Name: バイオサーファクタントの組み合わせを使用したオイル回収の強化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 学ぶバイオサーファクタントのスクリーニングと特性評価法。Rhodococcus、Lysinibacillus、Paenibacillusを用いて残油回収を強化する持続可能な微生物技術を探索します。

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著者らは、インド政府バイオテクノロジー省の財政支援に感謝したい。

著者らは利益相反がないと宣言しています。

バイオサーファクタントは、化学界面活性剤の魅力的な代替品になりつつある生物学的に活性な成分の最も汎用性の高いグループの1つです。洗剤、塗料、化粧品、食品、医薬品、農業、石油、水処理など、濡れ性の向上、CMCの低下、構造の多様化、環境への優しさなど、幅広い用途があります18。これは、バイオサーファクタント産生が可能なより多くの微生物株を発見することへの関心の高まりにつながった。ここでは、ロドコッカス・エスピーIITD 102、リシニバチルス・エスピーIITD 104、およびパエニバチルス・エスピーIITD 108によって産生されるバイオサーファクタントの混合物のスクリーニング、同定、および適用のための方法を例示し、油回収を増強する。バイオサーファクタント産生は、落下崩壊、油拡散、エマルジョンインデックスアッセイによってスクリーニングし、微生物増殖による培地の表面張力の低下を測定することによって確認した。ロドコッカスからの糖脂質バイオサーファクタント(ラムノ脂質およびトレハロ脂質)の産生に関する種々の報告は、文献<sup ...

バイオサーファクタントは、微生物によって産生される両親媒性界面活性分子であり、2つの相間の表面および界面張力を低下させる能力を有する1。典型的なバイオサーファクタントは、通常、糖部分またはペプチド鎖または親水性アミノ酸から構成される親水性部分と、飽和または不飽和脂肪酸鎖2から構成される疎水性部分とを含む。その両親媒性の性質のために、バイオサーファクタントは2つの相の間の界面で集合し、境界における界面張力を低下させ、1つの相の他方の相への分散を促進する1,3。これまでに報告されている様々なタイプのバイオサーファクタントには、炭水化物がエステル結合を介して長鎖脂肪族またはヒドロキシ脂肪族酸に連結された糖脂質(例えば、ラムノリピッド、トレハロ脂質およびソホロリピッド)、脂質がポリペプチド鎖に結合しているリポペプチド(例えば、サーファクチンおよびリケニシン)、および通常、多糖−タンパク質複合体(例えば、 エムルサン、リポサン、アラサンおよびリポマンナン)4。微生物によって産生される他のタイプのバイオサーファクタントには、脂肪酸、リン脂質、中性脂質、および粒子状のバイオサーファクタント5が含まれる。バイオサーファクタントの最も研究されたクラスは糖脂質であり、その中でほとんどの研究はラムノリピッド6について報告されている。ラムノ脂質は、1分子または2分子の長鎖脂肪酸(通常はヒドロキシデカン酸)に連結されたラムノース(親水性部分を形成する)の1つまたは2つの分子を含有する。ラムノ脂質は、緑膿菌7から最初に報告された一次糖脂質である。
バイオサーファクタントは、それらが提供する様々なユニークで独特の特性のために、化学的対応物と比較してますます注目を集めています8.これらには、より高い特異性、より低い毒性、より大きな多様性、調製の容易さ、より高い生分解性、より良い発泡性、環境適合性および極端な条件下での活性が含まれる9。バイオサーファクタントの構造的多様性(図S1)は、それらに化学的対応物10に対する優位性を与える別の利点である。それらの臨界ミセル濃度(CMC)は通常、化学界面活性剤11よりも数倍低いので、それらは一般に、より低い濃度でより効果的かつ効率的である。それらは非常に耐熱性(最大100°C)であり、より高いpH(最大9)および高い塩濃度(最大50g / L)に耐えることができると報告されており12 、それによって極端な条件への曝露を必要とする工業プロセスにおいていくつかの利点を提供する13。生分解性と毒性が低いため、バイオレメディエーションなどの環境用途に適しています。彼らが提供する利点のために、彼らは食品、農業、洗剤、化粧品、石油産業のような様々な産業でますます注目を集めています11。バイオサーファクタントはまた、石油汚染物質および有毒汚染物質を除去するための油修復において多くの注目を集めている14。
ここでは、 Rhodococcus sp. IITD102、 Lysinibacillus sp. IITD104、およびPaenibacillus sp. IITD108によって産生されたバイオ サーファクタ ントの産生、特性評価、および適用を報告する。強化された油回収のためのバイオサーファクタントの組み合わせのスクリーニング、特性評価、および適用に関連するステップを 図1に概説する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63207/63207fig01.jpg"> 図1:バイオサーファクタントの組み合わせを使用した油回収率を高める方法。 ステップワイズなワークフローが表示されます。作業は4段階で行った。まず、微生物株を培養し、ドロップ崩壊アッセイ、油拡散アッセイ、エマルジョンインデックスアッセイ、および表面張力測定を含む様々なアッセイによってバイオサーファクタントの産生についてスクリーニングした。次いで、バイオサーファクタントを無細胞ブロスから抽出し、その性質を薄層クロマトグラフィーを用いて同定し、LCMS、NMR、およびFT-IRを用いてさらに同定した。次のステップでは、抽出されたバイオサーファクタントを一緒に混合し、得られた混合物の油回収率を高める可能性をサンドパックカラム技術を用いて決定した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63207/63207fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
バイオサーファクタントを産生するこれらの微生物株のスクリーニングは、微生物の増殖による無細胞培地の表面張力の低下のドロップ崩壊、油拡散、エマルジョンインデックスアッセイおよび決定によって行われた。バイオサーファクタントを抽出し、特徴付け、LCMS、 1HNMR、およびFT-IRによって化学的に同定した。最後に、これらの微生物によって産生されるバイオサーファクタントの混合物を調製し、シミュレートされた砂パックカラムで残留油を回収するために使用した。
本研究は、残留油回収率を高めるためのバイオサーファクタント組合せのスクリーニング、同定、構造特性評価、および適用に関与する方法のみを示している。微生物株15、16によって産生されるバイオサーファクタントの詳細な機能的特徴付けを提供していない。任意のバイオサーファクタントの詳細な機能特性評価のために、臨界ミセル決定、熱重量分析、表面濡れ性、および生分解性などの様々な実験が行われる。しかし、この論文は方法論文であるため、残留油回収を促進するためのバイオサーファクタントの組み合わせのスクリーニング、同定、構造特性評価、および適用に焦点を当てています。これらの実験はこの研究には含まれていない。

<table><tbody><tr><td>1 mlピペット</td><td>エッペンドルフ、ドイツ</td><td>G54412G</td><td></td></tr><tr><td>1H NMR</td><td>Bruker Avance AV-III型分光計、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ulピペット</td><td>Thermo scientific、米国</td><td>H69820</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>JAISBO、インド</td><td>Ser no 5923</td><td>Jain Scientific</td></tr><tr><td>Blue flame burner</td><td>Rocker scientific、台湾</td><td>ドラゴン 200</td><td></td></tr><tr><td>ブタノール</td><td>GLR イノベーション、インド</td><td>GLR09.022930</td><td></td></tr><tr><td>C18 カラム</td><td>Agilent Technologies、米国</td><td>770995-902</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ、ドイツ</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>メルク、インド</td><td>1.94506.2521</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム-d</td><td>SRL、インド</td><td>57034</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ</td><td>ターソン、インド</td><td>546041</td><td>放射線滅菌ポリプロピレン</td></tr><tr><td>FT-IR</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA&</td><td>nbsp;Nicolet iS50</td><td></td></tr><tr><td>ヒュームフード</td><td>ケーラ、インド</td><td>47408</td><td>カスタマイズされた</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>メルク、インド</td><td>1.93002</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ</td><td>メルク、インド</td><td>104014</td><td></td></tr><tr><td>ガラススライド</td><td>Polar Industrial Corporation、米国</td><td>ブルースター</td><td>75 mm * 25 mm</td></tr><tr><td>グラスウール</td><td>メルク、インド</td><td>104086</td><td></td></tr><tr><td>塩酸メル</td><td>ク、インド</td><td>1003170510</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>サーモサイエンティフィック、米国</td><td>MaxQ600</td><td>振盪インキュベーター</td></tr><tr>イン<td>キュ</td>ベーター <td>ケーラ、インド</td><td>Sunbim</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素再昇華</td><td>メルク、インド</td><td>231-442-4</td><td>&nbsp;再昇華した顆粒</td></tr><tr><td>K12&ndash;Kruss tensiometer</td><td>Kruss Scientific, Germany</td><td>K100</td><td></td></tr><tr><td>Laminar air flow cabnet</td><td>Thermo Scientific, China</td><td>1300 Series A2</td><td></td></tr><tr><td>LCMS</td><td>Agilent Technologies, USA</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>HIMEDIA, India</td><td>M575-500G</td><td></td></tr><tr><td>Powder Methanol</td><td>Merck, India</td><td>107018</td><td></td></tr><tr><td>Ninhydrin</td><td>TitanBiotech Limited、インド</td><td>1608</td><td></td></tr><tr><td>p-アニスアルデヒド</td><td>Sigma、米国</td><td>204-602-6</td><td></td></tr><tr><td>ペトリプレート</td><td>ターソンズ、インド</td><td>460090-90 MM</td><td>放射線滅菌ポリプロピレン</td></tr><tr><td>サポニン</td><td>メルク、インド</td><td>232-462-6</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク、インド</td><td>231-598-3</td><td></td></tr><tr><td>試験管</td><td>ボロシル、インド</td><td>9800U06</td><td>ガラス管</td></tr><tr><td>TLCプレート</td><td>メルク、インド</td><td>1055540007</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>GeNei、インド</td><td>2006114318</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>ジュラボ、インド</td><td>SW21C</td><td></td></tr></tbody></table>

バイオサーファクタントの組み合わせを使用したオイル回収の強化

Enhanced Oil Recovery using a Combination of Biosurfactants

バイオサーファクタントは、極性の異なる2つの相間の表面張力を低下させることができる界面活性化合物である。バイオサーファクタントは、毒性が低く、生分解性が高く、環境適合性があり、極端な環境条件に対する耐性があるため、化学界面活性剤の有望な代替品として浮上しています。ここでは、バイオサーファクタントを産生し得る微生物のスクリーニングに用いられる方法を例示する。バイオサーファクタント産生微生物を、ドロップ崩壊、油拡散、およびエマルジョンインデックスアッセイを用いて同定した。バイオサーファクタント産生は、微生物メンバーの増殖による培地の表面張力の低下を決定することによって検証した。また、バイオサーファクタントの特性評価および同定に関与する方法についても説明します。抽出されたバイオサーファクタントの薄層クロマトグラフィー、続いてプレートの示差染色を行い、バイオサーファクタントの性質を決定した。LCMS、 1HNMR、およびFT-IRを用いて、バイオサーファクタントを化学的に同定した。我々はさらに、シミュレートされたサンドパックカラムにおける残留油回収率を高めるための産生されたバイオサーファクタントの組み合わせの適用を評価するための方法を例示する。

3つの細菌株(Rhodococcus sp. IITD102、Lysinibacillus sp. IITD104、およびPaenibacillus sp. IITD108)を、ドロップ崩壊アッセイ、油置換アッセイ、エマルジョンインデックスアッセイ、および表面張力低下を含む様々なアッセイによってバイオサーファクタントの産生についてスクリーニングした。3つの細菌株すべておよび化学界面活性剤の溶液の無細胞上清は、滴下崩壊をもたらし、したがって、バイオサーファクタントの存在について陽性とスコア付けされた(図4a)。一方、水の液滴は崩壊しなかったため、バイオサーファクタントの存在について陰性にスコアリングされた。3つの細菌培養物の市販の界面活性剤および無菌上清も、油拡散アッセイにおいて油の層を置換することに成功し、したがって、バイオサーファクタントの存在について陽性とスコア付けされた(図4b)。一方、水は油を置き換えることができなかったため、スコアは陰性でした。エマルジョン...

我々は、バイオサーファクタント産生微生物のスクリーニングおよび同定に関与する方法を例示する。バイオサーファクタントのクロマトグラフィー特性評価および化学的同定のための方法、残留油回収の増強におけるバイオサーファクタントの産業的利用可能性の決定も提示される。

Biosurfactants are surface-active compounds capable of reducing the surface tension between two phases of different polarities. Biosurfactants have been ...

バイオサーファクタントは、液体の表面張力および2つの異なる相間の間隙張力を低下させる能力を有する微生物によって産生される共感性表面活性分子である。これらの分子の共感的な性質は、それらが2つの異なる相間の界面で自分自身を整列させ、ある相の別の相への可溶化を強化することを可能にする。バイオサーファクタントは、それらが提供する様々な利点のために、それらの化学的対応物と比較して多くの注目を集めている。これらには、より高い特異性、より低い毒性、より大きな構造多様性、調製の容易さ、より高い生分解性、それらのより高い環境適合性、および環境の極端な条件下でのそれらの活性が含まれる。このビデオでは、ロドコッカス、リシニバチルス、パエニバチルスの異なる株によって産生されるスクリーニング、特性評価、および適用バイオサーファクタントに関与する方法を実証します。我々はさらに、サンドパックカラム技術による残留油の回収におけるこれら3つの微生物株によって産生されるバイオサーファクタントの組み合わせの適用を評価する方法を例示する。この作業は、Preeti Srivastava博士とManoj Kumar博士の指導の下で行われてきました。微生物の成長のために、1ミリリットルのオートクレーブ処理されたルリアブロスを含むフラスコに接種し、一晩成長させた種培養物を層流キャビネット内のフラスコに加えることによって接種する。フラスコを摂氏30度および180RPMの回転式インキュベーターで7日間インキュベートする。培養期間終了後、フラスコを回収し、培養液を遠沈管に移す。培養物を4で遠心分離し、摂氏4度の冷蔵遠心分離機で20分間500G。無細胞上清を新鮮なビーカーに穏やかに注ぎ、バイオサーファクタント産生のスクリーニングアッセイに使用します。ドロップ崩壊アッセイによるバイオサーファクタント産生をスクリーニングするために、きれいなスライドガラスを取り、スライドの表面を200マイクロリットルの油でコーティングする。次に、20マイクロリットルの無細胞上清を油の中心に加え、2〜3分間邪魔されずに放置する。滴が崩壊した場合は、上清をバイオサーファクタントの存在に対して陽性とスコア付けする。油展延アッセイでは、20ミリリットルの二重蒸留水をペトリプレートに取り、水面に200マイクロリットルの原油を加える。次に、20マイクロリットルの無細胞上清を油の中心に加え、1分間邪魔されずに放置する。油の変位の結果として透明化ゾーンが形成された場合は、バイオサーファクタントの存在について上清を陽性とスコア付けします。エマルジョンインデックスアッセイでは、ガソリンおよび無細胞上清をそれぞれ4ミリリットルを清潔なガラス管に加える。その後、混合物を3分間激しくし、次の24時間邪魔されずに放置します。無細胞上清の表面張力を測定するには、表面張力が決定される液体でガラス容器を洗浄する。液体を容器に加え、容器ホルダーに容器を取り付けます。プローブホルダーのロックを解除し、プローブを取り付けます。手動コントローラを使用して、プローブが液体の表面から2〜3ミリメートル離れるように、プラットフォームの高さを調整します。次に、ソフトウェアに移動し、論文に記載されている手順に従って表面張力を測定します。測定が完了したら、プラットフォームの高さを下げ、プローブと容器を装置からロック解除して取り外します。バイオサーファクタントの抽出のために、無細胞上清のpHを2つに調整し、2つの通常の塩酸を使用する。混合物を摂氏4度で一晩保存する。翌日、メタノール混合物に等量のクロロホルムを加え、20分間激しく混合する。混合物を邪魔しないで、自由な分離が起こるようにしてください。水とメタノールを含む上面を取り除き、下面はバイオサーファクタントを含むままにして、ヒュームフードで蒸発させます。有機相の蒸発後、蜂蜜色のバイオサーファクタントを3ミリリットルのクロロホルムに再溶解し、この混合物をバイオサーファクタントの特性評価および同定に使用する。抽出されたバイオサーファクタントのクロマトグラフィー特性評価のために、TLCプレート上に20マイクロリットルのバイオサーファクタントをスポットする。プレートを乾燥させた後、クロロホルムメタノール混合物で飽和させたチャンバー内にTLCプレートを置き、TLCを稼働させた。脂質検出のために、ヨウ素の顆粒を新鮮なチャンバーに加え、チャンバーを5〜10分間飽和させる。TLCをチャンバー内に置き、黄色の斑点の発生を観察します。タンパク質と炭水化物を検出するには、TLCプレートに非水素またはアニスアルデヒドをスプレーし、摂氏110度で加熱し、色の発達を観察します。NMR分析の場合は、チューブをスパナに挿入します。調整されたチューブを使用してチューブの高さを調整します。NMRチューブとスパナをMRマシンに置き、論文に記載されている手順に従ってNMRスペクトルを取得します。強化されたオイル回収実験のために、ガラスカラムを取り、底部出口をグラスウールとガラスビーズで密封する。土の上部に液体を加えることができるように、砂質の土で柱を戻します。ホルダーに柱を取り付け、土の上にガラスビーズを加えます。カラムに 50 ミリリットルのブライン溶液を流し込み、流れを集めて不良体積を判断します。原油を強制的に通過させて、カラムからブラインを取り除きます。カラムから出てくる塩水と油の量を集めて、初期油飽和量を決定します。24 時間後、カラムに 10 個の貧弱な量の塩水を入れ、カラムから出てくるオイルを収集して二次オイル回収率を推定します。二次油回収後にカラムに残された油分が残油に相当する。次に、抽出したバイオサーファクタントをガラスビーカーに添加してバイオサーファクタントの混合物を調製する。そして、バイオサーファクタントと混合物をカラムに加え、次の24時間それを邪魔しないで放置する。24 時間後、カラムから流出した油と水の量を測定して、油の回収率の追加または強化を判断します。3つの微生物株の無細胞上清は、滴崩壊、油拡散およびエマルジョン形成をもたらしたため、バイオサーファクタントの存在について陽性とスコア付けされた。バイオサーファクタント産生の確認は、無細胞ブロスの表面張力の測定により提供した。ロドコッカスおよびリシニバチルスの増殖のために、培地の表面張力は1メートルあたり59mNから45mNに低下した。パエニバチルスの増殖により、培地の表面張力は1メートルあたり59から28.4mNに低下した。乳化安定性アッセイは、3つの微生物株によって産生されるバイオサーファクタントが、多様かつ環境条件下で大きな安定性を示すことを示した。乳化指数は、インキュベーション温度、pH、および無細胞ブロスの塩濃度が変化した場合、有意な変化を示さなかった。抽出されたバイオサーファクタントのDLC特性評価は、3つの株すべてによって産生されたバイオサーファクタントがグリコリペドであることを示した。バイオサーファクタントの化学的同定は、ロドコッカスとリジンバチルスがラムノリピッドとして同定された同じバイオサーファクタントを、約4つの80ダルトンの質量で産生することを示した。一方、パエニバクチルスは、約802ダルトンの質量を有する3つの脂質鎖を含むラムノリピッドを産生する。バイオサーファクタントの組み合わせは、砂のカラムから残留油の56.5%を回収することができた。ロドコッカス、ルシニバチルス、およびパエニバチルスの株からのバイオサーファクタント産生をアッセイし、そして該株をバイオサーファクタントの産生について陽性とスコア化した。産生されたバイオサーファクタントは、ラムノ脂質として特徴付けられ、同定された。バイオサーファクタントの組み合わせは、サンドパック技術で残留油の56%を回収することに成功したので、バイオサーファクタントの組み合わせは、油貯蔵庫の内部に閉じ込められた残留油を回収するためにフィールド用途で使用することができる。

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Environment

環境

出典: Villela, H. D. M. ほか生物修復のための微生物株の探査およびメタオーガニズム研究・保存のためのプロバイオティクス開発。 J. Vis. Exp.

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