホチキス止め装置で創傷を閉じる。in vivoイメージングでは、1ミリリットルのインスリン注射器と28ゲージの針で腹腔内注射によりd-ルシフェリン基質をマウスに投与し、マウスを麻酔し、生物発光イメージングスキャナー内の鼻錐形に入れます。初期化を押して楽器を起動し、露出時間を自動に設定します。

背景の減算のために空白の画像をキャプチャするには、[取得]をクリックし、取得シーケンスの完了後に画像を保存します。データ解析および同じ in vivo イメージングソフトウェアの場合は、画像が保存されているフォルダーに移動し、1 回の実験からすべてのマウスの画像を開きます。単位を放射輝度に設定し、グループ間での信号の正規化を妨げるため、個人を示すチェックボックスがオフになっていないことを確認します。

次に、関心領域またはROI描画ツールを使用して、脳領域用の円形ROIおよび身体用の長方形のROIを描画し、脳ROI内の耳および鼻は不特定の輝度を放出する傾向があるので除外する。バイアスを最小限に抑えるには、発光信号が重なることなくマウスの写真にROIを描画し、ROIの測定を選択して信号を定量化し、データをスプレッドシートにエクスポートします。対象の身体領域における総発光フラックスをプロットすることによって、グループ間の差を分析する。

ソフトウェアを使用したNuMA染色の後、ROIを描画して、他の臓器実質および空のスペースを除く、臓器組織内のすべてのNuMA染色細胞を含む。各臓器に適切な陽性および陰性コントロールを使用しながら、NuMA陽性およびNuMA陰性細胞を分類するように設定を調整します。確立されたソフトウェアアルゴリズムを使用して、各サンプルのNuMA陽性細胞の割合の総数を定量化します。

生物発光、明視野、エキソビボ蛍光ならびにヘマトキシリンおよびエオジン染色画像は、メラノーマ転移に対する候補遺伝子効果の分析のための多面的アプローチを示す。フコシルトランスフェラーゼサイレンシングは、メラノーマ細胞の転移性播種を障害した。コントロールリンダウイルスおよびリンダウイルスを発現する転移抑制因子に感染させたメラノーマ細胞のNuMA染色肺切片をここに示す。

転移性黒色腫細胞は緑色に標識され、器官領域は緑色の斜線で区切られている。皮内注射を行う際に皮膚の適切な張力を維持し、注射器を調製する際に空気塞栓症を回避し、動物の移動を妨げたり創傷合併症の素因とならない適切な切除マージンを得ることは、成功率と再現性を改善するのに役立ちます。免疫ろ過を調べるためのマルチプレックスイメージングのさらなる採用、遺伝子発現解析のための単一細胞RNAシーケンシング、空間トランスクリプトミクスはすべて、腫瘍内の不均一性を調べるための補完的な手段を提供する可能性があります。

このプロトコルに記載されている技術の組み合わせは、神経炎症の抑制および脳転移の促進におけるメラノーマ分泌アミロイドベータの役割など、メラノーマ脳転移における新規調節因子を同定するのに役立ちました。