Name: グラム陽性細菌増殖の小分子阻害剤であるマサリマイシンの合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶグラム陽性菌の細胞壁分解を標的とするマサリマイシンの合成プロトコル。Bacillus subtilisとStreptococcus pneumoniaeを用いたシナジーアッセイや形態学的研究への応用を解説する。

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研究は、助成金番号2009522の下で国立科学財団によって支援されました。マサリマイシンのNMR分析は、米国国立科学財団の助成金番号1919644の下で主要な研究機器プログラム賞によって支援されました。この資料で表明された意見、所見、結論、または勧告は著者のものであり、必ずしも国立科学財団の見解を反映するものではありません。

1. 一般的な方法
注:すべての化合物は標準的な供給業者から購入され、それ以上の精製なしで使用されました。
<ol><li>シリカゲルXG F254でプレコートしたアルミニウム板上で薄層クロマトグラフィー(TLC)を行う。UVランプの下、 p-アニスアルデヒド染色剤に浸漬するか、I2 蒸気にさらすことによってスポットを検出します。</li>
	<li>すべての核磁気共鳴(NMR)スペクトルを400MHz分光器に記録します。 注:1H−NMRおよび13C−NMRスペクトルは、残留溶媒ピークを参照した。 結合定数は [Hz] で、化学シフトは [ppm] で表されます。</li>
	<li>マサリマイシンの大気圧化学イオン化(APCI)質量分析スペクトルを、大気固体分析プローブを備えたコンパクトな質量分析計に記録します。</li>
</ol>2. マサリマイシンの調製のための一般的な手順
メモ:ヒュームフードで以下の手順を実行します。
<ol><li>各反応物のメタノール中の0.1 M溶液を調製する:シクロヘキシルアミン、シクロヘキシルカルボキシアルデヒド、 o-ヨード安息香酸、およびシクロヘキシルイソシアニド35。 警告: シクロヘキシルアミン、シクロヘキシルイソシアニド、シクロヘキシルカルボキシアルデヒドは可燃性です。それらは皮膚腐食を引き起こし、経口、皮膚、呼吸器、または生殖毒性を誘発する可能性がある。コンパウンドは、裸火、高温の表面、および発火源から遠ざけてください。適切な皮膚と目の保護具を着用し、換気の良い場所で作業し、蒸気や霧の吸入を避けてください。保管のために、ボトルをしっかりと閉じたままにし、涼しく乾燥した場所に保管してください。シクロヘキシルカルボキシアルデヒドをN2 雰囲気下のデシケーターに保存する。</li>
	<li>キャップ付き丸底フラスコに5 mLのシクロヘキシルアミン(メタノール中0.1 M溶液)と5 mLのシクロヘキシルカルボキシアルデヒド(メタノール中0.1 M溶液)を混合し、マグネチックスターラーバーを用いて溶液を撹拌/ホットプレート上で砂浴中で40°Cで30分間撹拌する。砂面から約1cm下に設置した温度計で温度を監視します。</li>
	<li>30分後、ステップ2.2の溶液に5 mLのシクロヘキシルイソシアン化物(メタノール中の0.1 M溶液)を加え、50°Cでさらに20分間撹拌する。 最後に、反応混合物に5 mLの ヨード安息香酸(メタノール中の0.1 M溶液)を加え、55°Cで3〜5時間撹拌し続ける。</li>
	<li>上記の反応混合物が3時間撹拌された後の約1時間ごとにTLCにより反応の進行を定期的にモニターする。</li>
	<li>アルミニウムで裏打ちされたTLCプレートの3 cm x 6 cmのストリップを切り取ります。#2の鉛筆を使って、下から約1cmの線を描きます。ガラスマイクロキャピラリーを使用して、約5μLの反応混合物をTLCプレート上にスポットし、乾燥させる。</li>
	<li>150 mLビーカーに、ビーカーの底を覆うのに十分な移動相(90:10ヘキサン:イソプロパノール)を加えます。一対のピンセットを使用して、上記のTLCプレートをビーカーに慎重に置き、TLCプレートが移動相に均等に入るようにします。ビーカーの上部をブリキの破片で覆います。 メモ:移動相がラインと斑点のあるサンプルを覆っていないことを確認します。</li>
	<li>移動相がTLCプレートの上方を上り、プレートの上部から約1cm下になるまで移動させます。TLCプレートを取り出し、鉛筆を用いて、移動相が移動した距離を示す線を引く。TLCプレートをヒュームフードで乾かします。</li>
	<li>乾燥したら、TLCプレートを少量の固体I2 を入れたビーカーに入れ、ビーカーを錫箔で覆う。TLCの黄色/茶色の斑点の発生を監視します。開発したら、TLCプレートを取り外し、鉛筆を使用してスポットの位置に印を付けます(補足図1)。 注:I2 つのスポットがマークされていない場合、汚れは時間の経過とともに消えます。スポットは、UV光、 p-アニスアルデヒド染色、または過マンガン酸カリウム染色によってTLCプレート上に視覚化することもできます( 補足情報を参照)。</li>
	<li>次の式を使用して、視覚化されたすべてのスポットの Rf 値を計算します。 Rf = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63191/63191eq01.jpg"></li>
	<li>TLCプレート上にRf =0.3のスポットが1つだけ見えるときに反応が完了したと考えてください。減圧下で回転式蒸発器で溶媒を除去し、粗生成物(黄褐色の油状物として得られる)を、すべてのメタノールが蒸発するまで高真空下で乾燥させた。</li>
	<li>乾燥粗生成物を30mLの酢酸エチルに溶解し、それを分液ロートに移す。酢酸エチルを1 M HCl(2 x 30 mL)、H2O(30 mL)、飽和NaHCO3溶液(2 x 30 mL)、H2O(30 mL)および飽和NaCl溶液(2 x30 mL)で順次抽出する。水層を捨てる。 注:酢酸エチル層は、各抽出の最上層です。各抽出について、酢酸エチルと水溶液(HCl、H2O、NaHCO3、またはNaCl)を含む分液ロートを激しく振って、層を完全に分離できるようにします。</li>
	<li>分液漏斗から酢酸エチル層を取り出し、三角フラスコに集める。Na2SO4(無水)をいっぱいにしたヘラを加え、酢酸エチルから残留水を除去した。 注:酢酸エチル溶液は、フラスコ内のNa2SO4が自由に動作し、凝集しない場合、乾燥しているとみなされる。Na2SO4が凝集している場合は、Na2SO4のヘラを追加添加することができる。</li>
	<li>乾燥した酢酸エチル溶液を#1ろ紙でろ過し、Na2SO4を除去した。ろ紙を少量の酢酸エチルで洗ってください。濾過した酢酸エチル溶液を丸底フラスコに入れ、減圧下で回転式エバポレーターで溶媒を除去し、酢酸エチルを全て除去したら油状物としてのマサリマイシンを得た。</li>
	<li>上記で得られたマサリマイシン油を最小量(1〜2mL)の9:1ヘキサン:イソプロパノールに溶解し、すべての化合物が溶解するまで磁気攪拌板上で攪拌する。</li>
	<li>溶解したマサリマイシンを12g順相シリカフラッシュカラムを用いたフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。<ol>
<li>フラッシュカラムを 10 カラム容量の移動相 (99:1 ヘキサン:イソプロパノール) で平衡化し、15 mL/minの流速に設定した装置を使用します。 メモ: 平衡化が完了したら、フローを停止し、カラムの上部をシステムから取り外します。</li>
		<li>溶解したマサリマイシンを5mLシリンジを用いて引き出す。シリンジを平衡化フラッシュカラムの上部に直接接続し、溶液をカラムに注入する。装填したカラムをフラッシュクロマトグラフィーシステムに再接続し、グラジエント溶出を開始します。</li>
		<li>10:90の最終移動相濃度へのグラジエント溶出を用いてカラムからマサリマイシンを溶出するヘキサン:イソプロパノールを12カラム容量にわたって溶出する。230および254nmでの吸収 を介して マサリマイシンの溶出をモニターする。</li>
		<li>カラムから溶出した化合物を、フラクションあたり20mLの溶媒を収集するフラクションコレクターによって収集します。 注:フラッシュクロマトグラフィーシステムが利用できない場合、マサリマイシンの精製は、3:1(ヘキサン:酢酸エチル)移動相を有する重力シリカカラム を介して 行うことができる。マサリマイシンを含む画分は、同じ移動相を用いたTLCにより同定することができる。TLCスポットの可視化は、UV光、I2 蒸気、または過マンガン酸カリウム染色のいずれかを用いて行った。</li>
		<li>TLC(ステップ2.5-2.9)または大気固体分析プローブを備えたコンパクトな質量分析計上の質量分析によってマサリマイシンを含む画分を同定する。最終製品を真空下(約0.3mbar)で乾燥させます。 注:マサリマイシンは、反応に添加されるシクロヘキシルカルボキシアルデヒドのmmolに対して55%〜70%の収率で無色の油状または固体として日常的に得られる。精製マサリマイシンの質量を求め、下記式を用いて反応の理論収率を計算することにより、マサリマイシンの最終収率を計算する: % 収率 = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63191/63191eq02.jpg"> x 100%</li>
	</ol></li>
	<li>NMRによりマサリマイシンの構造を確認する。<ol>
<li>約10mgのマサリマイシンサンプルを0.5mLのCDCl3に溶解する。パスツールピペットを使用して、溶液を5mmNMRチューブに移し、チューブをキャップする。NMRチューブを分光器に入れます。</li>
		<li>メーカーの事前設定された実験を使用して、1 H および 13C NMR スペクトルを取得します。ケミカルシフト割り当ておよび代表的なスペクトルは、 補足図3〜4に示されている。</li>
	</ol></li>
	<li>マサリマイシンを乾燥またはDMSO(最終濃度25mM)に溶解して使用時まで-20°Cで保存する。</li>
</ol>3. マサリマイシンの調製のためのマイクロ波手順
<ol><li>シクロヘキシルアミン、シクロヘキシルカルボキシアルデヒド、シクロヘキシルイソシアン化物、およびo-ヨード安息香酸の0.6 M溶液をアセトニトリル中に調製する。</li>
	<li>攪拌子および10mLのアセトニトリルをガラスマイクロ波反応バイアルに加える。</li>
	<li>2 mL のシクロヘキシルアミン (アセトニトリル中 0.6 M)、2 mL のシクロヘキシルカルボキシアルデヒド (アセトニトリル中 0.6 M)、および 7 mL のアセトニトリルをバイアルに加える。</li>
	<li>マイクロ波反応バイアルをマイクロ波カルーセルに入れる。混合物を攪拌し、400Wの電力設定で50°Cで30分間加熱し、室温まで冷却する。</li>
	<li>2 mLのo-ヨード安息香酸(メタノール中0.6 M)および2 mLのシクロヘキシルイソシアン化物(アセトニトリル中0.6 M)をバイアルに加える。混合物を攪拌し、マイクロ波で100°Cに40分間400Wの電力設定で加熱し、室温まで冷却する。</li>
	<li>工程3.5終了後にI2 蒸気を用いてTLC(90:10ヘキサン:イソプロパノール)により反応の進行をモニターする。 注:TLCが反応が不完全であることを示している場合(すなわち、TLC上の複数のスポット)、反応バイアルをマイクロ波に戻し、ステップ3.5で説明したマイクロ波条件を設定する。</li>
	<li>反応が完了したら、溶液を100mLの丸底フラスコに注ぎ、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発乾固させる。</li>
	<li>上記のステップ2.6-2.16に従って、水性後処理、精製、およびマサリマイシンの特性評価を完了します。</li>
</ol>4. 相乗効果と拮抗作用アッセイ
<ol><li>肺 炎連鎖球菌R6 を、嫌気的条件下で37°Cで5%(v/v)ヒツジの血液を含むミューラーヒントン(MH)寒天プレート上で増殖させる。全ての実験において、OD600 が〜0.4になるまで嫌気的条件下で37°Cで5mLのMHブロス中で増殖させた第2継代細胞を使用する。</li>
	<li>被験者は、阻害剤マサリマイシンおよびオプトチンをそれぞれの溶媒中で連続1:2希釈し、得られた濃度を各阻害剤の最小阻害濃度(MIC)値に隣接させた。<ol>
<li>100μMの濃度に達するまで、ジメチルスルホキシド(DMSO)中のマサリマイシンの初期希釈を行う。この時点から、MHブロスでマサリマイシン希釈液を作る。市販のオプトチン( 材料表を参照)を滅菌MHブロスに溶解してオプトチンストック溶液(3.5mM)を調製する。 注:マサリマイシンストック溶液は、DMSO中で25mMで作製した。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌96ウェルマイクロタイタープレートに、各オプトチン希釈液の2μLアリコートをプレートの各列に加える。同じプレートに、各マサリマイシン希釈液の2 μLアリコートを各カラムに加え、プレート上にオプトチンおよびマサリマイシン濃度の配列を作成した(図2)。</li>
	<li>上記の阻害剤を含む各ウェルに滅菌MHブロス(93μL)を加える。マイクロタイタープレートに、ステップ4.1から5μLの培養液(OD600〜0.4 )を接種する。 注:96ウェルプレートの接種は、通常、嫌気性ワークステーション内の嫌気的条件下で行われる。ウェル内の最終容量は100μLです。</li>
	<li>嫌気的条件下で37°Cで18時間培養物を増殖させ、続いて0.01%(m/v)溶液のレサズリンナトリウム塩30 μLを添加した。プレートを室温で15分間インキュベートして、色の形成と安定化を可能にします。 注:レサズリン溶液は、化合物を蒸留水に溶解して調製され、4°Cで最大2週間保存することができる。</li>
	<li>プレートから濃度値を直接読み取り、細菌の増殖が観察されない最低の阻害剤濃度(青色)を[X](ステップ4.7.1参照)、すなわち、共薬剤の存在下での薬剤の最低阻害濃度として割り当てる。 注:正の細菌増殖は、ピンク色に変わるレサズリン色素によって井戸内で同定される。各薬物単独のMIC値は、(すなわち、共薬の非存在下で)各薬物を別々に有するレサズリンMICアッセイ35 を用いて同様の方法で決定される(補足図5)。 肺炎菌 のMICは、マサリマイシンおよびオプトチンについてそれぞれ7.8μMおよび15.85μMである。</li>
	<li>分画阻害濃度(FIC)およびFIC指数(FICI)は、以下の式を用いて求める。<ol>
<li>FIC= [X]/MIC x、ここで、[X](ステップ4.6から)は、共薬の存在下での薬物の最低阻害濃度であり、MICxは、補薬物の非存在下における薬物の最低阻害濃度である。</li>
		<li>FICI = FICマサリマイシン + FIC抗生物質 注:FIC I&lt;0.5=相乗的、0.5&lt;FICI&lt;1=相加的、1<fic i>、FICI&gt;4=拮抗的である。</fic></li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 形態学的研究
<ol><li>枯 草菌 11774 を 1.5 % バクト寒天を含むルリア・ベルタニ (LB) 寒天プレート (10 g/L トリプトン、5 g/L 酵母エキス、および 5 g/L NaCl) で 37 °C で栽培します。 全ての実験において、OD600 =1になるまで37°Cで5mLのLBブロス中で増殖させた第2継代細胞を使用する。 S.pneumoniaeをステップ4.1 と同じ方法で成長させる。</li>
	<li>枯草菌についてはOD600nm = 1、肺炎菌についてはOD600nm = 0.4で細胞培養密度を得た後、ピペットを用いてマサリマイシンを「処理」とラベル付けした培養チューブに添加し、終濃度3.8μM(枯草菌については0.75x MIC)、または5.85μM(肺炎菌については0.75x MIC)とする。「コントロール」とラベル付けした第2の培養チューブに、等量のDMSOを加える。</li>
	<li>B.subtilisの場合、サンプルを37°Cのインキュベーターに入れ、150rpmで振とうしながら90分間置く。肺炎菌の場合、嫌気性条件下で振盪することなく細胞をインキュベートする。</li>
	<li>90分後、培養液の1:10混合物(v/v)および固定緩衝液(20mM HEPES、1%ホルムアルデヒド(pH6.8))で培養物を4°Cで一晩化学的に固定する。固定が完了したら、ピペットを使用して10〜20μLのサンプルをガラス顕微鏡スライドに塗布し、風乾させます。ブンゼンバーナーを用いてスライドガラスを加熱して風乾試料を固定する。</li>
	<li>熱固定後、0.1%(m/v)メチレンブルー(20%(v/v)エタノール中の溶液)を100μL添加してサンプルを染色する。染色されたスライドを10分間インキュベートし、余分な色素をdH2Oで洗い流す。次いで、染色されたスライドをオーブン中で60°Cに15〜20分間穏やかに加熱し、細胞を共通の焦点面に連れて行く。</li>
	<li>染色された細胞の上に顕微鏡カバースリップを置くことによって染色されたサンプルを密封する。次いで、顕微鏡スライドセメントを用いて縁部を密封する。密封した顕微鏡スライドを顕微鏡ステージに置き、明視野顕微鏡を用いて100倍の倍率で画像に焦点を合わせます。</li>
	<li>顕微鏡スライドに液浸油を一滴置き、1000倍の倍率で視野を合わせます。顕微鏡に取り付けられたカメラとそれに関連するソフトウェアを使用して顕微鏡写真を取得します。ソフトウェアの自動ホワイトバランスと絞り設定を使用して画像を取得します。 メモ: または、オープンソースの ImageJ ソフトウェアを使用して画像を処理することもできます。</li>
</ol>

リード、C.W.は、マサリマイシンの特定の用途を含む知的財産を有する。

マサリマイシンは、枯草菌35および肺炎菌37増殖の単一微小モル静菌阻害剤である。枯草菌では、マサリマイシンがGlcNAcase LytG35を阻害することが示されているが、肺炎菌の細胞壁における正確な分子標的は同定されていない37。古典的な有機合成またはマイクロ波手順のいずれかを用いたマサリマイシンの合成は、阻害剤を良好な収率および高純度で提供する。マサリマイシンの収率が低いことは、典型的にはシクロヘキシルカルボキシアルデヒドの酸化に起因し得る。これを克服するには、シクロヘキシルカルボキシアルデヒドをデシケーター内の不活性雰囲気下で保存することが推奨される。アルデヒドから対応するカルボン酸への酸化は、ボトル内の白色固体として見ることができる。シクロヘキシルカルボキシアルデヒドを長期間保存せずに少量購入すると、この問題が大幅に軽減されます。
...

ペプチドグリカン(PG)は、グラム陽性およびグラム陰性細菌1,2の両方における細胞の形状および構造を描写する網目状のポリマーである。このヘテロポリマーは、β-(1,4)結合した交互のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基とN-アセチルムラミン酸(MurNAc)残基からなる骨格を有する短いペプチド3,4,5,6によって架橋されたアミノ糖のマトリックスである(図1)1。MurNAcのC-3ラクチル部分に結合しているのはステムペプチドである。PGの代謝は、細胞壁7、8に新しい物質を組み込むために、生合成および分解酵素の緊密に調整されたシステムを含む。PGの分解は、オートライシン9と総称する酵素によって行われ、さらに切断された結合の特異性に基づいて分類される。オートライシンは、細胞増殖、細胞分裂、運動性、PG成熟、走化性、タンパク質分泌、遺伝的能力、分化、および病原性を含む多くの細胞プロセスに関与する10,11。個々のオートライシンの特定の生物学的機能を解明することは、部分的には機能的な冗長性のために、困難な場合があります。しかし、最近の生物物理学的研究8,12,13および計算研究12は、PG代謝におけるそれらの役割についての新しい洞察を提供している。加えて、最近の報告は、PG代謝における合成14および膜媒介性15、16、17ステップについてのさらなる洞察を提供している。PG代謝の分解経路と合成経路の関係を徹底的に理解することは、これまで未開発の抗生物質標的を生じさせる可能性がある。
真核生物の糖生物学を研究するための方法論には著しい進歩があったが、細菌の糖生物学、特にPG代謝は同様の速度で進歩していない。PG代謝を研究するための現在の化学的アプローチには、蛍光標識抗生物質18、蛍光プローブ19、20、および代謝標識21、22、23、24が含まれる。これらの新しいアプローチは、細菌の細胞壁代謝を調査する新しい方法を提供している。これらの戦略のいくつかはインビボでPGを標識することができるが、それらは種特異的であり得る19、または特定のオートライシン25を欠く株においてのみ働く。多くのPG標識戦略は、単離された細胞壁26またはインビトロで再構成されたPG生合成経路20、27、28と共に使用するためのものである。蛍光標識された抗生物質の使用は、現在、生合成ステップおよびトランスペプテーション18に限定されている。
細菌のオートライシンと細胞壁代謝におけるそれらの役割に関する現在の知識は、遺伝的およびインビトロ生化学的分析11、29、30、31、32から来ている。これらのアプローチは、この重要なクラスの酵素に関する豊富な情報を提供してきましたが、それらの生物学的役割を解読することは困難な場合があります。例えば、機能的冗長性33のために、ほとんどの場合、オートライシンの欠失は細菌増殖の停止をもたらさない。これは、細胞増殖および分裂におけるそれらの暗黙の役割にもかかわらず、7,12である。もう一つの合併症は、細菌性自己分解体の遺伝的欠失がメタ表現型を生じさせる可能性があることである34。メタ表現型は、遺伝的欠失の影響を受ける経路と他の相互接続された経路との間の複雑な相互作用から生じる。例えば、メタ表現型は、酵素の欠如などの直接的な効果、または調節因子の破壊などの間接的な効果を介して生じ得る。
現在、PGの分解を研究するための化学プローブとして使用できるN-アセチルグルコサミニダーゼ(GlcNAcase)およびN-アセチルムラミダーゼなどのグリコシダーゼ自己分解の阻害剤はごくわずかである。これに対処するために、ジアミドマサリマイシン(以前はfgkcと呼ばれていた)が同定され、GlcNAcase LytG32を標的とする枯草菌増殖の静菌阻害剤として35を特徴付けた(図1)。LytGは、外効性GlcNAcase36であり、グリコシル加水分解酵素ファミリー73(GH73)内のクラスター2のメンバーである。これは、栄養成長中の主要な活性GlcNAcaseである32。我々の知る限り、マサリマイシンは、細胞増殖を阻害するPG作用型GlcNAcaseの最初の阻害剤である。肺炎連鎖球菌を用いたマサリマイシンのさらなる研究は、マサリマイシンがこの生物における細胞壁代謝を阻害する可能性が高いことを見出した37。ここで、マサリマイシンの調製は、グラム陽性生物B.枯草菌、および肺炎菌における生理学を研究するためのケミカルバイオロジープローブとしての使用について報告されている。マサリマイシンによる最小阻害濃度以下の処理の形態学的解析、ならびに相乗効果/拮抗作用アッセイの例を提示する。明確に定義された作用機序を有する抗生物質を用いた相乗効果および拮抗作用アッセイは、細胞プロセス間の関連を探求する有用な方法であり得る38、39、40。

<table><tbody><tr><td>2-ヨード安息香酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I7675-25G</td><td>腐食性、刺激性、淡黄色からオレンジブラウンの粉末</td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>109827-4L</td><td>可燃性、刺激性、無色の液体</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>34851-4L</td>可燃性<td>、刺激性、無色の液体</td></tr><tr><td>アルミニウム裏打ちシリカプレート</td><td>Sorbtech</td><td>4434126</td><td>アルミニウム裏打ちプレート上のシリカゲルXGF254</td></tr>クロ<tr><td>ロホルム-d</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>151823-50GNMR</td><td></td></tr><tr><td>コンパクト質量分析計</td>用<td>溶媒Advion-Interchim</td><td>Advion CMS</td><td>コンパクト質量分析計APCIソースと大気固体分析プローブを装備-</td></tr><tr><td>Corning Costar 96ウェル平底プレート-相</td><td>乗効果/拮抗アッセイ用の</td>滅菌<td>フィッシャーケミカル</td><td>07-200-90</td></tr><tr><td>顕微鏡検査用</td>カバー<td>スリップフィ</td><td>ッシャーケミカル</td><td>12-547</td></tr>シ<tr><td>クロヘキサンカルボキシアルデヒド</td><td>CHEM-IMPEX INT'L INC.</td><td>24451</td><td>可燃性、刺激性、無色からピンク色の液体シ</td></tr><tr><td>クロヘキシルイソシアン化</td>物<td>SIGMA-ALDRICH</td><td>133302-5G</td><td>刺激性、無色の液体、非常に不快な臭い</td></tr>シ<tr><td>クロヘキシルアミン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>240648-100ML</td><td>腐食性、可燃性、刺激性、無色の液体 汚染されていない限り</td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>537446-4L</td><td>可燃性、刺激性、無色液体</td></tr><tr><td>フラッシュシリカカートリッジ(12g)</td>マサリマイシンホルムアルデヒドの<td>精製用フラッシュシリカカラム(12g)のAdvion-Interchim</td><td></td> <td>PF-50SIHP-F0012</td>パックフラッシュシリカカラム(12g)</tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F8775-25ML</td>顕微鏡<td>用固定剤</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H8651-25G</td><td>顕微鏡用固定液</td></tr><tr><td>ヘキサン、異性体混合物</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>の混合物178918-4L</td><td>環境に有害な、可燃性、刺激性、健康被害、無色の液体</td></tr><tr><td>高性能コンパクト質量分析計</td><td>Advion</td><td>表現</td><td>大気固体分析プローブ (ASAP)、低分解能</td></tr><tr><td>高 VAC</td><td>エッペンドルフ</td><td>真空 プラス</td><td>真空 遠心力と温度によって支援</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>258148-2.5L</td><td>腐食性、刺激性、無色の液体</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>320331-2.5L</td><td>強酸</td></tr><tr><td>浸漬油</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>12-365-19</td><td>顕微鏡用</td></tr><tr><td>ヨウ素、再昇華結晶</td><td>Alfa Aesar</td><td>41955</td><td>環境破壊、刺激性、健康被害、ダークグレー/パープル結晶</td></tr><tr><td>Mestre Mnova</td><td>MestreLab Research</td><td></td><td>NMRスペクトルを処理するためのソフトウェア</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>439193-4L</td><td>可燃性、毒性、健康被害、無色液体</td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M9140-25G</td><td>細胞壁を染色するための顕微鏡染色</td></tr><tr><td>meuller-hinton 寒天プレート+ 5% 羊 血液</td><td>フィッシャー</td><td>Streptococcus pneumoniae</td><td></td></tr><tr><td>meuller-hinton ブロスの</td>化学B21176X増殖培地肺<td>炎球菌用フィ</td><td>ッシャーケミカル</td><td>DF0757-17-6</td>成長培地</tr> 顕微鏡<tr><td>用スライド</td> 顕微鏡<td>用</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>22-310397</td></tr><tr><td>マイクロ波合成ラボステーション</td><td>合成</td>カルーセルNMRチューブを装備した<td>ヒュームフードの換気を必要とする</td>マイルストーン<td>スタートシンセ</td>デバイス</tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>Z562769-5EA</td><td>5mm NMRチューブ 600 MHz</td></tr><tr><td>核磁気共鳴(NMR)</td><td>ブルカー</td><td>Ascend 400</td><td>大型超伝導磁石(400MHz)</td></tr><tr><td>オプチン</td><td>フィッシャー化学</td><td>AAB21627MC</td><td>エチルヒドロクプレイン塩酸塩</td></tr><tr><td>ペトリープレート</td><td>細菌増殖のための寒天プレートを準備するための</td><td>セルトリー</td><td>ト229695</td></tr><tr><td>Primo Star ERc5sカメラ</td><td>付き Zeiss</td><td></td><td>形態学研究</td></tr><tr><td>puriFlash</td><td>interchim</td><td>XS520plus</td><td>フラッシュ クロマトグラフィー精製システム</td></tr><tr><td>resazurin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>R7017-1G</td><td>相乗効果/拮抗アッセイ用</td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター</td><td>Heidolph</td><td>Hei-VAP Value "The Collegiate"</td><td>溶剤蒸発器</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S6014-500G</td><td>刺激物、白</td></tr> B.subtilisの成長とLB媒体の調製のための粉末<tr><td>塩化ナトリウム</td>フィ<td>ッシャー化学</td><td>S271-1</td><td>結晶性、無色の</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5886-500G</td><td>B.subtilis</td></tr>の成長のための硫酸<tr><td>ナトリウム</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7985592-500G</td><td>無水、粒状、白色</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>フィッシャー化学BP1421-500</td><td></td><td>B.subtilisの成長のためのLBメディア</td></tr>ホイ<tr><td>ットニーDG250ワークステーション</td>の調製微生物<td>学インターナショナル</td><td>DG250</td><td>嫌気性ワークステーション。使用した嫌気性ガス混合物:5%水素、10%二酸化炭素、バランス窒素</td></tr><tr><td>酵母抽出</td><td>物フィッシャーケミカル</td><td>BP1422-500</td><td>B.subtilisの成長と</td></tr><tr>LBメディア<td>Zen Lite(青)ソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td></td>の調製 顕微鏡<td>写真を取得するための</td></tr></tbody></table>

グラム陽性細菌増殖の小分子阻害剤であるマサリマイシンの合成

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

細菌の細胞壁にあるペプチドグリカン(PG)は、形状、および周囲の環境からの保護を付与するユニークな高分子構造である。細胞の成長と分裂を理解する上で中心的なのは、PG分解が生合成と細胞壁アセンブリにどのように影響するかについての知識です。近年、修飾糖やアミノ酸の導入によるPGの代謝標識が報告されている。小分子阻害剤による生合成ステップの化学的尋問は可能であるが、オートライシンによるPG分解を研究するためのケミカルバイオロジーツールは未開発である。細菌性オートライシンは、PGの緊密に協調した分解に関与する幅広いクラスの酵素である。ここでは、枯 草菌 におけるN-アセチルグルコサミニダーゼLytGの阻害剤である小分子プローブ、マサリマイシン、および 肺炎球菌における細胞壁代謝を調製するための詳細なプロトコールが提示される。マイクロ波支援および古典的有機合成 を介 した阻害剤の調製が提供される。生物学的アッセイにおけるグラム陽性生理学を研究するためのツールとしてのその適用性が提示される。

マサリマイシンは、枯草菌および肺炎菌の小分子静菌阻害剤であり、枯草菌35、37における外効性GlcNAcase LytGを阻害し、肺炎菌37における細胞壁を標的とすることが示されている。マサリマイシンは、55%〜70%の範囲の収率を有する古典的またはマイクロ波支援有機合成のいずれかによって効率的に調製することができる。マイクロ波支援合成は、化合物を合成する時間を大幅に短縮するという利点を有する。マイクロ波支援合成は、同等の収率を維持しながら、合成を5〜6時間(従来の合成)から2〜3時間に短縮する。フラッシュクロマトグラフィーは、高純度のマサリマイシンの迅速な精製を提供する(補足図1〜2)。1Hおよび13CNMRスペクトルからの構造割り当てと代表的なスペクトルを補足図3</str...

細胞壁分解を標的とすることによって枯草菌および肺炎球菌の増殖を阻害する小分子プローブである静菌ジアミドマサリマイシンを調製するための詳細なプロトコールが提示される。化学プローブとしてのその応用は、枯草菌および肺炎菌との相乗効果/拮抗アッセイおよび形態学的研究において実証されている。

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

マサリマイシンは、細菌細胞の増殖を停止する細菌性オートライシンの数少ない阻害剤の1つです。これは、自己分解の化学的および遺伝的不活性化の違いを調査するために使用することができ、細菌生理学を研究するための遺伝学への直交アプローチを提供する。マサリマイシンの合成は困難に思えるかもしれません.表示される手順に厳密に従ってください。反応ステップが機能したかどうか疑わしい場合は、薄層クロマトグラフィーでRF値の変化を確認してください。開始するには、シクロヘキシルアミン、シクロヘキシルカルボキシアルデヒド、オルトヨード安息香酸、およびシクロヘキシルイソシアン化物の0.1モル溶液をメタノール中に調製する。マグネチックスターラーバーを加え、次いで、キャップ付き丸底フラスコに5ミリリットルのシクロヘキシルアミンおよび5ミリリットルのシクロヘキシルカルボキシアルデヒドを混合し、フラスコをホットプレートスターラー上の砂浴中に40°Cで30分間置く。砂面から約1cm下に温度計を設置して温度を監視します。30分後、5ミリリットルのシクロヘキシルイソシアン化物を溶液に加え、摂氏50度でさらに20分間撹拌する。次いで、反応混合物に5ミリリットルのオルトヨード安息香酸を加え、摂氏55度で3〜5時間撹拌し続ける。3時間の撹拌後、約1時間間隔で薄層クロマトグラフィー(TLC)により反応の進行を定期的にモニターする。TLCプレート上に保持率が0.3に等しいスポットが1つだけ見える場合、反応が完了していると考えてください。減圧下で回転式蒸発器で溶媒を除去する。すべてのメタノールが蒸発したら、乾燥粗生成物を30ミリリットルの酢酸エチルに溶解し、それを分液漏斗に移す。1モルの塩酸で酢酸エチルを順次抽出し、水、飽和重曹水、再度水、飽和塩化ナトリウム水溶液とし、各抽出にて水層を廃棄した。次いで、分液漏斗から酢酸エチル層を除去し、三角フラスコに集める。無水硫酸ナトリウムでいっぱいのヘラを加え、酢酸エチルから残留水を除去した。乾燥した酢酸エチル溶液をナンバーワンろ紙でろ過し、硫酸ナトリウムを除去した。その後、ろ紙を少量の酢酸エチルで洗浄する。濾過した酢酸エチル溶液を減圧下回転式エバポレーターで蒸発乾固し、酢酸エチルが全て除去され一旦油状物としてマサリマイシンを得た。マサリマイシン油を1〜2ミリリットルの9:1ヘキサンからイソプロパノール溶液に溶解し、化合物全体が溶解するまでマグネチックスタープレート上で攪拌する。溶解したマサリマイシンを精製するには、12グラムの順相シリカフラッシュカラムでフラッシュクロマトグラフィーを行います。フラッシュカラムを10カラム容量の移動相で平衡化し、毎分15ミリリットルの流量に設定した機器を使用します。平衡化が完了した後、溶解したマサリマイシンを5ミリリットルのシリンジを用いて引き抜く。シリンジを平衡化フラッシュカラムの上部に直接接続し、溶液をカラムに注入する。装填したカラムをフラッシュクロマトグラフィーシステムに再接続し、グラジエント溶出を開始します。12カラム容量にわたってイソプロパノールへの最終移動相濃度10:90ヘキサンへのグラジエント溶出を使用してカラムからマサリマイシンを溶出する。230および254ナノメートルでの吸収を介してマサリマイシンの溶出をモニターする。形態学的研究のために、37°CのLB寒天プレート上で枯草菌11774を増殖させる。その後のすべての実験において、600ナノメートルでの光学密度が1に達するまで、5ミリリットルのLBブロス中で増殖させた第二継代細胞を使用する。次に、ピペットを用いて、標識処理した培養チューブにマサリマイシンを終濃度3.8マイクロモル添加する。標識対照の培養チューブに対して、等量のDMSOを添加する。サンプルを摂氏37度のインキュベーターに入れ、150RPMで振とうしながら90分間置く。90分後、培養培地と固定緩衝液の1:10混合物中で培養物を摂氏4度で一晩化学的に固定する。翌日、ピペットを使用して、10~20マイクロリットルの化学固定サンプルをガラス顕微鏡スライドに塗布し、風乾させます。その後、ブンゼンバーナーを用いてスライドガラスを加熱して風乾したサンプルを加熱固定する。熱固定後、サンプルを100マイクロリットルの0.1%メチレンブルーで染色する。染色剤と共に10分間インキュベートした後、余分な色素を蒸留水で洗い流す。その後、染色されたスライドをオーブン中で摂氏60度に15〜20分間穏やかに加熱し、細胞を共通の焦点面に連れて行く。染色された細胞の上に顕微鏡カバースリップを置くことによって染色されたサンプルをシールする。次いで、顕微鏡スライドセメントを用いて縁部を密封する。密封した顕微鏡スライドを顕微鏡ステージに置き、明視野顕微鏡を用いて100倍の倍率で画像に焦点を合わせます。顕微鏡スライドに液浸油を一滴置き、1000倍の倍率で視野を合わせます。顕微鏡に取り付けられたカメラとそれに関連するソフトウェアを使用して顕微鏡写真を取得します。ソフトウェアのオートホワイトバランスと絞り設定を使用して画像を取得します。フラッシュクロマトグラフィーは、高純度のマサリマイシンの迅速な精製を可能にする。肺炎菌におけるATPase阻害剤オプトチンとの相乗効果または拮抗作用の評価をここに提示する。細菌増殖を阻害する化合物の最低濃度は、青色で示され、共薬の存在下での最小阻害濃度値と考えられる。対照的に、ピンク色の井戸は細菌の増殖を示す。最小阻害濃度の0.75倍のマサリマイシンを用いた表現型アッセイは、B.subtilisのソーセージ様表現型およびS.pneumoniaeの凝集表現型を実証した。反応の温度に注意してください。TLCで監視して反応が完了していることを確認します。この方法は、蛍光標識抗生物質と組み合わせて使用して、顕微鏡観察によって細胞壁の変化を調べることができる。

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