Name: HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学ぶ量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体を用いたハイスループット共焦点イメージング法。HEK293T細胞におけるhACE2受容体への結合とエンドサイトーシスを可視化し、ウイルス侵入メカニズムの追跡と抗ウイルススクリーニングへの応用を示す。

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この研究は、NIHの国立トランスレーショナルサイエンス推進センターの学内研究プログラムによって部分的に支援されました。海軍研究所は、内部のナノサイエンス研究所 を通じて 資金を提供しました。試薬調製は、NRL COVID-19基本基金 を通じて 支援されました。

本研究で用いたHEK293T細胞株は、不死化細胞株である。ヒトまたは動物の被験者は、この研究において使用されなかった。
1. 細胞の培養と播種
<ol><li>滅菌バイオセーフティキャビネット内で、個人用保護具(ラボグローブ、ラボコート、安全メガネを含む)を着用し、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)、および250μg/mL G418を補充して細胞培養培地を準備します。<ol>
<li>500 mL の培地に、443.75 mL の DMEM、50 mL の FBS、5 mL の P/S、および 1.25 mL の G418 を加えます。</li>
		<li>0.2μmのフィルターフラスコを通してろ過し、細菌汚染を避けるために無菌性を維持してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌バイオセーフティキャビネットの内部に、黒色の透明底のポリD-リジンコーティングされた96ウェルプレートの内部60ウェルに、細胞培養培地1ウェルあたり100μLで20,000個の細胞を播種する。外側の36ウェルを1ウェルあたり100 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で満たします。<ol>
<li>細胞を計数するために、2 μLのアクリジンオレンジおよびヨウ化プロピジウム染色剤を18 μLの細胞懸濁液に加える。</li>
		<li>この溶液10 μLを細胞計数スライドの片側にロードします。</li>
		<li>手順 1.2.1 を繰り返します。および 1.2.2.をクリックしてスライドの両側を読み込みます。</li>
		<li>スライドを自動セルカウンターに置きます。</li>
		<li>蛍光カウントプロトコルを選択し、カウントを押し ます。スライドの両側を数え、2 つの生細胞密度の平均を計算します。</li>
		<li>必要な細胞懸濁液の体積を計算するには、必要な細胞の総数を平均細胞密度で除算する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>播種後のウェルを光学顕微鏡で検査し、適切な密度と分布が達成されていることを確認します。</li>
	<li>プレートを5%CO2で37°Cの加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。</li>
</ol>2. QDスパイクによる細胞の処理
<ol><li>1%ウシ血清アルブミン(BSA)をイメージング培地で希釈して調製する。<ol>
<li>10 mL のイメージング培地に、130 μL の 7.5% BSA を加えて混合します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>12 ウェルリザーバーまたはアッセイプレートで、イメージング培地中の 0.1% BSA を使用して、440 nM QD-スパイク (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) ストックを 20 nM に希釈します。<ol>
<li>1ウェルのQD-スパイクについて、2.27 μL の 440 nM QD-スパイクを 47.73 μL の 0.1% BSA イメージング培地に添加し、最終濃度を 20 nM にします。</li>
		<li>6 点 1:3 の連続希釈 (3 連) を生成するには、14.26 μL の QD-Spike を 285.74 μL の 0.1% BSA イメージング培地に追加して、最高濃度の 20 nM にします。200 μL の 0.1% BSA 培地に 100 μL の 20 nM QD-スパイクを加え、6.67 nM QD-スパイクの第 2 希釈を行います。4 回繰り返して、6 つの濃度ポイントを生成します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マルチチャンネルアスピレーターを使用して、使用済みのメディアをすべて各ウェルから取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、イメージングメディア(100 μL/ウェル)で1回洗浄します。</li>
	<li>100 μL のイメージング培地を吸引し、50 μL/ウェルの QD-スパイク溶液を再び添加します。</li>
	<li>プレートを5%CO2で37°Cの加湿インキュベーターで3時間インキュベートする。ステップ 4 に進みます。</li>
</ol>3. 固定と核染色
<ol><li>滅菌バイオセーフティキャビネット内で、個人用保護具(ラボグローブ、ラボコート、安全メガネを含む)を着用し、0.1%BSAイメージングメディアに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を準備します。</li>
	<li>各ウェルから50 μLのQD-スパイクを吸引し、100 μL/ウェルの4% PFAを加える。<ol>
<li>井戸を乾かさないでください。ウェルの乾燥を避けるために、自動マルチチャンネルピペットを使用してください(推奨)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>室温で15分間インキュベートする。</li>
	<li>1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄する。</li>
	<li>5mM原液をPBSで1:1000希釈に希釈して深赤色核色素を調製した。</li>
	<li>PBSを吸引し、希釈した核色素を50 μL/ウェル戻します。</li>
	<li>室温で30分間インキュベートする。</li>
	<li>PBSで3回洗ってください。</li>
	<li>後日撮像するためのプレートシーラーを用いてプレートまたはシールを撮像する。プレートを4°Cで保管する。 蛍光は数週間以上安定している必要があります。</li>
</ol>4. 集録のセットアップとイメージング
<ol><li>イメージングプラットフォーム用のソフトウェアを起動します。ハイコンテンツイメージングプラットフォームをオンにすると、ステータスバーのライトが点灯します。マシンが接続されていない場合、ソフトウェアはオフライン分析モードに入ります。</li>
	<li>イメージングプラットフォームにログインします。</li>
	<li>新しい集録プロトコルを作成します。<ol>
<li>96 ウェルクリアボトムイメージングプレートとして プレートタイプ を選択します。 メモ:機器のプレート選択はさまざまであり、高さ、幅、その他の距離などのプレート寸法を含む正しいプレート定義をロードして、ウェル間隔と焦点を定義することによってカスタマイズできます。</li>
		<li>共焦点として 光学モード を選択し、倍率を40倍の水浸漬として選択します。</li>
		<li>[ビン分割] を 1 として選択します。</li>
		<li>ステップ4.3.5-4.3.8で説明されているようにチャンネルと蛍光励起/発光波長を選択します。設定が選択されたときにスナップショットを撮って画像を表示し、設定が適切であることを確認します。 注:デジタル位相コントラスト(DPC)により、細胞染色や蛍光色素を使用せずに生細胞を視覚化できます。固定セルにはお勧めできません。</li>
		<li>「ハイコントラスト」などの DPC の モード を選択して、明確に定義された細胞体を生成します。スナップショットを撮って、イメージウィンドウに表示されるように、この設定が適切であることを確認します。</li>
		<li>細胞内のACE2トラフィッキングの可視化を可能にするACE2-GFP細胞株で使用する FITCチャネル を選択します。</li>
		<li>QDチャンネルのカスタムチャンネルを作成するには、チャンネルの三角形のドロップダウンメニューを選択し、405nm範囲の励起と608nm範囲の発光を選択します。</li>
		<li>細胞を固定し、深赤色の核色素を使用した場合は、630nmを超える発光を有する遠赤色チャネルを選択して、細胞体をさらに描写し、細胞マスクとして作用させる。</li>
		<li>細胞質QD信号が強いウェルを選択して、露光時間、レーザーパワー、Z高さ位置を設定します。4.3.10 から 4.3.13 までの手順に従います。</li>
		<li>デフォルトの高さで、セルが目的の焦点面にある画像が生成されるかどうかを確認します。エンドサイトーシス穿刺が標的細胞小器官である場合、Z位は原形質膜が標的細胞小器官である場合よりも低くなる。</li>
		<li>背景信号の少なくとも 3 倍のグレーレベルを持つ明るい画像を生成する露光時間を選択します。これは通常、100 ~ 300 ミリ秒です。20 nM では、グレー レベルは 200 ミリ秒の露光時間と 80 ミリ秒のレーザー出力を使用して約 6000 a.u. になります。</li>
		<li>各チャンネルのスナップショット機能で生成された画像を右クリックし、[ 強度を表示]を選択してグレーレベルを確認します。次に、目的のオブジェクトまたは背景を左クリックして、そのピクセルのグレーレベルを表示します。</li>
		<li>レーザー出力を調整して、目的のオブジェクトの強度を微調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>集録プロトコルを保存します。</li>
	<li>[ 実験の実行 ] に切り替えて、[ プレート名] を入力します。</li>
	<li>実験を実行します。</li>
</ol>5. データ解析
<ol><li>イメージングソフトウェアにデータをインポートします。<ol>
<li>すべての画像を取得したら、測定値をイメージングソフトウェアにエクスポートします。これには、サーバーを確立し、アカウントを作成する必要があります。イメージングソフトウェアにエクスポートするデータの画面を作成します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イメージング ソフトウェアで、[ 画像解析 ] を選択して解析プロトコルの構築を開始します。</li>
	<li>画像化実験の測定値を読み込むには、画面リストでファイルを右クリックし、[ 選択]をクリックします。画像化された井戸とそれに関連するフィールドのプレートマップは、ウィンドウの左下隅に表示されます。</li>
	<li>明るい細胞質QDスポットのあるウェルを選択して、画像セグメンテーションを開始します。</li>
	<li>入力イメージの構成要素で、「フラットフィールド補正」を選択します。</li>
	<li>次の構成要素をプロトコルに追加するには、[ Nuclei の検索] を選択します。<ol>
<li>ここでは、DPCまたは遠赤色チャネルをNucleiマーカーとして使用します。</li>
		<li>最初にオブジェクトを正確にセグメント化する方法を選択し、ドロップダウンメニューを使用してスライダを調整してセグメンテーションを微調整します。 注: 適切なセグメンテーションは、核、細胞、およびスポットの関心領域 (ROI) を正確に定義します。マーカーに対して正のピクセルのみが、個々のROI内でキャプチャする必要があります。バックグラウンド信号は除外する必要があります。バックグラウンドがROIに取り込まれる場合、本方法の感度を低下させることができ、または強度の閾値を増加させて、セグメンテーションアルゴリズムのストリンジェンシーを増加させることができる。これは、すべての検索ビルディングブロックに適用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次に、[ 細胞質の検索] ビルディング ブロック を追加して、細胞質を識別します。<ol>
<li>この場合、細胞質セグメンテーションにACE2-GFPチャネルを使用する。</li>
		<li>各細胞の細胞質を最もよく識別する方法を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次に、[ スポットの検索] ビルディング ブロック を追加して、QD スパイク プンクタを識別します。<ol>
<li>ROI 母集団として [核 ] を選択します。</li>
		<li>ROI 領域としてセルを選択します。これは、細胞全体のプンクタをキャプチャします。</li>
		<li>各セルの QD 穿刺を最もよく識別する方法を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>画像内のすべてのオブジェクトがセグメント化され、このウェル内で正確に識別されたら、他のウェルを選択して、ビルディングブロックと設定を他のウェルやその他の条件に一般的に適用できるようにします。</li>
	<li>セグメント化されたすべてのオブジェクト(核、細胞質/細胞、およびスポット)の 強度の計算プロパティ を追加します。</li>
	<li>セグメント化されたすべてのオブジェクト(核、細胞質/細胞、およびスポット)の 形態計算プロパティ を追加します。</li>
	<li>セグメント化されたすべてのオブジェクト(核、細胞質/細胞、スポット)の テクスチャプロパティの計算 を追加します。</li>
	<li>核や斑点を含む各母集団のパラメータを選択して、結果を定義します。オブジェクトの数は、細胞生存率の間接的な尺度として使用できます。</li>
</ol>6. データのエクスポート
<ol><li>バッチ分析をクリックします。分析が完了するのを待ってから、次のステップに進みます (ステップ 6.2)。 メモ: バッチ分析により、画像解析ソフトウェアサーバーは、選択した測定値を使用して解析プロトコルをロードし、データをリモートで分析できます。</li>
	<li>データセットをローカル コンピューターまたはネットワーク ドライブにエクスポートします。<ol>
<li>接続ファイルをダウンロードして開いて、画像解析ソフトウェアをコンピュータ上のヘルパーアプリケーションに接続します。</li>
		<li>結果ファイルの種類 (.txt、.csv、.html、またはネイティブ XML) を選択します。</li>
		<li>ドロップダウンメニューで ファイルフォルダ 設定を選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. スプレッドシート内のデータを分析する
<ol><li>エクスポートしたファイルを開きます。.csvファイルの場合は、.xlsファイル形式で保存して、ピボットテーブルを使用できるようにします。ファイル パスが長すぎる場合は、保存時のエラーを回避するために、フォルダー階層の上位にある.xls ファイルを保存します。</li>
	<li>各ウェルの条件を指定する列をスプレッドシートに追加します。例えば、細胞型としては、QD−スパイク変異体、QD−スパイク濃度、インキュベーション時間等が挙げられる。</li>
	<li>ピボットテーブル関数を選択し、追加された条件を行として、測定パラメータを列として使用してテーブルを作成します。各パラメータの計算(平均、標準偏差、中央値、最小値、最大値、またはカウント)を選択します。</li>
	<li>非共役QDを0%、最高濃度のQD-スパイクを含む対照サンプルにデータを正規化します。 注:中和抗体などの阻害剤の有効性を評価する場合は、データを培地のみの処理細胞(100%有効性)および阻害剤なしのQD-スパイク(0%有効性)に正規化します。</li>
	<li>グラフ作成ソフトウェアでデータをプロットします。</li>
</ol>

<ol><li>Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChazotte%2C+B+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (2), 5571(2011).</li>
<li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li>
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<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80(2020).</li>
<li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li>
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<li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregated+CdS+quantum+dots%3A+Host+of+biomolecular+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li>
<li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates%3A+A+versatile+platform+for+biosensing%2C+energy+harvesting%2C+and+other+developing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536(2017).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

この記事で説明する方法は、ハイスループット共焦点顕微鏡を使用してヒト細胞中の機能化QDをイメージングするために必要な手順を提供します。この方法は、SARS-CoV-2スパイクおよびhACE2エンドサイトーシスの研究を可能にするため、TMPRSS2の活性および膜融合ではなく、エンドサイトーシスがウイルス侵入の主な経路である細胞に最も適している。QDモデルの性質と市販のスパイク三量体上のC末端Hisタグのため、スパイクS1ドメインとS2ドメインのTMPRSS2切断は、QDをS2ドメインに結合したままにするだけです12。これは、RBD が S1 で見つかった場合、内部化を防ぐことができます。したがって、細胞表面での一連の事象が正確であった場合、hACE2が結合し、TMPRSS2がスパイクを切断する場合、インターナリゼーションのない負のシグナルが予想される。
このプロトコルは細胞プロセスのイメージングを扱うので、培養細胞はhACE2の発現を伴うウイルス感染に対して許容性でなければならない。hACE2は、細胞に一過性にトランスフェクトされ得るか...

蛍光顕微鏡により、研究者は特殊な色素1、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質2、および量子ドット(QD)3の形の蛍光ナノ粒子を使用して、細胞の内部の仕組みを覗くことができます。2019年の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV-2)の世界的なパンデミックのために、研究者は蛍光顕微鏡法を使用して、ウイルスが原形質膜と細胞質の両方で細胞とどのように相互作用するかを理解しました。例えば、研究者らは、ビリオン表面のSARS-CoV-2スパイクタンパク質とヒト細胞表面のヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)との結合、その後の原形質膜での融合によるインターナリゼーション、およびスパイク:hACE2タンパク質複合体のエンドサイトーシスに関する洞察を得ることができました4,5。また、他の多くのウイルスと同様に、ゴルジ体から出芽する伝統的な小胞を介して発生すると考えられていたコロナウイルスのユニークな特徴である細胞蛍光イメージングを使用して、リソソームを介して細胞からSARS-CoV-2が出ることについても大きな洞察が得られました6。生物学的研究のほぼすべての側面の柱である細胞蛍光顕微鏡技術は、動物全体の超解像イメージングから薬物スクリーニングのための自動高含有量マルチパラメトリックイメージングまで、その幅広さと応用範囲において必然的に進歩してきました。ここでは、自動高含量共焦点顕微鏡法が、ウイルススパイクタンパク質にコンジュゲートした蛍光QDを用いたSARS-CoV-2細胞侵入の研究に適用される。
生物学的イメージングプラットフォームによって生成された画像のハイコンテンツ分析は、マルチモーダルプレートリーダーを使用して取得するウェル全体の強度などの単一のパラメータよりも、貴重な生物学的洞察のより大きな抽出を可能にします7。自動セグメンテーションアルゴリズムを使用して視野内のオブジェクトを分離することにより、各オブジェクトまたはオブジェクトの集団を、利用可能な各蛍光チャネルの強度、面積、テクスチャなどのパラメータについて分析できます8。多くの測定値を多変量データセットに結合することは、表現型プロファイリングに便利なアプローチです。プンクタの形態のQDインターナリゼーションなどの所望の表現型が知られている場合、サイズ、数、強度などのプンクタに関連する測定値を使用して、治療の有効性を評価することができる。
クラウドベースのハイコンテンツイメージング解析ソフトウェアは、ハイコンテンツイメージングプラットフォームを含む多種多様な機器データ出力に対応できます。画像ストレージとオンライン分析にクラウドベースのサーバーを使用することで、ユーザーはイメージング機器またはデータが保存されているネットワークドライブからデータをアップロードできます。プロトコルの分析部分はクラウドソフトウェア環境内で行われ、ダウンストリームのデータ視覚化のためにさまざまなファイル形式でデータをエクスポートできます。
SARS-CoV-2ウイルスは、その集合および複製を助ける非構造的および構造的タンパク質からなる。SARS-CoV-2スパイクはS1とS2と呼ばれる2つのドメインを有し、S1は原形質膜におけるhACE2相互作用に関与する受容体結合ドメインを含む9。スパイクはまた、hACE210,11に加えて共受容体として作用し得る原形質膜において他の分子と相互作用することが見出されている。スパイクタンパク質配列全体、特にS1/S2界面には、膜貫通後の膜における融合を可能にするプロテアーゼ切断部位がセリンプロテアーゼ2(TMPRSS2)12に存在する。個々の受容体結合ドメインから、S1、S2、S1、およびスパイク三量体全体を研究活動に使用するために、複数の商業ベンダーからS1、S2、およびスパイク三量体全体に対して、さまざまな組換えSARS-CoV-2スパイクタンパク質が産生されています13。
この研究において、QDsの表面を、ヒスチジンタグを含む組換えスパイク三量体(QD-Spike)で官能化した。海軍研究所光学ナノ材料部門によって製造されたQDは、セレン化カドミウムコアと硫化亜鉛シェル14,15を含む。QD表面上の亜鉛は、組換えタンパク質内のヒスチジン残基を調整して、SARS-CoV-2ウイルス粒子に形態および機能的に類似した機能化されたQDを形成する。ナノ粒子の生成およびタンパク質コンジュゲーションは、QD結合型受容体結合ドメインを用いて先に記載した15。この方法は、ヒト細胞の生理学的文脈におけるSARS-CoV-2スパイク活性を研究する際に研究者を導くことができる細胞培養調製物、QD処理、画像取得、およびデータ解析プロトコルを記述する。

<table><tbody><tr><td>32% パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15714</td><td>量子ドット処理後の細胞の固定に使用され、最終濃度 3.2% Optimem I の QD の安定化に使用され、非特異的相互作用の防止、最終濃度 0.1%</td></tr><tr><td>7.5% ウシ血清アルブミン</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td> アクリジンオレンジ/プロピジウムヨウ化物染色を<td>カウントする蛍光細胞の細胞生存率色素として使用されます</td></tr><tr><td></td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>細胞の播種とQD-Spikeのアッセイに使用されるマイクロウェルプレート</td></tr><tr><td>ブラッククリアボトム96ウェルコーティングプレートにポリD-リジン</td><td>Greiner</td><td>655946</td>コーティング <td>細胞培養、DMEMサプリメントのサポートに使用</td></tr><tr><td>特徴付けられたウシ胎児血清</td><td>Cytiva/HyClone</td><td>SH30071.03</td><td>クラウドベースのハイコンテント画像解析ソフトウェア。V2.9.1</td></tr><tr><td>コロンバスアナライザー</td><td>パーキン・エルマー</td><td>NA</td><td>固定後の細胞核および細胞体の標識に使用、深赤色核色素</td></tr><tr><td>DRAQ5 (5 mM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>62252</td><td>HEK293T細胞培養用基礎培地</td></tr><tr><td>ダルベッコのミニマルエッセンシャル培地、D-グルコース (4.5g/L)、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム (110 mg/L)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>コロンバスからエクスポートした後のデータの整理に使用されます。V2110 Microsoft 365</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>hACE2-GFP陽性細胞の継続選択に使用、DMEMサプリメント</td></tr><tr><td>G418</td><td>InvivoGen</td><td>ant-gn-5</td><td>ヒト胚性腎臓細胞株は、GFP HEK293Tでタグ付けされたヒトアンジオテンシン変換酵素2を安定して発現</td></tr><tr><td>hACE2-GFP</td><td>Codex Biosolutions</td><td>CB-97100-203</td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>Luna自動セルカウンター</td><td>Logos Biosystems</td><td>NA</td><td>蛍光細胞計数に使用</td></tr><tr><td>Luna Cell Counting Slides</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>ハイコンテントイメージングプラットフォーム</td></tr><tr><td>Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>量子ドットで細胞をインキュベートするために使用されるイメージング培地</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>カルシウムやマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 継代中の細胞の洗浄とPBSのアッセイに使用されます</td></tr><tr><td>-/-</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>細胞培養の細菌汚染を防ぐために使用され、DMEMサプリメント</td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>グラフ作成、データの視覚化、および統計分析に使用されます。V9.1.0</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>NA</td><td>SARS-Cov-2 Spike の hACE2 への結合のアッセイと Spike エンドサイトーシスのモニタリングに使用</td></tr><tr><td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td> <td>海軍研究所</td><td></td>製カスタムメイド <td>SARS-CoV-2 の阻害に使用 hACE2</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) へのスパイク結合 スパイク中和抗体、マウス Mab</td><td>Sino Biological</td><td>40592-MM57</td><td>継代中にフラスコから細胞を解離するために使用</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr></tbody></table>

hek293t細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役sars-cov-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

細胞蛍光顕微鏡法の新技術の開発により、創薬のためのハイスループットスクリーニング方法が容易になりました。量子ドットは、明るく安定したフォトルミネッセンスと狭い発光帯を吹き込んだ優れた光物性を有する蛍光ナノ粒子である。量子ドットは球状の形状であり、表面化学を適切に修正して、細胞用途のために生体分子を共役するために使用することができる。これらの光学特性は、生体分子でそれらを機能化する能力と相まって、受容体 - リガンド相互作用および細胞輸送を調査するための優れたツールとなる。ここでは、量子ドットを使用してSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合およびエンドサイトーシスを追跡する方法を提示する。このプロトコルは、細胞生理学の文脈におけるタンパク質間相互作用およびトラッキングを研究するために量子ドットを利用しようとしている実験家のためのガイドとして使用することができる。

治療すると、ナノ粒子が原形質膜上のACE2に結合し、エンドサイトーシスを誘導するため、QDは内在化される。ACE2-GFP発現細胞株を用いて、QDおよびACE2の両方の転座を蛍光顕微鏡を用いて可視化することができる。一旦内部化されると、2つのQDおよびACE2シグナルは強い共局在化を示す。これらの画像から、画像セグメンテーションおよびその後の分析を実行して、スポットカウントなどの関連パラメータを抽出することができる(図1、 図2B)。 図1A は、対照として異なる濃度のQD−スパイクまたは培地のみで処理した細胞のモンタージュである。デジタル位相コントラスト、FITCおよび405nmでの励起と608nmでの発光を備えたカスタムQDチャネルを含む3つのチャネルが使用された。DPC は、一般的なセル形状のイメージを提供します。DPC画像は、細胞形態全体のおおよその指標を提供する。関心領域はDPC信号と重なり合い、内部化されたQDを検出するのに十分です。FITCチャネ...

このプロトコルでは、組換えSARS-CoV-2スパイクにコンジュゲートした量子ドットは、細胞ベースのアッセイを可能にし、原形質膜でのhACE2へのスパイク結合およびその後の細胞質への結合タンパク質のエンドサイトーシスをモニターする。

HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

私たちは、スパイク媒介細胞の認識と侵入を細胞ウイルス感染の第一歩として、他のウイルスにも適用できるSARS新型コロナウイルスCOVID 2のプラットフォーム技術を確立しました。量子ドットは明るく、安定しており、その表面は様々な細胞用途のために官能化することができる。この方法を使用すると、細胞へのスパイクのインターナリゼーションを視覚化して測定することができます。0.1%BSAを準備する。10ミリリットルのイメージングメディアに130マイクロリットルの7.5%BSAを加えます。6.1~3段階希釈および3連の場合は、14.26マイクロリットルのQDスパイクを285.74マイクロリットルの0.1%BSAに加え、最高濃度の20ナノモルにします。次に、100マイクロリットルの20ナノモルまたはQDスパイクを200マイクロリットルの0.1%BSAに追加して、6.67ナノモルのQDスパイクの2番目の妄想を行います。マルチチャンネルアスピレーターで各ウェルからすべての使用済み培地を取り出し、ウェルあたり100マイクロリットルのイメージングメディアを含むマルチチャンネルピペットで1回洗浄し、次に100マイクロリットルのイメージングメディアを吸引します。1ウェルあたり50マイクロリットルのQDスパイク溶液を再び添加し、プレートを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%の二酸化炭素で3時間インキュベートする。保護具を着用し、滅菌バイオ安全キャビネット内に4%PFAおよび0.1%PSAイメージングメディアを準備し、各ウェルから50マイクロリットルのQDスパイクを吸引し、ウェルの乾燥を避けるために自動マルチチャンネルピペットでウェルあたり100マイクロリットルの4%PFAを追加します。室温で15分間インキュベートし、次いでPBSで3回洗浄し、5ミリメートルの原液をPBSで1〜1000で希釈して深赤色核色素を調製し、PBSを吸引し、1ウェルあたり50マイクロリットルの希釈核色素を戻す。室温で30分間インキュベートし、PBSで3回洗浄し、プレートを画像化するか、後でイメージング用のプレートシーラーを使用してシールします。プレートを摂氏 4 度で保管します。イメージングプラットフォーム用のソフトウェアを起動します。イメージングプラットフォームにログインした後、96ウォール透明底イメージングプレートとしてプレートタイプを選択して新しい取得プロトコルを作成し、焦点と倍率を40倍の水浸漬として行った光学モードを選択し、ビニングを1つとして選択します。ハイコントラストなどのデジタル顔コントラストのモードを選択して、明確に定義された細胞体を生成します。スナップショットを撮って、画像ウィンドウに表示されるこの見出しが適切であることを確認し、ACE2-GFP細胞株で使用する適合Cチャネルを選択して、細胞内のACE2トラフィッキングを視覚化します。カスタムQDチャンネルを作成するには、三角形のドロップダウンメニューを選択し、608ナノメートルの範囲の発光で405ナノメートルの範囲の励起を選択し、堅牢な細胞質QD信号を持つ井戸を選択して、露光時間、レーザーパワー、Z高さ位置を設定します。デフォルトの高さで、目的の焦点面内のセルのイメージが生成されるかどうかを確認します。Z位置は、原形質膜に対するZ位置よりもエンドサイトース穿刺の方が低くなるであろう。通常、100 ~ 300 ミリ秒の露光時間を選択して、背景信号の少なくとも 3 倍のグレーレベルの明るい画像を生成します。20ナノモルでは、グレーレベルは約6,000原子単位で、露光時間は200ミリ秒で、レーザー出力は80%です。各チャンネルのスナップショット機能で生成された画像を右クリックして[強度を表示]を選択し、目的のオブジェクトまたは背景を左クリックしてそのピクセルのグレーレベルを表示し、レーザー出力を調整して目的のオブジェクトの強度を微調整します。取得プロトコルを保存し、実験の実行に切り替えてプレート名を入力し、実験を実行します。QDおよびACE2の両方の転座を、蛍光顕微鏡法およびACE2−GFP発現細胞株を用いて可視化した。画像セグメンテーションとその後の分析を行い、スポットカウントなどの関連パラメータを抽出しました。まず、核マーカーチャネルから核をセグメント化してROI集団を作成した。次に、ACE2−GFPチャネルを用いてセグメント化して細胞を輪郭を描くROI領域を作製する。最後に、QD 608スパイクスポットは、細胞ROI領域からセグメント化され、インターナライズされたQDおよびACE2シグナルは、強い共局在を示した。6つの異なる濃度のQDスパイクを用いた濃度応答実験を、HEK 293T細胞において実施した。QDの光学濃度を決定する場合、QDSは2.22ナノモルまで低く使用できますが、堅牢な応答を確保するために10ナノモル以上の濃度を使用することをお勧めします。QDタンパク質へのコンジュゲーション中に凝集が起こり得る。凝集体を、明るい凝集沈殿物およびHEK 293T細胞としてQD溶液中にスポットし、QDsを細胞に添加する前にマイクロリットル当たり30マイクログラムで開始する中和抗体と共にインキュベートし、これらの抗体が結合インターナリゼーションをブロックし、QDのみで処理した細胞と比較してスポット数の減少を引き起こした。このエッセイは、ハイスループットスクリーニング、中和抗体の評価をリードして、ブロックウイルスの侵入に対する抗ウイルス薬を同定し、新たに出現するバリアントの研究に適応させることもできます。

high-throughput-confocal-imaging-quantum-dot-conjugated-sars-cov-2

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

の細胞内相互作用の可視化と定量化髄膜炎菌</em共焦点イメージングによるα-アクチニン>と人間

Source: Tran, B. N., et. al. High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the use of quantum dot–conjugated spike protein (QD-Spike) to visualize dose-dependent viral entry in ACE2-GFP–expressing cells. Confocal imaging captures the internalization of QD-Spike via receptor-mediated endocytosis, modeling early coronavirus entry.

Visualizing Dose-Dependent Spike Protein Uptake with Quantum Dot Conjugates

このビデオでは、SARS-CoV-2サブゲノムRNAの空間分布を可視化するためのHybridization Chain Reaction(HCR)-Fluorescence In Situ...

Immuno-RNA Fluorescence In Situ ハイブリダイゼーションを使用した SARS-CoV-2 の可視化

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

このプロトコルでは、蛍光共鳴エネルギー移動し、蛍光寿命イメージングに基づく SNARE...

蛍光寿命イメージングによる細胞内のスネアを可視化

ターゲット細胞表面受容体に結合する抗体は、コンフォメーションとクラスタ リングの変化を与えることができます。これらの動的な変更には、標的細胞で医薬品開発を特徴付けるための含意があります。このプロトコルは、共焦点顕微鏡、細胞表面の受容体の程度を定量化する...

共焦点顕微鏡を明らかに細胞表面受容体画像相関分光法による凝集

ここでは、その蛍光におけるRNA蛍光をその蛍光(RNA-FISH)と免疫蛍光と組み合わせて、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)RNAを可視化する簡単な方法を説明する。このプロトコルは、単一細胞レベルでのSARS-CoV-2...

SITUハイブリダイゼーションにおける免疫RNA-蛍光を用いたSARS-CoV-2の可視化

ここで説明するプロトコルは、スパイク糖タンパク質に擬似的に結合した強化された緑色蛍光タンパク質標識付き小胞性口内炎ウイルスによる感染を阻害する回復血清サンプルの能力を評価することによって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法を概説する。...

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

このプロトコルは、インビボでSARS-CoV-2感染を研究するために必要な二次的アプローチの必要性を克服するために、K18...

レポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量

ここでは、デュアルレポーターフローサイトメトリーシステムを使用して、アンジオテンシン変換酵素-2結合磁気マイクロスフェアによって捕捉された無傷の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス粒子上の2つのユニークなスパイクタンパク質エピトープを同時に検出する、新たに開発されたマルチプレックス蛍光免疫測定法について説明します。...

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。...

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

学ぶ量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体を用いたハイスループット共焦点イメージング法。HEK293T細胞におけるhACE2受容体への結合とエンドサイトーシスを可視化し、ウイルス侵入メカニズムの追跡と抗ウイルススクリーニングへの応用を示す。

HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

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