Name: ショウ ジョウバエ 脳外植における神経幹細胞の再活性化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 学ぶショウジョウバエ脳外植培養における静止神経幹細胞の再活性化方法。インスリン含有培地を用いて神経芽細胞の増殖を誘導し、EDUラベリングで解析することで、細胞周期再進入の機構を解明し、幹細胞治療の発展に貢献する。

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我々は、LSAMP Bridges to Doctorate Program for Funding(CNK)並びにNIH/NIGMS(R01-GM120421及びR35-GM141886)を認める。図1のコナー・サイプ博士に感謝しています。また、Siegrist のラボメンバーの皆さんの継続的なサポートとメンターシップにも感謝します。特に、Chhavi SoodとGary Teetersが原稿を注意深く読み、コメントを提供してくれたことに感謝します。

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<li>Speder, P., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+and+local+cues+drive+neural+stem+cell+niche+remodelling+during+neurogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila.</a> Elife. 7, 30413(2018).</li>
<li>Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dilp-2-mediated+PI3-kinase+activation+coordinates+reactivation+of+quiescent+neuroblasts+with+growth+of+their+glial+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche.</a> PLoS Biology. 18, 3000721(2020).</li>
<li>Colombani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nutrient+sensor+mechanism+controls+Drosophila+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth.</a> Cell. 114, 739-749 (2003).</li>
<li>Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+insulin+secretion+by+fat+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culturing+of+whole%2C+developing+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270(2012).</li>
<li>Bostock, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immobilization+technique+for+long-term+time-lapse+imaging+of+explanted+drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094(2020).</li>
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</ol>

著者は競合する利害関係を持っていません。

脳外植体を培養するためにここで記載した方法は、ほとんどの実験室環境で実施することができる。必要なツール、手順、データ収集はシンプルで簡単です。この方法では、細胞シグナル伝達カスケードおよびNBの再活性化および増殖を調節する外因性因子に関連するものを含む、様々な仮説を検定することができる。ここで、野生型オレゴンR動物を用いて、我々は、外因性インスリンが、他の動物特異的な全身的手がかりとは無関係に静止からNBを再活性化するのに十分であることを見出した。GAL4/UASシステムを使用して、NB再活性化におけるPI3キナーゼシグナル伝達の役割をよりよく理解するために、インスリン経路成分を細胞型特異的な方法でノックダウンまたは過剰発現させることもできる。遺伝学を使用することに加えて、培地中の成分を操作して、NBの再活性化および増殖を促進する外因性の手がかりまたはシグナルをさらに試験することもできる。例えば、ステロイドホルモンのエクジソンの添加が培養中のNB再活性化および増殖の割合を増加させるという仮説を検定することができる。
この方法は簡単ですが、早い段階でいくつかの技術的な困難を経験しまし...

幹細胞は、再生医療での使用の可能性のために大きな関心事です1,2。多くの動物、特に長命の動物は、成体組織内で幹細胞を維持しています。これらの常在幹細胞は、組織の恒常性を維持するために機能し、身体的傷害または疾患後の修復に利用される3,4。成体動物におけるほとんどの幹細胞は静止状態であり、細胞周期停止および成長シグナル伝達の不活性化を特徴とする比較的休眠状態である5。外因性の手がかりに応答して、幹細胞は静止状態から抜け出し、細胞周期に入り、組織型に特異的な娘の子孫を生成し始める。例えば、効果的な免疫応答をマウントするために、抗原提示細胞は静止期のナイーブT細胞を誘導して細胞周期に入り、クローン的に拡張する6。骨格筋損傷に応答して、筋衛星幹細胞は細胞周期に入り、損傷した筋原線維を置き換えるために娘筋芽細胞を生成する5,7。静止幹細胞が外因性シグナルに応答することは明らかであるが、多くの場合、外因性手がかりの性質および手がかり誘導幹細胞活性化のメカニズムは不明のままである。静止幹細胞が外因性の手がかりにどのように反応し、細胞周期に入るかについてのより良い理解を得ることは、診療所におけるより良い幹細胞療法の開発に役立ち、科学的知識を増加させるでしょう。
何十年もの間、モデル生物は、発生中および成人期の幹細胞増殖を調節する遺伝子および細胞シグナル伝達経路を明らかにするために使用されてきた。ショウジョウバエでは、神経芽細胞(NB)として知られる神経幹細胞(NSC)が発達中分裂し、最終的に統合するすべてのニューロンとグリアが生成され、脳機能に必要な神経回路を形成します8,9。他の幹細胞と同様に、NBは自己再生するために非対称的に分裂し、場合によっては対称的に分裂して幹細胞プールを拡張する。NBは胚発生時に特定され、そのほとんどは母親の栄養貯蔵量の減少と同時に、終わりに向かって静止状態に入る(図1)。胚発生が完了すると、幼虫は孵化し、摂食を開始する。動物摂食に応答して、NBは静止から再活性化し、細胞分裂を再開する10、11、12、13、14、15、16。ショウジョウバエのCNSは比較的単純であり、NBは定義された時間に静止に出入りするため、ショウジョウバエを使用して静止、出入りの調節を調査することは理想的であることが証明される。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63189/63189fig01.jpg"> 図1:発生時間にわたるCB NB(中枢脳神経芽細胞、赤)およびMB NB(キノコ体神経芽細胞、青)の相対増殖。 胚発生の終わりに、ほとんどのNB(赤い線)は増殖を停止し、静止状態に入る。孵化したばかりの幼虫が最初の完全な食事を消費するまで、静止は続きます。この方法論の焦点の時間は、赤い円(1、静止および2、再活性化)で示されます。MB NB(青)は、発達中枢脳NBのサブセットであり、発達中(脳半球あたり4つ)に継続的に分裂する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63189/63189fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
動物摂食に応答して、PI3キナーゼおよびTOR成長シグナル伝達経路は、NBsおよびそれらのグリアおよび気管ニッチにおいて活性になる10、11、15、16。食事性栄養素が取り出されるか、またはPI3キナーゼのレベルが低下すると、NBは再活性化に失敗し、グリアおよび気管の成長も減少する10,11,15,16。現在のモデルは、NB再活性化が脂肪体による幼虫の成長に結合され、動物摂食に応答して全身シグナルを放出すると仮定している12、17、18。このシグナルは、とらえどころのないままであり、脳内のショウジョウバエインスリン様ペプチド(Dilps)の発現および放出を促進する可能性が高く、NBおよびそれらのグリアおよび気管ニッチにおけるPI3キナーゼの下流活性化をもたらす。全身の手がかりの性質をよりよく理解するために、我々は培養された脳外植体において静止性NBを再活性化する方法を開発した。この方法を使用すると、NBsの再活性化を、動物全体の全身的手がかりの非存在下でアッセイすることができる。外因性因子は、培養培地に再供給され得、そしてチミジン類似体EdUの組み込みに基づいてアッセイされたNB再活性化である。この方法を用いて、我々は、外因性インスリンが脳外植体における静止性NBを再活性化するのに十分であると決定した。今後の研究は、脳外植体におけるNB静止を正または負に調節する追加因子を特定することを目的としている。

<table><tbody><tr><td>10 &micro;Lピペットチップ</td><td>Denville Sci</td><td>P2102</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro;L ピペットチップ</td><td>Denville Sci</td><td>P2103-N</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro;L Pipettor</td><td>Gilson</td><td>P1000</td><td></td></tr><tr><td>16% パラホルムアルデヒド (10 x 10 mL)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>2912.60.0000</td><td>幼虫の脳の固定に使用</td></tr><tr><td>20 &micro;L ピペット</td><td>Gilson</td><td>P20</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;L ピペットチップ</td><td>デンビル Sci</td><td>1158U56</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル マルチウェル培養プレート</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>50-197-4477</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ペトリ皿</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>08-757-100A</td><td>グレープ プレート 成分</td></tr><tr><td>4 >C冷蔵庫</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ック <td>抗体溶液での>24時間のインキュベーションに理想的な温度を提供します</td></tr><tr><td>63倍 客観的</td><td>レシア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アクティブドライイースト</td><td>ほとんどのスーパーマーケット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>214010</td><td>グレーププレート 成分</td></tr><tr><td>Click-iT EdU イメージング用細胞増殖キット、Alexa Fluor 647 色素</td><td>サーモフィッシャー増殖</td><td>細胞を標識する</td>科学的な<td>C10340</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ 22 mm x 22 mm x 1 mm、4オンスの10パック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-10</td><td>2つのカバースリップは、顕微鏡スライドの端に瞬間的に接着されています。これにより、脳がイメージ化されながらアンチフェードに浮かぶことができるスペースが生まれます。</td></tr><tr><td>カバースリップ、22 mm x 50 mm x 1 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-545E</td><td>カバースリップは、顕微鏡スライド上の2つの正方形のカバースリップに配置され、イメージング中にアンチフェードの脳が動かないようにします。</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>ステミ 2000</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 200 プルーフ (100%)、デコンラボ、1ガロンボトル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>2701</td><td>培養培地で24時間保持する前に幼虫を洗い流すために使用されます</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (10%)</td> <td>シグマ</td><td>F4135-100ML</td><td>細胞培養培地用サプリメント。</td></tr><tr><td>解剖用ファインファイン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-20</td><td>解剖に使用されるフォーセプト。研ぐと最もよく機能します。</td></tr><tr><td>交差のためのフライボトル</td><td>ジェネッシーサイエンティフィック</td><td>32-130</td><td>このボトルは、フライがブドウのプレートに卵を産むための容器として使用されます。</td></tr><tr><td>ガラス解剖皿(3ウェル)</td><td>これらはもう利用できません</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルタチオン</td><td>シグマ</td><td>G6013</td><td>細胞培養中に酸化保護を提供します。</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>シグマ</td><td>G9023-10ML</td><td>ブロッキングエージェント</td></tr><tr><td>グレーププレート自家製</td><td></td><td></td><td>孵化したての卵を収集するための自家製グレープジュース/アガロースプレート</td></tr><tr><td>画像J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>無料ダウンロード:&nbsp;</td><td>細胞のカウントとEduの再活性化に使用される https://fiji.sc イメージングプラットフォーム</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>温度、湿度、光の露出が実験全体でまったく同じであることを確認します。</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ</td><td>I0516</td><td>実験の独立変数</td></tr><tr><td>層流フード</td><td></td><td></td><td>培地分注用</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>シグマ</td><td>G7513</td><td>細胞培養中にサポートを提供</td></tr><tr><td>Nunc 72ウェルマイクロウェルミニトレイ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-565-154</td><td>免疫染色ステップは、このトレイで行われます</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S37440</td><td>蒸発を防ぐためにプレートをシールするために使用されるフィルム</td></tr><tr><td>ペン連鎖球菌</td>シ<td>グマ</td><td>P4458-100ml</td><td>培養中の細胞の細菌汚染を防ぐために使用される抗生物質。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝液、pH7.4</td><td>自家製</td><td>自家製</td><td>固定および染色ステップ後に脳を洗浄するために使用される溶剤</td></tr><tr><td></td><td>ピックファインサイエンスツール</td><td>10140-01</td><td>ブドウプレートから幼虫を拾うために使用されます</td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-258</td><td>グレーププレート成分</td></tr><tr><td>ウサギ405</td><td>アブカム</td><td>ab175653</td><td>免疫染色</td></tr><tr>に使用される抗体<td>ラット555</td><td>Abcam</td><td>ab150166</td><td>免疫染色に使用される抗体</td></tr><tr><td>Rb Scribble</td><td>クリス・ドウ</td><td></td>からの贈り物 <td>免疫染色に使用される抗体</td></tr><tr><td>Rt Deadpan</td><td>Abcam</td><td>ab195173</td><td>免疫染色に使用される抗体</td></tr><tr><td>シュナイダース培養 メディウム</td><td>ライフサイエンス 21720024</td><td></td><td>細胞の成長と増殖を助ける栄養素が含まれています</td></tr><tr><td>SlowFade Diamond退色防止剤 (5 x 2 mL)</td><td>Life Tech</td><td>S36963</td><td>蛍光色素の色退きを防ぐ試薬</td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>オートクレーブ Milli-Q水 自家製</td><td></td><td>溶液に必要</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャー</td><td>S2-12</td><td>グレーププレート 成分</td></tr><tr><td>スーパーフロスト 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>瞬間接着剤</td><td>ほとんどのスーパーマーケット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テゴセプト</td>ジェ<td>ネシーサイエンティフィック</td><td>20-259</td><td>グレーププレート成分</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td>シ<td>グマ</td><td>T9284-100ML</td><td>PBT</td></tr><tr><td>ウェルチの100%グレープグレープジュース</td><td>ほとんどのスーパーマーケット</td><td></td><td>グレーププレート成分</td></tr></tbody></table>

ショウ ジョウバエ 脳外植における神経幹細胞の再活性化

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

神経幹細胞(NSC)は、増殖、分化、アポトーシスを受け、さらには静止に出入りする能力を有する。これらのプロセスの多くは、NSC内因性遺伝プログラムとNSC外因性因子(局所的および全身的)との間の複雑な相互作用によって制御される。遺伝子モデル生物である ショウジョウバエのメラノガスターでは、神経芽細胞(NB)として知られるNSCsは、胚から幼虫への移行中に静止から増殖に切り替わります。この間、幼虫は卵の殻から出てきて這い回り始め、食事の栄養素を探します。動物の摂食に応答して、脂質貯蔵能力を有する内分泌器官である脂肪体はシグナルを生成し、循環血リンパに全身的に放出される。脂肪体由来シグナル(FBDS)に応答して、 ショウジョウバエ インスリン様ペプチド(Dilps)が産生され、脳神経分泌ニューロンおよびグリアから放出され、NBおよびそれらのグリアおよび気管ニッチにおけるPI3キナーゼ成長シグナル伝達の下流活性化をもたらす。これは、NBが静止から増殖にどのように切り替わるかについての現在のモデルであるが、FBDS外因性手がかりの性質は依然として解明されていない。NB外因性全身の手がかりが静止からの出口をどのように調節するかをよりよく理解するために、動物給餌前に初期の幼虫脳をインビトロで培養する方法が開発された。この方法を用いると、外因性因子を培養培地に供給し、NBがアッセイされて静止状態から脱退することができる。我々は、外因性インスリンが全脳外植体の静止からNBを再活性化するのに十分であることを見出した。この方法は大規模なスクリーンに適しているため、NBの静止と拡散の決定を調節する追加の外因性手がかりを特定することを目指しています。NSCの増殖決定を調節する遺伝子および経路は進化的に保存されているため、このアッセイの結果は、診療所における再生療法の改善に関する洞察を提供する可能性がある。

孵化したばかりのオレゴンR野生型脳を解剖し、シュナイダー培地(SSM)にインスリンを補給して24時間培養した。組織は、プロトコールに従って固定および染色された。NBsを検出するためにデッドパン(Dpn)に対して生成された一次抗体および細胞膜を標識するために落書きが用いられた。チミジン類似体5-エチニル-2'-デオキシウリジン(Edu)を添加し、S相の侵入およびNB再活性化を検出した。培養において24時間後に大型のEdu陽性およびDpn陽性NBが見出された(図6A-C)。次に、孵化したばかりのオレゴンR野生型脳を、インスリンを含まない補充シュナイダー培地で24時間培養した。培養で24時間後、我々は4つのキノコ本体NBと1つの腹側NBを除いて、大型のEdu陽性およびDpn陽性NBは見つからなかった(図6D-F)。キノコ体および腹側神経芽細胞は、胚から幼虫への移行の間に連続的に分裂する中枢脳...

培養ショウ ジョウバエ 脳外植体において静止期神経幹細胞を再活性化する方法が確立されている。この方法を用いて、神経幹細胞の静止、入口および退出の調節において、全身性シグナルの役割を組織内因性シグナルから切り離すことができる。

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes ...

培養ショウジョウバエ脳外植体中の静止神経幹細胞を再活性化する方法を開発しました。この方法は、外因性因子を培養培地に供給することができ、神経芽細胞の再活性化をアッセイすることができる。より優れた幹細胞療法は、静止期幹細胞が外因性の手がかりにどのように反応し、細胞周期に入るかをよりよく理解することによって開発される可能性があります。手順を実演するのは、私の研究室の研究員であるスーザン・ドイルです。解剖顕微鏡下でブドウ寒天プレートから約20〜25匹の孵化したばかりの幼虫を慎重に摘み取り始める。ペトリ皿に約2ミリリットルのPBSを入れ、幼虫を含む道具の先端をPBSに2分間沈める。2分後、皿を斜めに傾けて底に液体を溜め込み、小さなペイントブラシを使用して、幼虫を液体からペトリ皿の底までブラシで塗ります。ペイントブラシ上のすべての幼虫を収集し、PBSを含むペトリ皿に戻す前に、幼虫を70%エタノールで短時間すすいでください。作業エリア、解剖ツール、鉗子、および2つのガラス時計皿に70%エタノールをスプレーし、ベンチで乾燥させます。補充したシュナイダーの培養液(SSM)を作り、氷の上に置きます。各ガラス時計皿に培地1ミリリットルをピペットする。滅菌チップを有するマイクロピペットを用いて、孵化したばかりの幼虫をPBSのプレートから第1のガラス時計皿中のSSMに移す。2枚目のガラス時計皿に入れた幼虫から脳を解剖顕微鏡下で鉗子を用いてSSMで解剖し、必要に応じて倍率を調整する。片方の鉗子を使って口のフックをつかみ、もう片方の鉗子を使って体を半分下にそっとつかみ、反対方向に引っ張って幼虫を2つに分けます。15〜20個の脳を解剖した後、滅菌24ウェル培養トレイの1ウェルに1ミリリットルのSSMを加える。マイクロピペットおよび滅菌チップを用いて、新しく解剖した脳をSSMに移し、続いて、培地を脳と共に摂氏25度で24時間インキュベートした。10マイクロリットルの5−エチニル−2'デオキシウリジンまたはEDUの10ミリモルストックを、990マイクロリットルのSSMと共に滅菌微量遠心チューブにピペットし、混合し、次いで、滅菌12ウェル培養トレイの1ウェルに1ミリリットルのEDU SSMをピペットする。SSMを含むウェルからEDU SSM溶液を含む新しいウェルに滅菌チップを有するマイクロピペットを用いて脳を移し、摂氏25度で1時間インキュベートする。次に、EDU標識された脳を、1ミリリットルの固定液を含む同じ培養トレイ内の別のウェルに移し、脳を20分間固定する。固定後、マイクロピペットを使用して脳を72ウェルのミニトレイウェルに素早く移します。10マイクロリットルのPBTで脳を3回すすぎ、それぞれ10分間3回の洗浄を繰り返し、脳が常に液体で覆われていることを確認してください。ピペット10マイクロリットルのブロッキング溶液を脳に。トレイを覆い、端の周りにパラフィルムのストリップで密封します。図は、インスリンおよび染色を用いてSSM中で培養して24時間後の大型EDU陽性およびデッドパン陽性神経芽細胞を示す。インスリンを含まないシュナイダーの培地で24時間後、孵化したばかりのオレゴンR野生型脳には、4つのキノコ体神経芽細胞と1つの腹側神経芽細胞以外に、大型のEDU陽性およびデッドパン陽性神経芽細胞はなかった。共焦点画像化の間、外植された脳組織の小〜大きめの穴のような損傷を有するいくつかの脳半球が時折観察された。穴の開いた脳は分析に使用されなかった。組織を注意深く解剖し、組織の損傷を避けるために優しくピペットをします。また、できるだけ無菌にし、あなたの文化を汚染しないようにしてください。培養培地は、異なる因子を加えることによって容易に操作することができるので、この技術は、外因性シグナル伝達および神経芽細胞静止入および退出に関する将来の仮説に対処するために使用することができる。

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JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、後期ショウジョウバエ蛹の脳からの初代神経培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、フラ-2を使用してカルシウム濃度の神経突起伸長とイメージングを示す。...

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このビデオはmidgastrulaステージショウジョウバエの胚からの一次ニューロン培養の準備を示しています。ライブ文化の景色は、重炭酸塩ベースの定義培地での生育の2日後に細胞を1めっき後の時間と分化した神経細胞を示す。神経細胞は電気的興奮性であり、シナプス結合を形成する。...

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このビデオは、ショウジョウバエの脳神経幹細胞の静止状態からの再活性化を開始する外因性因子を特定するためのプロトコルを示しています。孵化したばかりの幼虫を解剖して脳を分離し、その後、試験ホルモンの有無にかかわらず培地で培養して、神経幹細胞の再活性化と増殖を誘導するホルモンの可能性を評価します。...

培養ショウジョウバエ脳外植片における神経幹細胞の再活性化の解析

中枢神経系の再生および修復を調査するために、ショウジョウバエの幼虫腹神経索を用いた傷害のパラダイムが記載されている。意図的に開発されたソフトウェアと遺伝との定量的な分析と組み合わせタイムラプスおよび固定標本でレーザー走査共焦点顕微鏡法、続いて刺すことは中枢神経系の再生および修復の分子メカニズムを解明するために使用されます。...

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

このプロトコルは、無傷の幼虫の脳のコンテキストで生細胞イメージングを行うために使用合理化された方法を説明します。ライブセルイメージングのアプローチは、一貫して、以前に見落とされたメカニズムを暴く、非対称神経幹細胞分裂の研究だけでなく、他の神経と発達過程のための非常に貴重である。...

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経芽細胞

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。...

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

このプロトコルの目標は、前のヴィヴォ ショウジョウバエ幼虫の脳文化が長期的な蛍光タイムラプス...

単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

ここでは、としてショウジョウバエ感覚ニューロンの樹状分枝 (da) ニューロン損傷モデルは、体内を組み合わせたライブ イメージング、2...

再生に関する末梢および中枢神経系を研究するため生体内でショウジョウバエ損傷モデル

この記事では、成人 ショウジョウバエ...

ショウジョウバエ中枢脳における成人神経新生の刺激と分析

本稿では,ショウ ジョウバエ・メラノガスター 第3齢幼虫から生きた外植片脳を作製,解剖,マウント,画像化し,生理条件下での細胞内・細胞内動態を観察するワークフローについて述べる.

ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

学ぶショウジョウバエ脳外植培養における静止神経幹細胞の再活性化方法。インスリン含有培地を用いて神経芽細胞の増殖を誘導し、EDUラベリングで解析することで、細胞周期再進入の機構を解明し、幹細胞治療の発展に貢献する。

ショウジョウバエ脳外植における神経幹細胞の再活性化

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ショウ ジョウバエ 脳外植における神経幹細胞の再活性化

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