Name: 一過性発現システムを用いた哺乳類細胞における完全長ヒトハンチンチン変異体の効率的かつスケーラブルな生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぼう、HEK293細胞を用いた一過性発現システムによる完全長ヒトハンチンチン変異体の効率的な生産プロトコル。95%以上の高純度タンパク質を得る手法で、ハンチントン病研究の再現性を向上させます。

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HTTのMS分析を実施してくれたニューヨーク州立大学バッファロー校の薬学部に感謝します。この作業は、CHDI財団との共同作業でした。エリザベス・M・ドハティに特に感謝します。イグナシオ・ムニョス・サンフアン;ダグラスマクドナルド、CHDI財団;ロリー・カーティス、キュリア、この原稿の準備中の彼らの貴重な意見のために。また、ミケーレ・ルーチェ、ミスラ・マフモウディ、ステファニー・フォックスがこの研究活動を支援してくれたことに感謝しています。

<ol><li>Walker, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease.</a> Lancet. 369 (9557), 218-228 (2007).</li>
<li>McColgan, P., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+a+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: a clinical review.</a> European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).</li>
<li>Duyao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+repeat+length+instability+and+age+of+onset+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide repeat length instability and age of onset in Huntington's disease.</a> Nature Genetics. 4 (4), 387-392 (1993).</li>
<li>MacDonald, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
<li>Benn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+modulates+transcription%2C+occupies+gene+promoters+in+vivo%2C+and+binds+directly+to+DNA+in+a+polyglutamine-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Huntingtin modulates transcription, occupies gene promoters in vivo, and binds directly to DNA in a polyglutamine-dependent manner.</a> Journal of Neuroscience. 28 (42), 10720-10733 (2008).</li>
<li>Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The biology of huntingtin.</a> Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).</li>
<li>Davies, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+neuronal+intranuclear+inclusions+underlies+the+neurological+dysfunction+in+mice+transgenic+for+the+HD+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of neuronal intranuclear inclusions underlies the neurological dysfunction in mice transgenic for the HD mutation.</a> Cell. 90 (3), 537-548 (1997).</li>
<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Gutekunst, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+neuropil+aggregates+in+Huntington%27s+disease%3A+Relationship+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology.</a> Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).</li>
<li>Hodgson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+YAC+mouse+model+for+Huntington%27s+disease+with+full-length+mutant+huntingtin%2C+cytoplasmic+toxicity%2C+and+selective+striatal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration.</a> Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).</li>
<li>Hoffner, G., Djian, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregation+in+Huntington+disease%3A+does+structure+determine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregation in Huntington disease: does structure determine toxicity.</a> Molecular Neurobiology. 52 (3), 1297-1314 (2015).</li>
<li>Waldvogel, H. J., Kim, E. H., Tippett, L. J., Vonsattel, J. P. G., Faull, R. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Behavioral+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The neuropathology of Huntington's disease.</a> Current Topics in Behavioral Neurosciences. 22, 33-80 (2014).</li>
<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
<li>Hoop, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+exon+1+fibrils+feature+an+interdigitated+%CE%B2-hairpin-based+polyglutamine+core%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Seong, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2.</a> Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).</li>
<li>Li, W., Serpell, L. C., Carter, W. J., Rubinsztein, D. C., Huntington, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+characterization+of+full-length+human+huntingtin%2C+an+elongated+HEAT+repeat+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and characterization of full-length human huntingtin, an elongated HEAT repeat protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (23), 15916-15922 (2006).</li>
<li>Vijayvargia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin%27s+spherical+solenoid+structure+enables+polyglutamine+tract-dependent+modulation+of+its+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Huntingtin's spherical solenoid structure enables polyglutamine tract-dependent modulation of its structure and function.</a> eLife. 5, 11184(2016).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+production+in+human+cells+and+biochemical+characterization+of+full-length+normal+and+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Scalable production in human cells and biochemical characterization of full-length normal and mutant huntingtin.</a> PLoS ONE. 10 (3), 0121055(2015).</li>
<li>Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryo-electron+microscopy+structure+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cryo-electron microscopy structure of huntingtin.</a> Nature. 555 (7694), 117-120 (2018).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+mutant+and+wildtype+huntingtin+proteins+produced+from+a+toolkit+of+scalable+eukaryotic+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of mutant and wildtype huntingtin proteins produced from a toolkit of scalable eukaryotic expression systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (17), 6986-7001 (2019).</li>
<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP40+orchestrates+huntingtin+structure+for+1+differential+interaction+with+polyglutamine+2+expanded+exon+1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
<li>Colin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+phosphorylation+acts+as+a+molecular+switch+for+anterograde%2Fretrograde+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons.</a> EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).</li>
<li>Thompson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK+phosphorylates+Huntingtin+and+targets+it+for+degradation+by+the+proteasome+and+lysosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome.</a> Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).</li>
<li>Ratovitski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+%28PTMs%29%2C+identified+on+endogenous+Huntingtin%2C+cluster+within+proteolytic+domains+between+HEAT+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications (PTMs), identified on endogenous Huntingtin, cluster within proteolytic domains between HEAT repeats.</a> Journal of Proteome Research. 16 (8), 2692-2708 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+western+blot+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A defined methodology for reliable quantification of western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li>
<li>Tarazona, M. P., Saiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+SEC%2FMALS+experimental+procedures+and+theoretical+analysis+for+studying+the+solution+properties+of+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Combination of SEC/MALS experimental procedures and theoretical analysis for studying the solution properties of macromolecules.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 56 (1-3), 95-116 (2003).</li>
<li>Folta-Stogniew, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+states+of+proteins+determined+by+size-exclusion+chromatography+coupled+with+light+scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligomeric states of proteins determined by size-exclusion chromatography coupled with light scattering, absorbance, and refractive index detectors.</a> Methods in Molecular Biology. 328, Clifton, N.J. 97-112 (2006).</li>
<li>McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+indices+of+proteins+in+relation+to+amino+acid+composition+and+specific+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Kegel-Gleason, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+interactions+with+membrane+phospholipids%3A+Strategic+targets+for+therapeutic+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Huntington%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Huntingtin interactions with membrane phospholipids: Strategic targets for therapeutic intervention.</a> Journal of Huntington's Disease. 2 (3), 239-250 (2013).</li>
<li>Michalek, M., Salnikov, E. S., Werten, S., Bechinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+interactions+of+the+amphipathic+amino+terminus+of+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane interactions of the amphipathic amino terminus of huntingtin.</a> Biochemistry. 52 (5), 847-858 (2013).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Nissley, D. A., O'Brien, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+co-translational+processing+plays+a+role+in+huntington%27s+pathogenesis-A+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered co-translational processing plays a role in huntington's pathogenesis-A hypothesis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 54(2016).</li>
<li>Kumar, N., Gammell, P., Clynes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+control+strategies+to+improve+productivity+and+survival+during+CHO+based+production+culture%3A+A+summary+of+recent+methods+employed+and+the+effects+of+proliferation+control+in+product+secreting+CHO+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture: A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines.</a> Cytotechnology. 53 (1-3), 33-46 (2007).</li>
</ol>

著者は、この記事の内容と利益相反がないことを宣言します。

ここでは、イムノアッセイおよびMSアッセイ開発の標準物質、ウェスタンブロット解析のコントロール、および構造機能研究に使用するのに適した純度と均質性を備えた複数のFL HTTタンパク質コンストラクトを生成するための一過性トランスフェクション、発現、および精製方法について説明します。この一過性発現法はスケーラブルで汎用性が高く、ユーザーは、安定した細胞株または前述のウイルスベースの方法を使用するよりも効率的に低ミリグラム量のFL HTT変異体を生成することができます21、22、23、24。通常、プラスミドが構築されると、一過性発現法を使用して、2 Lスケールのタンパク質生産から2〜5 mgの高度に精製されたFL HTTを1週間未満で生成でき、細胞培養1リットルあたり1〜2.5 mgのFL HTTの典型的な収量が得られます。
ここで説明する一過性発現法は、細胞株の樹立に要する時間が長いことや、安定した細胞株の保存・維持の難しさなど、安定した細胞株発現における多くの障害を克服します。また、PEIは市場に出回っている他のトランスフェクション試薬と比較して比較的安価であるため、大規模なトランスフェクションを経済的に実行可能です。トランスフェクションの効率は、プラスミドの品質、最適な細胞増殖、およびPEIの保存と調製の程度に大きく依存します。オペレーターは、タンパク質収量の大幅な低下を回避するために、これらの重要なステップで特別な注意を払い、品質管理を実行する必要があります。プロトコルで使用される抗FLAG樹脂も比較的高価であり、数回の精製および再生後にFL HTTの捕捉が減少しています。一部の研究者は、親和性樹脂のより堅牢な再生を可能にするために、別のタグに切り替える方が実用的であると感じるかもしれません。
FL HTT発現レベルを最適化するために、様々な細胞株および発現条件を試験した。HEK293細胞は、タンパク質の発現が高く、浮遊培養フォーマットでの取り扱いが容易であるため、FL HTTの発現に選択され、シェーカーまたはバイオリアクターでの大規模発現に適しています。通常の温度である37°Cを使用するのではなく、32°Cなどの低い培養温度でより高いFL HTTタンパク質発現レベルを達成できます。 温度が低いとタンパク質合成が遅くなり、FL HTT40の正しい折り畳みが促進される可能性があります。ただし、この現象は、FL HTTまたはテストされた細胞株に特異的ではありません。トランスフェクション後の温度の低下は、CHO細胞における医薬品タンパク質発現に広く使用されています。メカニズムは完全には理解されていませんが、低温はG1期の細胞周期を停止させ、細胞エネルギーをタンパク質産生に向けると考えられています41。
哺乳動物細胞から精製された全長HTTは、シャペロンHsp7024と共溶出し、かつMg−ATP洗浄ステップにより、Hsp70タンパク質を除去することができる。興味深いことに、共溶出したHsp70は、昆虫細胞発現系21、22、23から精製されたFL HTTでは観察されない。これは、哺乳類細胞および昆虫細胞におけるFL HTTの過剰発現に対するFL HTTまたは熱ショックタンパク質応答のPTMの違いを反映している可能性があります。組換えタンパク質からHsp70が除去されたら、FL HTTの単量体形態を安定化させるために、CHAPSやDDMなどの非イオン性界面活性剤が必要です。
FL HTT変異体のオリゴマー化状態は、Blue Native PAGEおよびSEC-MALSを用いて解析した。二量体および高次オリゴマーHTTのごく一部は、Blue Native PAGEまたはSEC-MALSのいずれかで分析した場合に存在していました。注目すべきことに、FL HTTによって形成される高次オリゴマーはpolyQ長と相関していないようであり、Exon1欠失変異体でさえ同様のオリゴマー-二量体-モノマー比を示します。これらのコンストラクト間のオリゴマー含有量の実際の変動は、各バッチの製造および取り扱いにおけるわずかな違いによるものと考えられる。HTT Exon140,41によって形成された凝集体およびフィブリルとは対照的に、FL HTTの高次オリゴマーは可溶性のままであり、SECおよびNative PAGEによって分析することができた。
精製されたモノマーFL HTTは比較的安定です。4°Cでの長期保存、室温での短時間のインキュベーション、または1 mg/mLの濃度>、これらの条件下で目に見える沈殿が観察されなくても、単量体FL HTTはすべて二量体および高次オリゴマー型に変換されます。≤1 mg/mLに維持された精製モノマーFL HTTは、前述のように、保存バッファー(50 mM Tris、pH 8.0、500 mM NaCl、5% v/vグリセロール、0.5% w/v CHAPS、および5 mM DTT)中で-80°Cで比較的安定なままでした24。この方法で調製および保存されたFL HTTの最大6回の凍結融解サイクルは、タンパク質の目に見える沈殿を引き起こしませんでしたが、SEC-MALSによってより高いオリゴマー状態へのわずかなシフトが観察されました(補足図S2)。サンプルは、凍結融解サイクルを繰り返した後、SDS PAGEによっても分析されました。目に見える沈殿物は観察されませんでした。SDS-PAGEでは凝集体や追加の分解生成物は見られませんでした(補足図S3)。精製されたFL HTTの長期安定性はまだ調査中です。決定的な長期データがない場合は、精製したFL HTTを-80°Cで6か月以内に保存することをお勧めします。
高品質の組換えFL HTTタンパク質変異体とその製造方法は、HD研究コミュニティから高い需要があります。これらのタンパク質は、イムノアッセイおよびMS分析標準として、構造研究において、ならびに新規FL HTT特異的アッセイの開発に使用されています。ここで説明する大規模な一過性発現法は、>95%の純度でミリグラム量のFL HTTバリアントを一貫して生成し、HTT研究に不可欠なツールを提供します。HD研究を支援するために、数十ミリグラムの高度に精製されたFL HTT polyQバリアントおよびその他の変異体の産生が日常的になっています。

ハンチントン病(HD)は、主に不安定で不随意の運動運動、ならびに人格変化や無関心などの認知的および精神的変化を特徴とするまれな神経変性疾患です1,2。HDは、ハンチンチン遺伝子(HTT)のエクソン1に位置するCAGリピート路の35リピートへの拡大と関連しており、CAGリピートの数が多いほど、疾患の早期発症と相関しています3,4。HTTの翻訳産物であるハンチンチンタンパク質(HTT)は、ニューロンの生存率と脳の発達に関与しています5,6,7,8,9。
HTTは、幅広い細胞プロセス、小胞輸送、細胞分裂、繊毛形成、およびオートファジーに関与すると報告されている足場タンパク質です10,11。しかし、HDの分子病因は完全には明らかではなく、polyQ拡張mHTTの病理学的影響を媒介する主要なタンパク質相互作用因子の同定は不足しています。いくつかの研究は、HTT凝集体がHD患者および疾患の動物モデルのニューロンおよびグリアで同定されているため、拡張HTTタンパク質のオリゴマー化傾向によって引き起こされるmHTTからの毒性機能の獲得を示唆しています12,13,14,15,16,17.FL HTTおよびmHTTバリアントの機能と構造の調査を促進し、アッセイ開発のための高品質のタンパク質標準を研究者に提供するには、均一組換えタンパク質の堅牢でスケーラブルな供給が必要です。
FL HTTは、そのサイズ(aa 1-3,144、polyQ長Q23に基づくナンバリング)、タンパク質分解不安定性、および凝集傾向により、可溶性タンパク質として発現および単離することが困難であることが証明されています。これまで、HTTのエクソン1領域(aa2-90)は、大腸菌18,19,20におけるタンパク質の溶解度を高めることができる様々なタグを用いて大規模に発現および精製されてきた。FL HTTは、バキュロウイルス21,22を用いた昆虫細胞発現系で最初に発現および精製され、化学的に架橋されたFL Q23-HTTおよびQ78-HTTの低分解能30 Å電子顕微鏡(EM)構造が報告されました23。HTT構造の調査は、天然の翻訳後修飾(PTM)を有するFL Q17、Q46、およびQ128-HTTの生産が、安定した細胞株またはアデノウイルス発現系を用いてヒト細胞において達成されたときにさらに進んだ24。これらの研究は、精製HTTは主に単量体状態で存在するが、高次のオリゴマーおよび凝集体を形成する傾向があることを示唆している。
高度に拡張されたpolyQ領域を有するFL Q128-HTTの分析超遠心分離は、非拡張polyQ領域を有するタンパク質よりも多くのオリゴマーおよび凝集画分を得た24。安定した細胞株を用いて、相互作用パートナーHAP40との共発現によってFL HTTを安定化させる戦略が成功裏に採用されている。FL HTTおよびHAP40複合体のクライオEM構造は、精製タンパク質複合体(PDB:6EZ8)を用いて平均4 Åの分解能で解かれています25。この共発現戦略は、バキュロウイルス系に首尾よく適合されており、異なるpolyQ長を有する一連の高品質HTT変異体が、昆虫細胞から発現および精製されている26。それ以来、可変polyQ長とHAP40およびより高い分解能構造を有するHTTの複合体のより多くのクライオEM構造が解明され、タンパク質データベース27,28(PDB:7DXK、7DXH、6X9O)に寄託された。
FL HTTの迅速な一過性発現のために、ポリエチレンイミン(PEI)を使用してHEK293細胞でのトランスフェクションおよび発現方法を最適化しました。原理の証明として、23個のグルタミンを含むFL HTT変異体(FL Q23−HTT)を最初に精製し、前述の精製方法の改変を用いて特徴付けた24。この一過性トランスフェクション法は、便利で、非常に効率的で、スケーラブルです。1〜2 mg/Lの収率で精製HTTを生産でき、これは報告されている安定細胞株法に匹敵します24。タンパク質はヒト細胞株で産生されるため、質量分析プロテオミクス分析に供すると、産生されるHTTは天然のヒトPTMを有する可能性が高くなります11、29、30、31。FL HTTのFL Q48-HTT、FL Q73-HTT、およびexon1-欠失(ΔExon1-HTT)変異体のミリグラム量が作製され、一過性発現法が、生産のための安定した細胞株を確立するために必要な時間のかかる労力に依存することなく、HTTの代替変異体を迅速に生産するのに特に有用であることを実証しました。
以下のプロトコルは、2 L細胞培養からFL Q23-HTTを産生するために、細胞培養、トランスフェクション、タンパク質精製、および精製後のタンパク質特性評価のためにこれらの著者の研究室で使用されている標準的な方法を例示しています。このプロトコルは、より大きな培養物にスケールアップすることも、他のHTT変異体を精製するように適合させることもできます。FL HTTの最大10 L細胞培養、およびHTTおよびHTTホモログのさまざまな部位または切断変異が、同じプロトコルを使用して実験室で正常に実行されています。精製されたFL HTTには、ダイマーや高次オリゴマーとともに高い割合のモノマーが含まれています。生成されたバリアント(Q23、Q48、Q73、および削除されたExon1)間で同じ凝集プロファイルが観察されます。適切な注意を払わないと凝集が起こる可能性があるため、製剤および凍結融解安定性試験を実施して、タンパク質の取り扱いに最適な条件を特定しました。ブルーネイティブページやSEC/MALS-RIなどの方法も、品質管理プロセスの一環としてHTTオリゴマー含有量を分析するために説明されています。HD研究コミュニティに利益をもたらすために、この研究に記載されているプラスミドとHTTタンパク質は、コリエル研究所(www.coriell.org/1/CHDI)のHDコミュニティリポジトリにも登録されています。

<table><tbody><tr><td>100 kDa コンセントレータ - Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>プロトコル セクション番号-6.2.4</td></tr><tr><td>20x blue ネイティブ PAGE ランニング バッファー</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td>プロトコル セクション番号-8.1</td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>プロトコル セクション番号-5.1</td></tr><tr><td>4x blue ネイティブ PAGE サンプルバッファー</td><td>Invitrogen</td><td>BN2003</td><td>プロトコル セクション番号-8.3</td></tr><tr><td>4x LDS ローディングバッファー</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>プロトコルセクション番号-5.3</td></tr><tr><td>5 L 三角フラスコ</td><td>コーニング</td><td>431685</td><td>プロトコルセクション番号-4.2</td></tr><tr><td>アガロースゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>プロトコルセクション番号-2.2</td></tr><tr><td>凝集防止剤</td><td>サーモフィッシャー</td><td>0010057AE</td><td>プロトコルセクション番号-4.8</td></tr><tr><td>抗FLAG M2アフィニティーゲル</td><td>シグマ</td><td>A2220</td><td>プロトコルセクション番号-6.1.1</td></tr>アンチ<tr><td>フラグM2</td>シ<td>グマ</td><td>F3165</td><td>プロトコルセクション番号-5.7</td></tr>アンチ<tr><td>フォームエクセルアンチフォーム</td><td>シグマ</td><td>59920C-1B</td><td>プロトコルセクション番号-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>シグマ</td><td>A6419</td>プロトコル<td>セクション番号-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450秒</td><td>ウォーターズ</td><td>186006851</td><td>2.5 & マイクロ;m x 4.6 mm x 150 mm プロトコルセクション番号-7.3</td></tr><tr><td>青いネイティブ PAGE 5% G-250 サンプル添加</td>物 <td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>プロトコルセクション番号-8.3</td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10177012</td><td>プロトコルセクション番号-2.5</td></tr><tr><td>遠心分離機 - Sorvall Lynx 6000</td><td>サーモフィッシャー</td><td>75006590</td><td>プロトコルセクション番号-6.1.3</td></tr><tr><td>セルカウンター - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>プロトコルセクション番号-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>プロトコルセクション番号-6.1.4.6</td></tr><tr><td>コンピテント大腸菌細胞-TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td>プロトコルセクション番号-2.4</td></tr><tr><td>ジギトニン</td><td>シグマ</td><td>D141</td>プロトコル<td>セクション番号-5.1</td></tr><tr><td>差示差屈折率検出器</td><td>ワイアット</td><td></td><td>プロトコルセクション番号-7.1</td></tr><tr><td>DYKDDDDKのペプチッド</td><td>Genscript</td><td></td><td>のペプチッドの統合サービス プロトコルのセクション番号6.1.4.6</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>のシグマ</td><td>EDS</td><td>のプロトコルのセクション番号5.1</td></tr><tr><td>EndoFreeプラスミドギガのキット</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>プロトコルのセクション番号3.3</td></tr><tr><td>エンドトキシンの自由な水</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>プロトコルセクション番号4.1</td></tr><tr><td>エンドトキシン定量キット-CRL Endosafe Nexgen-PTS検出システム</td><td>チャールズリバー</td><td>PTS150K</td><td>プロトコルセクション番号-3.4</td></tr><tr><td>固定角度ローター A23-6x100ローター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>75003006</td><td>プロトコルセクション番号-6.1.3</td></tr><tr><td>FPLCソフトウェア-ユニコーン 6.2</td><td>Cytiva</td><td></td><td>プロトコルセクション番号-6.1.4</td></tr><tr><td>遺伝子合成</td><td>Genscript</td><td></td><td>遺伝子合成サービス プロトコルセクション番号-1.2</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック グリセロール (認定ACS)</td> <td>G33-4</td><td>プロトコルセクション番号-5.6</td></tr><tr><td>成長培地-Expi293 発現培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A1435102</td><td>プロトコルセクション番号-4.2</td></tr><tr><td>HEK293細胞</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーR79007</td>プロトコル<td>セクション番号-4</td></tr><tr><td>高せん断ホモジナイザー - マイクロフルイダイザー</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>プロトコルセクション番号-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II バイオインサート HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>プロトコルセクション番号-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>LiCor</td><td></td><td>画像解析ソフトウェア プロトコルセクション番号-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>シグマ</td><td>MAB2166</td><td>プロトコルセクション番号-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td>EMD</td><td>のMAB2168</td><td>のプロトコルセクション番号5.7</td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>サンタクルス</td><td>SC-47757</td><td>プロトコルセクション番号5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>サンタクルス</td><td>SC-7757</td><td>プロトコルセクション番号5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td><td>シグマ</td><td>MAB5490</td><td>プロトコルセクション番号5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td><td>シグマ</td><td>MAB5492</td><td>プロトコルセクション番号5.7</td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>サンタクルス</td><td>SC-47759</td><td>プロトコルセクション番号-5.7</td></tr><tr><td>マルチアングル光散乱検出器</td><td>ワイアット</td><td></td><td>プロトコルセクション番号-7.1</td></tr><tr><td>NativeMark 未染色タンパク質標準</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>プロトコルセクション番号-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>プロトコルセクション番号-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0131S</td><td>利用可能なHi-Fiバージョン プロトコルセクション番号-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash;8% Tris acetate gels</td><td>Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>プロトコル セクション番号-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetate SDS ランニング バッファー</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>プロトコル セクション番号-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>プロトコル セクション番号-4.1</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15070063</td><td>プロトコル セクション番号-4.2</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>プロトコルセクション番号-4.5</td></tr><tr><td>プラスミドミニプレップキット</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>プロトコルセクション番号-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0560S</td><td>プロトコルセクション番号-2.2</td></tr><tr><td>プレキャスト Bis-tris gel- 3-12% NativePAGE Novex Bis-tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003BOX</td><td>プロトコルセクション番号-8.4</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td>プロトコル<td>セクション番号-5.1</td></tr><tr><td>SEC-MALS分析ソフトウェア-アストラ7</td>ワイ<td>アットテクノロジー</td><td></td><td>プロトコルセクション番号-7.6</td></tr><tr><td>二次抗体-IRdye 800 CWヤギ抗マウスIgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210</td>プロトコル<td>セクション番号-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>プロトコルセクション番号-6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>プロトコルセクション番号 5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AAJ20605AP</td><td>プロトコルセクション番号 6.1.1</td></tr><tr><td>UV 分光計 - Nanodrop 8000</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ND-8000-GL</td><td>プロトコルセクション番号 2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td><td>Cytiva</td><td>28988951</td><td>プロトコルセクション番号 6.1.1</td></tr></tbody></table>

一過性発現システムを用いた哺乳類細胞における完全長ヒトハンチンチン変異体の効率的かつスケーラブルな生産

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

全長ハンチンチン(FL HTT)は、質量約350 kDaの大きな(aa 1-3,144)遍在的に発現するポリグルタミン(polyQ)含有タンパク質です。FL HTTの細胞機能は完全には理解されていませんが、~36回以上のpolyQ路の変異体拡張はハンチントン病(HD)と関連しており、polyQ長は発症年齢とほぼ相関しています。変異型HTT(mHTT)の機能に対する構造の影響をよりよく理解するためには、大量のタンパク質が必要です。哺乳動物細胞におけるFL HTTのサブミリグラム産生は、ドキシサイクリン誘導性の安定細胞株発現を用いて達成された。しかし、安定な細胞株からのタンパク質生産には、一過性トランスフェクション法で克服できる限界があります。 
この論文は、ポリエチレンイミン(PEI)を用いた一過性トランスフェクションによるコドン最適化プラスミドからのFL HTTおよびその変異体の低ミリグラム量生産のための堅牢な方法を提示します。この方法はスケーラブル(>10 mg)で、高度に精製されたFL HTTの細胞培養液を一貫して1〜2 mg/L得られます。以前の報告と一致して、FL HTTの精製溶液状態は非常に動的であることがわかりました。このタンパク質は、二量体および高次オリゴマーを形成する傾向がある。オリゴマー形成を遅らせる鍵は、サイズ排除クロマトグラフィー中に二量体および高次オリゴマー画分から単量体画分を迅速に分離することです。 
多角度光散乱を用いたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC-MALS)を使用して、精製HTTの二量体および高次オリゴマー含有量を分析しました。FL HTT polyQ長(Q23、Q48、およびQ73)とオリゴマー含有量の間に相関は観察されなかった。exon1欠失コンストラクト(aa 91-3,144)は、FL HTT(aa 1-3,144)と同等のオリゴマー化傾向を示した。SEC/MALS屈折率(RI)、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、ウェスタンブロット、ネイティブPAGE、およびブルーネイティブPAGEによる製造、精製、および特性評価の方法を本明細書に記載します。

HEK293細胞における完全長ヒトハンチンチンタンパク質変異体のコンストラクトデザイン、一過性トランスフェクション、発現および精製をカバーするスケーラブルなプロトコルを提供しています。

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

このプロトコルは、低ミリグラムスケールで全長のハンチンギン変異体を製造するために開発されました。これにより、HD研究者に不可欠な一貫した高品質のタンパク質が可能になります。手順を実演するのは、キュリア研究所の研究科学者であるマイケル・ハリスです。1グラムのポリエチレンイミン25 Kを1リットルのエンドトキシン自由水に加えることから始めて、よくかき混ぜます。100ミリモルの塩酸を使用してpHを2.0に調整し、すべてのポリエチレンイミンが溶解するまで攪拌します。次に、100ミリモルの水酸化ナトリウム溶液を使用してpHを7.0に調整し、溶液を0.2マイクロメートルのフィルターに通します。ろ過した溶液のアリコートを作り、摂氏マイナス20度で保管します。ペニシリンストレプトマイシンを添加した増殖培地中のHEK293細胞を加湿シェーカーインキュベーター内で摂氏37度、90 RPM、5%二酸化炭素で18〜24時間増殖させます。トランスフェクションの前日に、5リットルの三角フラスコ内の2リットルの増殖培地で細胞を1ミリリットルあたり約1.2 x 10の密度で6乗に希釈し、18〜24時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、製造元の指示に従って、自動セルカウンターを使用して細胞密度と生存率を測定します。トランスフェクションに必要なポリエチレンイミンとプラスミドの量を計算した後、ポリエチレンイミンとプラスミドを個別に100ミリリットルのPBSで希釈し、室温で5分間インキュベートします。次に、希釈したプラスミドとポリエチレンイミンを穏やかに旋回させて混合し、混合物を室温で30分間インキュベートします。混合物を細胞培養物に加え、穏やかに旋回させて混合する。次に、細胞を24時間増殖させます。翌日、酪酸ナトリウム溶液を2ミリモルの凝集防止および消泡剤の最終濃度に1:1, 000の容量比で加え、加湿シェーカーインキュベーター内で細胞を48時間インキュベートします。細胞の生存率と密度を測定した後、2, 000 Gで30分間遠心分離して細胞を回収し、精製前に細胞ペレットをマイナス80°Cで保存します。FPLCを用いた抗FLAG精製は、バッファーAを用いて12〜25ミリリットルのアンチフラッグ樹脂を毎分4ミリリットルの流量で空のカラムに充填し、プランジャーの高さを調整してプランジャーの端と樹脂床の間の隙間を取り除きます。次に、解凍した細胞ペレットを冷溶解バッファーに懸濁し、細胞懸濁液を1,000ポンド/平方インチの圧力で高剪断ホモジナイザーに1回通します。互換性のある固定角度ローターを備えた遠心分離機を使用して、20, 000 Gで1時間溶解液を清澄化します。メソッドウィンドウでFPLCをプログラムし、サンプルポンプを介して清澄化されたライセートをロードし、テキスト原稿に記載されているように、目的のカラム容量のバッファーA、B、C、D、および溶出バッファーでカラムを洗浄します。実行が終了したら、SDS-PAGEを使用して10マイクロリットルのピークフラクションを分析します。ピーク画分を目的の純度と組み合わせ、SDS-PAGE分析のために約50マイクロリットルの溶出液を節約します。FPLCを使用してSECカラムの平衡化を開始し、50ミリリットルのスーパーループを介してアンチフラッグ溶出液をロードします。SECバッファを実行した後、SEC分離を摂氏4度で一晩行います。溶出プロファイルを標準のHTT溶出プロファイルと比較して、モノマー、二量体、および高次オリゴマーピークを区別します。SECカラムの溶出プロファイルに基づいて単量体HTT画分をプールし、必要に応じて、高次オリゴマーおよび二量体HTT画分を別々にプールします。プールされたHTTタンパク質を、摂氏4度で100キロダルトンの遠心濃縮器を使用して濃縮します。タンパク質濃度を計算した後、精製HTTタンパク質を100マイクロリットル未満をクライオセーフマイクロ遠心チューブに分注します。液体窒素を使用してアリコートを瞬間凍結し、摂氏マイナス80度で保管します。UV検出器、マルチアングル光散乱検出器、示差屈折率検出器と組み合わせて、HPLCシステムで摂氏4度ですべての分析SEC-MALSを実行し、HTTの屈折率増分として0.185を使用します。ろ過されたHPLCグレードの水でポンプと検出器をパージし、UHPLCカラムをシステムに接続します。すべての検出器信号がベースラインに達するまで、カラムをろ過水で平衡化してからSEC-MALSバッファーで平衡化します。2マイクロリットルのBSA溶液を毎分0.3ミリリットルの流速で15分間注入します。BSA プロファイルに基づいてデータ品質を検査し、正規化、ピークアライメント、およびバンド拡大補正を実行し、次の HTT サンプル実行のテンプレートを作成します。フロートを使用して、室温の水浴中でFL Q23-HTTサンプルのバイアルを素早く解凍します。HTTを0.1マイクロメートルのスピンフィルターでろ過します。2〜4マイクロリットルのHTTサンプルを注入し、毎分0.3ミリリットルの流速で摂氏4度で15分間実行します。付属のソフトウェアを使用してクロマトグラフィーおよび光散乱データを分析し、Zimmプロットを生成して、各ピークの重量平均分子量を決定します。本研究では、2段階のカラムプロセスを使用して、HTTの純度が95%を超え、主要な汚染物質はシャペロンHsp70であり、抗FLAGアフィニティー精製ステップ中に塩化マグネシウムとATPによる広範な洗浄によって除去されました。 FL HTTの過剰発現はタンパク質の断片化を引き起こす可能性がありますが、正しい分子量350キロダルトンの単一バンドとして分離された方法で生成されたFL Q23-HTTは、フラグメンテーション。抗体とFL Q23-HTTとの反応後のウェスタンブロット分析は、追加のフラグメント関連バンドが観察されなかったため、有意な検出可能な切り捨てなしにタンパク質が単離されたことを示しました。FL HTTポリQ長分散、Q23、Q48、およびQ73は、ウェスタンブロットで予想どおりに反応し、ポリQ指向モノクローナル抗体MW1に対して漸進的に強いシグナルを示し、Q長の増加と相関しました。テストしたHPLCカラムの中で、SECカラムはHTTモノマーとダイマーの間で十分な分離能を示し、モル質量を区別できました。SECの精製FL HTTは、オリゴマー化状態に対応する複数のバンドを示しましたが、これは、ゲル内の移動中に高次オリゴマーの形成に寄与するいくつかの疎水性パッチの存在による可能性があります。精製HTTは、青色のネイティブPAGE上に、推定分子量643、927、および1, 070キロダルトンの3つの主要なバンドを示し、それぞれHTTの単量体、二量体、および三量体種を表す可能性が高い。精製されたハンチンチンの適切な取り扱いは、可溶性凝集体中に高次オリゴマーを生成することを避けるために不可欠です。エンドユーザーは、瞬間凍結する前に、サンプルを事前に冷却されたチューブに分注するために迅速に作業することが不可欠です。長期安定性試験は、摂氏マイナス80度で長期間保管されたサンプルに対して実行できます。HPLC SEC-MALS分析を繰り返すと、サンプルのモノマー含有量に変化があったかどうかを確認します。

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