Name: インタクトマウスおよびゼブラフィッシュ脳における深部組織3光子蛍光顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぶ 深部組織3光子蛍光顕微鏡法を用いたマウスおよびゼブラフィッシュ脳の生体イメージング手法。高解像度で深部まで観察でき、アルツハイマーや自閉症などの神経疾患のメカニズム解明に貢献します。

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この研究はNSF DBI-1707312 Cornell NeuroNex HubとNIH 1U01NS103516によって支援された。

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Horton, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+microscopy+of+subcortical+structures+within+an+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain.</a> Nature Photonics. 7 (3), 205-209 (2013).</li>
<li>Wang, T., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+neuronal+imaging+in+deep+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Three-photon neuronal imaging in deep mouse brain.</a> Optica. 7 (8), 947-960 (2020).</li>
<li>Ouzounov, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-photon+imaging+of+activity+of+GCaMP6-labeled+neurons+deep+in+intact+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo three-photon imaging of activity of GCaMP6-labeled neurons deep in intact mouse brain.</a> Nature Methods. 14 (4), 388-390 (2017).</li>
<li>Weisenburger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+Ca2%2B+imaging+in+the+mouse+brain+using+hybrid+multiplexed+sculpted+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Volumetric Ca2+ imaging in the mouse brain using hybrid multiplexed sculpted light microscopy.</a> Cell. 177 (4), 1050-1066 (2019).</li>
<li>Yildirim, M., Sugihara, H., So, P. T. C., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+visual+cortical+layers+and+subplate+in+awake+mice+with+optimized+three-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of visual cortical layers and subplate in awake mice with optimized three-photon microscopy.</a> Nature Communications. 10, 177(2019).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 7 (1), (2020).</li>
<li>Guesmi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+deep-tissue+three-photon+microscopy+with+a+multiband+infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Light%2C+Science+%26+Applications%22%5BJournal%5D)">Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser.</a> Light, Science & Applications. 7, 12(2018).</li>
<li>Hontani, Y., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+three-photon+fluorescence+imaging+with+single-wavelength+excitation+deep+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Multicolor three-photon fluorescence imaging with single-wavelength excitation deep in mouse brain.</a> Science Advances. 7 (12), 3531(2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+deep-brain+structural+and+hemodynamic+multiphoton+microscopy+enabled+by+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo deep-brain structural and hemodynamic multiphoton microscopy enabled by quantum dots.</a> Nano Letters. 19 (8), 5260-5265 (2019).</li>
<li>Chow, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+three-photon+imaging+of+the+brain+in+intact+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-photon+imaging+of+mouse+brain+structure+and+function+through+the+intact+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull.</a> Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).</li>
<li>Xu, C., Webb, W. W. Multiphoton excitation of molecular fluorophores and nonlinear laser microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXu%2C+C+%22Topics+in+Fluorescence+Spectroscopy.+5%22">Topics in Fluorescence Spectroscopy. 5</a>. , Springer. Boston, MA. 471-540 (2002).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (12), e680(2008).</li>
<li>Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł, Radwanska, K., Czajkowski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+two-photon+in+vivo+imaging+of+synaptic+inputs+and+postsynaptic+targets+in+the+mouse+retrosplenial+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Simultaneous two-photon in vivo imaging of synaptic inputs and postsynaptic targets in the mouse retrosplenial cortex.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53528(2016).</li>
<li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e52642(2017).</li>
<li>Gordon, J. P., Martinez, O. E., Fork, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+dispersion+using+pairs+of+prisms%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Negative dispersion using pairs of prisms.</a> Optics Letters. 9 (5), 150-152 (1984).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li>
<li>Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersion+compensation+in+three-photon+fluorescence+microscopy+at+1%2C700+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dispersion compensation in three-photon fluorescence microscopy at 1,700 nm.</a> Biomedical Optics Express. 6 (4), 1392-1397 (2015).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+1300-nm+three-photon+calcium+imaging+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of 1300-nm three-photon calcium imaging in the mouse brain.</a> eLife. 9, 53205(2020).</li>
<li>Cheng, L. -C., Horton, N. G., Wang, K., Chen, S. -J., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+multiphoton+action+cross+sections+for+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Measurements of multiphoton action cross sections for multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3427-3433 (2014).</li>
<li>Huang, K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virtual+reality+system+to+analyze+neural+activity+and+behavior+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish.</a> Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).</li>
<li>Jacobson, G. A., Rupprecht, P., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+odor+representations+in+the+telencephalon+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of odor representations in the telencephalon of zebrafish.</a> Current Biology. 28 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+functional+spatial+maps+in+the+zebrafish+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early development of functional spatial maps in the zebrafish olfactory bulb.</a> Journal of Neuroscience. 25 (24), 5784-5795 (2005).</li>
<li>Barbosa, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+adult+neural+stem+cell+behavior+in+the+intact+and+injured+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain.</a> Science. 348 (6236), 789-793 (2015).</li>
<li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+live+imaging+of+adult+neural+stem+cells+in+their+endogenous+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche.</a> Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).</li>
<li>Kobat, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+multiphoton+microscopy+using+longer+wavelength+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation.</a> Optics Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).</li>
<li>Wang, M., Wu, C., Sinefeld, D., Li, B., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+effective+attenuation+lengths+for+long+wavelength+in+vivo+imaging+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Comparing the effective attenuation lengths for long wavelength in vivo imaging of the mouse brain.</a> Biomedical Optics Express. 9 (8), 3534-3543 (2018).</li>
<li>Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+femtosecond+laser+nanosurgery+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+B%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues.</a> Applied Physics B. 81 (8), 1015-1047 (2005).</li>
<li>Li, B., Wu, C., Wang, M., Charan, K., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adaptive+excitation+source+for+high-speed+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An adaptive excitation source for high-speed multiphoton microscopy.</a> Nature Methods. 17 (2), 163-166 (2019).</li>
<li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16 (10), 106014(2011).</li>
<li>Akbari, N., Rebec, M. R., Xia, F., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+deeper+than+the+transport+mean+free+path+with+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Imaging deeper than the transport mean free path with multiphoton microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 13, 452-463 (2022).</li>
</ol>

著者らは、競合する利害関係を宣言していない。

このプロトコルでは、市販の顕微鏡とレーザー光源を使用して3Pイメージングを設定するための手順を段階的に説明します。2PMと比較して、3PMは、マウス脳海馬などのより深い領域での光アクセスを必要とするアプリケーションにおいて利点を有する。3PMは主に神経科学で使用されていますが、3PMはリンパ節、骨、腫瘍などの他の組織にも深部組織観察のために適用される可能性があります。
イメージングシステムがショットノイズの限界に近い状態で動作し、検出およびデータ集録エレクトロニクスがPMT後の画像に無視できる程度のノイズで寄与することを確認することが重要です。検出される光子の数の不確実性は、光子ショットノイズによって根本的に制限される。ショットノイズ制限性能は、高利得光検出器(例えば、PMT)を使用する典型的な多光子顕微鏡において達成することができる。フォトンショットノイズはポアソン統計分布に従い、分布の標準偏差は分布の平均の平方根に等しくなります。ショットノイズが制限された性能を確認するには、プロトコルセクションのステップ 1.14 に従います。
H2Oによる光減衰を避けるために、浸漬にD2Oを使用することは、特に〜1,700nmの励起に有用である。D2Oを使用する場合、撮像中のD2O/H2O交換を避けるために、約10分ごとにD2Oをリフレッシュするか、大量のD2Oを使用することが不可欠である。また、室内環境3からD2Oを密閉することもできる。長い作動距離(WD)対物レンズ(例えば、4mm以上のWD)を撮像に使用する場合、浸漬液厚は2〜3mmを超える可能性がある。増加した厚さは、H2O吸収を〜1,300nm21でも無視できないものにする。そのため、長尺WD対物レンズを用いる場合には1,300nm3PMに対してもD2Oが必要となり得る。
3P蛍光強度は焦点における励起パルスエネルギーの3乗に依存するため(式(1))、適切なレーザーパワーを設定することは、生体組織における熱的および非線形損傷を回避しながら適切な3P蛍光信号を得るために特に重要である。平均レーザー出力は、熱損傷しきい値未満に抑える必要があります。例えば、マウス脳では、熱組織損傷を避けるために、マウス脳表面の平均電力は、1mmの深さで、視野(FOV)が230μm x 230μm21で〜1,300nmの励起に対して〜100mW以下に保たれるべきである。同様に、~1,700 nmの平均出力は、~1 mmの深さで~50 mW以下、視野は~230 μm x 230 μm(未発表データ)に維持する必要があります。さらに、励起飽和および潜在的な非線形損傷を避けるために、励起パルスエネルギーは、それぞれ〜1,300nmおよび〜1,700nm励起30に対して2nJおよび<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3nJに維持<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">されるべきである。
組織における光吸収および散乱のために、焦点でのパルスエネルギーは、1 EALによる組織の浸透後に1/e(〜37%)に減衰される。EALは、異なる組織および励起波長によって変化し、例えば、マウス脳の新皮質において、EALは、それぞれ〜1,300nmおよび〜1,700nmで〜300μmおよび〜400μmである(図5)。したがって、同じパルスエネルギーをn個のEALの深さで焦点(例えば、1nJ/パルス)に保つには、表面パルスエネルギーに1nJ×enを掛ける必要がある。構造的および機能的ダイナミクスの高速イメージングのためには、高いフレームレート5、6、7、10を達成するために、高い繰り返しレート(1MHz以上)を有する励起レーザが望ましい。ただし、パルスエネルギー要件と平均レーザー出力制限により、適用可能な繰り返し速度が制限されます。
例えば、4つのALA(すなわち、1,300nmの励起でマウス皮質で〜1.2mm)で適度に深い領域を画像化する場合、1nJ/パルスを焦点を合わせ続けるために表面で〜55nJ/パルスが必要です。平均電力制限が100mWの場合、約2MHzのレーザー繰り返しレートを適用できます。しかし、7 EALの深さでより深く画像化するには、焦点が合って1 nJ/パルスを維持するために、表面で約1,100 nJ /パルスが必要です。熱損傷を避けるために最大平均電力が100mWであると仮定すると、表面で1,100nJ/パルスを達成するためには、レーザー繰り返しレートを0.1MHzに低減する必要があります。 表 1は、マウス脳皮質における典型的な画像化条件をまとめたものである。なお、 表 1の撮像深度は、EALがマウス皮質全体で均一であると仮定する。
さらに、深部組織3PMにおけるレーザーパワーの制限のために、フレームレートと画像画素サイズとの間にトレードオフが存在し、これはカルシウムイメージングなどの機能的イメージングにとって特に重要である。利用可能な最大レーザー繰り返し速度は、焦点時の必要なパルスエネルギーと、上記で説明した適用可能な平均レーザー出力(例えば、1,300nm励起で〜4つのEALに相当する深さでの2MHz)に基づいて、各深さで決定されます。一般に、イメージングには、ピクセルごとに少なくとも 1 つのパルスが必要です。したがって、使用可能な最小ピクセル滞留時間は、レーザー繰り返し速度(例えば、2MHz励起で0.5μs/ピクセル)によって決定されます。
画像で高い空間分解能 (横方向で約 1 μm) を維持するには、1 ピクセルを約 1 μm 2 の領域に設定するのが理想的です (たとえば、250 x 250μm 2 の FOV に対して 256 x 256 ピクセル)。したがって、かなり大きなFOV(例えば、256 x 256ピクセルで250 x 250 μm 2)で高速イメージングを実行するには、0.5 MHz、1 MHz、および2 MHzのパルス繰り返しレートは、それぞれ〜7.6、〜15、および〜30フレーム/秒の理論上の最大フレームレートを与える。同様に、レーザー繰り返し速度の最適化は、ターゲット深度、スキャン速度、およびFOVに応じて、熱損傷閾値の下で適切なパルスエネルギーを適用するために不可欠です。画像化速度を増加させるために、適応励起源を使用して、ニューロン31にオンデマンドでレーザーパルスを送達することによって、すべての励起パルスをニューロン(すなわち、関心領域)に集中させることができる。
3PMは、生体組織内の深部イメージングや、マウス脳の頭蓋骨、骨、白質層(すなわち、外部カプセル)などの散乱性の高い媒体を介した深部イメージングにおいて、2PMと比較すると有利である。EALが長く、3PEの高次非線形励起が長いほど、深部組織イメージングに利益をもたらします。例えば、マウス皮質のGCaMP6を画像化すると、920 nmの励起を伴う2P蛍光シグナルは、690 μmの浅い領域 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">における1,300 nm励起を有する3P蛍光シグナルよりも高い(すなわち、1,300nmで〜2.3 EAL)21。しかし、920nmと比較して1,300nmでのEALが長いため、3PEは〜690μmの深さおよびより深い21で2P励起(2PE)よりも強い蛍光を与える。この深さは「シグナルクロスオーバー深さ」として定義され、2PEおよび3PEの蛍光信号強度は同じ繰り返し速度および同じ最大許容平均乗21で同一である。信号クロスオーバー深度は、2PEと3PEの励起波長と蛍光色素分子によって異なります。
実際には、920nm励起は、吸水率が低いため、1,300nm励起よりも高い平均レーザー出力を可能にします。ただし、平均検出力が2PEが高いほど、信号クロスオーバー深度は0.9 EAL4だけ押し上げられます。さらに、サンプルが高密度に標識されている場合、3PEははるかに高いSBRという追加の利点を有する。したがって、信号クロスオーバー長に達する前であっても、2PMよりも3PMの方がイメージングに適している可能性があります。例えば、〜2%の体積分率(すなわち、標識密度)を有するマウス脳血管系を画像化する場合、フルオレセインについて〜700μmの深さで200mWの励起電力を有する1,300nmの3PMが、100mWの励起電力を有する920nm2PMを上回る。
3PMはまた、励起ビームの点像分布機能を歪め、デフォーカス背景4を生成する可能性がある、薄いが散乱性の高い層を介して撮像する場合にも利点を有する。例えば、マウス脳の無傷の頭蓋骨を通して、2PM画像は、脳表面13から&lt;100μmの浅い深さにおいても焦点ずれの背景に苦しんでいる。同様のデフォーカス背景が、マウス脳32内の白質を通る1,280nm励起を有する2PMにおいて観察された。したがって、組織を濁った層を通して画像化する場合、標識密度にかかわらず、高コントラストイメージングのためには3PM〜2PMが好ましい。
私たちは最近、3PMのイメージング深度限界が8 EAL33を超えていることを示すビーズファントムと理論分析を報告しました。8つのEALは、マウス皮質における〜1,700nmの励起で〜3mmに相当する。しかし、現在利用可能なレーザーは、マウス脳内で8つのEALを達成するのに十分なパルスエネルギーを持っていません。より強力なレーザーのさらなる開発は、現在のイメージング深度限界である3PMを押し上げるでしょう。

生命科学では、2PMや3PMなどの多光子顕微鏡(MPM)技術は、散乱組織において高い時空間分解能と高いコントラストを備えた深部in vivoイメージングのための強力なツールとなっています。さらに、これらの方法は、1光子共焦点顕微鏡1、2、3、4と比較して、より少ないフォトブリーチングを引き起こす。3PMは、(i)より長波長励起(〜1,300nmまたは〜1,700nm)の採用が組織散乱を減少させ、および(ii)高次励起プロセス(すなわち、蛍光シグナルが2PMにおける励起電力の2乗ではなく、3PMにおける励起電力の3乗に依存する)の2つの主要な特徴のために、2PMと比較してより深い組織イメージングに有利である3.その結果、3PMは、無傷の成体マウス脳3、5、6、7、8、9、10、11およびCa2+を含む成体ゼブラフィッシュ12の前脳全体における海馬などの生体組織のより深い領域での高コントラストイメージングを可能にする。 アクティビティの記録と多色の観察。さらに、マウスおよび成体のゼブラフィッシュ12、13の無傷の頭蓋骨を通して3PMで高コントラストの画像が得られている。
今日、〜1,300および〜1,700nmでの3P励起(3PE)に適した励起レーザー光源が市販されている。レーザースキャニングシステムは2PMと3PMで本質的に同じであるため、3PE用の市販のレーザーを設置することで、生物学研究室で既存の2Pセットアップを3Pセットアップに変換することができます。3P蛍光信号は、対物レンズのレーザーパワー、パルス持続時間、レーザー繰り返し速度、および開口数(NA)に依存する。回折制限焦点(すなわち、対物レンズの背面開口が励起ビームによって過充填される)を仮定すると、Eq(1)は、3PEから生じる焦点体積からの時間平均化された蛍光光子束を記述する。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq01v3.jpg"> (1)
ここで、fはレーザー繰り返し速度、τはレーザーパルス持続時間(半値全幅)、φはシステム収集効率、ηは蛍光量子効率、σ3は3P吸収断面、Cは蛍光色素濃度、n0は試料媒質(例えば水)の反射指数、λは真空中の励起波長、 NAは対物レンズの開口数、3は焦点体積の空間積分定数、対物レンズ下の時間平均励起光子束(光子/s)、zは結像深度、<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63213/62313eq02.jpg">EALは有効減衰長14である。ここでは、EAL(通常は100μm&gt;)が顕微鏡の軸方向分解能(通常は10μm&lt;)よりもはるかに大きいと仮定しました。近軸近似では、a3 は 28.114 に等しくなります。gp(3) は励起源の 3次時間コヒーレンスであり、gp(3) は双曲線 - 正割二乗パルスとガウスパルスでそれぞれ 0.41 と 0.51 です。φ集光効率は、対物レンズによる蛍光の捕集、対物レンズの透過率、ダイクロイックミラーの反射率、フィルタの透過率、検出器(例えば、光電子増倍管、PMT)の検出効率などを考慮することにより推定することができる。3P蛍光強度は様々なパラメータに大きく依存するため、3P蛍光シグナルを最大化するには3Pセットアップの最適化が必要である。
このプロトコルは、典型的な3Pセットアップの最適化プロセスを示しており、特に2Pセットアップを持ち、その機能を3Pイメージングに拡張したり、商用3Pセットアップを最適なパフォーマンスで維持したりする生物学研究所に役立ちます。このビデオ記事はまた、生きている動物の脳における深部組織3Pイメージングを示しています。最初のセクションでは、市販のレーザー光源と多光子顕微鏡による典型的な3Pセットアップの最適化について説明します。第2および第3のセクションでは、ニューロンの構造および活動の3PMに対するゼブラフィッシュおよびマウスの調製についてそれぞれ説明する。マウス開頭手術は、プロトコル論文でも以前に報告されている15,16,17.第4のセクションでは、ゼブラフィッシュとマウスの脳における生体内3Pイメージングを実証します。

<table><tbody><tr><td>5% ポビドンヨード</td><td>Amazon</td><td>NDC 67818-155-32</td><td>手術部位の知覚的洗浄</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>CAS 64-17-5</td><td>手術部位の知覚的洗浄</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ</td><td>A4718-256</td><td>ゼブラフィッシュチャンバーの準備</td></tr><tr><td>アトロピン</td><td>コーネル獣医ケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベルガモII</td><td>ソーラブス</td><td></td><td>多光子イメージング顕微鏡</td></tr>ブ<tr><td>ピバカイン</td><td>コーネル獣医ケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>コーネル獣医ケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドーナツ型ガラス(ID4.5、OD6.5)</td>開頭眼軟膏(または局所眼科軟膏)に使用される<td>ポトマックフォトニクス</td><td></td><td>カバーガラス</td></tr><tr><td></td><td>Puralube Vet軟膏</td><td>NDC 17033-211-38</td><td>手術や麻酔中の刺激を防ぐための潤滑剤や眼の乾燥を和らげる潤滑剤として使用されます</td></tr><tr><td>GaAsP 増幅 PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMT2100</td><td>PMT検出器</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>コーネル獣医ケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グリコピロレート</td><td>コーネル獣医ケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒーター (800 W)</td><td>ゼブラフィッシュ水用</td><td>フィネックス</td><td></td>水族館ヒーター)</tr><tr><td>イソフルラン USP 250 mL</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-0013-25</td><td>マウスの麻酔用</td></tr><tr><td>ケトプロフェン</td><td>コーネル獣医ケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td></td><td>ゼブラフィッシュを調製するための研究所組織</td></tr><tr><td>36 G針</td><td>WPI</td><td>NANOFIL + NF36BV</td><td>臭化パンクロニウム注射用注射器と針</td></tr><tr><td>光学接着剤</td><td>ノーランド</td><td>NOA68</td>丸<td>いカバースリップとドーナツ型のガラスを一緒に貼り付けます。</td></tr><tr><td>臭化パンクロニウム</td><td>コーネル獣医ケア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>元素科学</td><td>ESI MP2</td><td>ゼブラフィッシュ用ウォーターポンプ</td></tr><tr><td>セットアップ ポリエチレンチューブ (内径 0.58 mm、外径 0.965 mm)</td><td>元素科学</td><td>MP2ポンプチューブ</td><td>ゼブラフィッシュの口に入るチューブ</td></tr><tr><td>ラウンドカバースリップ ジャーマングラス#1.5、5mm</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>7229605</td><td>開頭術に使用されるカバーガラス</td></tr><tr><td>スピリットNOPA</td><td>スペクトル物理学</td><td></td><td>チューナブル光パラメトリック増幅器</td></tr><tr><td>SR400</td><td>スタンフォードリサーチシステム</td><td>ズ SR400</td><td>フォトンカウンター</td></tr><tr><td>標準的なフォトダイオード パワー センサー</td><td>Thorlabs</td><td>S122C</td><td>パワー検出器</td></tr><tr><td>滅菌されたリン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)</td> <td>ミリポア シグマ</td><td>SKU 806552-500ml</td><td>マウスの脳手術中に使用</td></tr><tr><td>外科用ドレープ</td><td>Dynarex 使い捨てタオル ドレープ</td><td>4410</td><td>知覚的なマウス手術用</td></tr><tr><td>薄いストリップ ボクシング ワックス</td><td>コーニング ラバー株式会社</td><td></td><td>ゼブラフィッシュチャンバー内のチューブを所定の位置に保持</td></tr><tr><td>ThorImage</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>画像取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>Tricaine (Ethyl-m-aminobenzoate methanesulfonate salt)</td><td>MP</td><td>103106</td><td>ゼブラフィッシュの麻酔と安楽死</td></tr><tr><td>タイゴンチューブ (I.D. 1/16 in., O.D. 1/8 in.)</td><td>ゼブラフィッシュの準備のための水流のための</td><td>タイゴン</td><td></td>チューブ</tr><tr><td>VaporGuard</td><td>VetEquip</td><td>931401</td><td>イソフルランのリサイクル用</td></tr><tr><td>Vetbond組織接着剤</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>マウスの頭蓋骨のガラス窓を接着し、魚を準備するときに実験組織を接着します。</td></tr><tr><td>XLPLN25XWMP2</td><td>オリンパスの</td><td></td><td>多光子励起専用対物レンズ</td></tr></tbody></table>

インタクトマウスおよびゼブラフィッシュ脳における深部組織3光子蛍光顕微鏡

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

2光子顕微鏡(2PM)や3光子顕微鏡(3PM)などの多光子顕微鏡技術は、細胞内分解能で深部組織 in vivo イメージングのための強力なツールです。3PMは、生物学実験室で広く使用されている2PMを超える深部組織イメージングに2つの主要な利点を有する:(i)〜1,300nmまたは〜1,700nmの励起レーザーを採用することにより、散乱組織における減衰長が長くなる。(ii)高次非線形励起によるバックグラウンド蛍光発生が少ない。その結果、3PMは、皮質層から海馬および成体ゼブラフィッシュの前脳全体まで、無傷のマウス脳などの散乱組織の奥深くにある高コントラストの構造的および機能的イメージングを可能にする。
今日、3PMに適したレーザー光源が市販されており、既存の2光子(2P)イメージングシステムを3光子(3P)システムに変換することができます。さらに、複数の市販の3P顕微鏡が利用可能であるため、この技術は生物学研究所で容易に入手可能です。この論文は、典型的な3PMセットアップの最適化、特にすでに2Pセットアップを持っている生物学グループを標的とし、無傷のマウスおよび成体のゼブラフィッシュ脳における生体内3Dイメージングを実証する。このプロトコルは、顕微鏡アライメント、約1,300および〜1,700nmのレーザーパルスのプレチャーピング、動物の準備、および成体のゼブラフィッシュおよびマウス脳の深部における生体内3P蛍光イメージングを含む、3Pイメージングの完全な実験手順をカバーしています。

このプロトコールが正常に完了すると、最適な光パラメータ(例えば、パルス持続時間、NA)および in vivo 3PMに適した動物調製物を有する適切に整列された顕微鏡が得られる。市販の3Pセットアップは、〜1,300nmおよび〜1,700nmの両方に適切なミラーおよびレンズを含む。したがって、励起波長を1,300nmと1,700nmの間で切り替えても、光学系の変化は必要ありません。3Pセットアップのレンズに1,300および1,700nmの適切なコーティングがない場合は、レーザー出力損失を低減するために適切なコーティングに交換する必要があります。最適化された3PMと適切な動物調製により、高コントラストの in vivo 蛍光およびTHG画像を脳の奥深くに収集することができます。
図3は、無傷の成体ゼブラフィッシュの代表的な3P画像を示す。成体ゼブラフィッシュ脳内の遺伝子標識ニューロンの高解像度、非侵襲的、および深いイメージングは、3PMを使用して達成される。成体のゼブラフィッシュ脳では2PM24,25,26,27を用いた間脳領域のイメージングが報告されているが、3PMは、間脳全体および他の技術を用いて観察することがより困難または不可能な領域へのアクセスを可能にする。視蓋および小脳における細胞層の分布は、図3Cで観察することができる。成功したイメージングセッションでは、骨はTHGチャネルで見え、ニューロンは蛍光チャネルで見える。成体のゼブラフィッシュイメージングのために、顕微鏡のカメラ機能を使用して魚の位置を特定した(図3A)。このステップは、ガラス窓が脳に簡単にアクセスできるようにするのに十分な大きさであるため、マウスの脳イメージングには必要ありません。成体ゼブラフィッシュ脳の高解像度構造画像は、前のセクションで説明したシステムを使用して得られた。頭蓋骨はTHGチャネルで見られ(図3B)、脳をナビゲートして上面を見つけるのに役立ちます。図3Cで観察されるように、ニューロンは、成人脳の深部において高いシグナル対バックグラウンド比(SBR)で区別可能である。脳の上の組織は、自己蛍光のために蛍光チャネルで見える。
図4は、1,340nm励起を有する成体マウス脳におけるGCaMP6s標識ニューロン(緑色)およびテキサスレッド標識血管(赤色)の多色3P画像とTHG(青色)信号を示す10。画像は前作10から再現したものです。図4では、焦点でのパルスエネルギーは、十分な蛍光およびTHGシグナルを得るために、深さ全体で〜1.5nJに維持され、最大平均レーザーパワーは約70mWであった。パルス持続時間は〜60fsに調整され、有効NAは〜0.8であった。3PMセットアップの最適化により、CA1海馬領域において、脳表面から1.2mmまでの高コントラスト画像が正常に得られた(図4A、B)。図4C,Dは、10分間の記録セッションで750μmの深さにおけるGCaMP6s標識ニューロンのCa2+活性痕跡を示し、高い記録忠実度を示す。
励起レーザの位置がずれていると、視野全体の信号輝度に不均一性が観察されることがあります。さらに、パルス持続時間、焦点時の励起パルスエネルギー、および有効NAなどのレーザーパラメータが最適化されていない場合、魚の頭蓋骨またはマウス脳の開頭窓からのTHG画像は見えず、および/または高い励起パルスエネルギー(例えば、焦点での&gt;2nJ/パルス)を必要とする。したがって、脳表面のTHG信号は、深部組織イメージングを開始する前に、最適化された3PMセットアップの指標として使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5.jpg"> 図1:3PMセットアップの概略図 励起レーザーの波長は、〜1,300nmまたは〜1,700nmに設定され、NOPAのアイドラーポートから出力される。プリズム対コンプレッサとSiプレートコンプレッサは、それぞれ〜1,300nmおよび〜1,700nmのレーザに使用され、励起レーザパルスを予感させる。〜1,300nmおよび〜1,700nmのレーザービームは、フリッパーミラーで切り替えることができます。NOPA の信号ポートは、トリガー信号を取得するために使用されます。半波長板とPBSを使用して励起電力を制御します。蛍光とTHGはGaAsP PMTによって検出されます。蛍光シグナルとTHGシグナルを分離するために、ダイクロイックミラーとバンドパスフィルターの適切な組み合わせが使用されます。略語: 3PM = 3光子顕微鏡;NOPA = 非共線光パラメトリックアンプ;PBS = 偏光ビームスプリッタ;THG = 第3高調波生成;DAQ = データ集録;PMT = 光電子増倍管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig1v5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5.jpg"> 図2:魚のインタビタルイメージングの代表的なスクリーンショット(プロトコルセクション4.1)。 (A)4倍の対物レンズを配置した画像取得ソフトウェアのカメラモードビュー。ソフトウェアの主な機能は、次のように概説され、番号が付けられています:1.画像取得ソフトウェアのイメージングモード。モードオプションは、カメラ、マルチフォトン、マルチフォトンGGです。 CCDカメラによる白色光イメージングでは、カメラモードが選択されます。2. Liveボタンをクリックすると、カメラ(または多光子オプションの場合はPMT)がオンになり、顕微鏡のリアルタイムビューを観察できます。3. キャプチャ設定タブでは、目的のイメージングパラメータ(電力、位置、深度)が設定されます。4. [キャプチャ]タブでは、保存する画像のフォルダの場所が割り当てられます。イメージングは、このタブで開始できます。Z コントロール設定は、z ステージモーターを動かしてイメージングの深度を制御します。6.ゼブラフィッシュの頭の代表的な画像。頭の吻側は左側にあります。(B)25倍の対物レンズを備えたカメラモードの代表的なビュー。(C)(B)に見られる画像のTHG像を含む多光子GGモードの代表的な図。略語: CCD = 電荷結合素子;PMT = 光電子増倍管;THG = 第3高調波生成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig2v5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5.jpg"> 図3:画像取得ソフトで取得した成体ゼブラフィッシュ脳の代表画像。画像の上部は吻側の方向です。OT ローブと CB の概要が示されています。(B)(A)のTHG像を含む25倍の対物レンズを用いて多光子GGモードで取得した代表像。(c)様々な深さのニューロンの細胞質にGFPが発現している小脳と視蓋の交点における成体ゼブラフィッシュ脳の蛍光画像。スケールバー = 100 μm。略語: OT = オプティックテクタム;CB = 小脳;THG = 第3高調波生成;GFP = 緑色蛍光タンパク質。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig3v5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5.jpg"> 図4:マウス脳で1,340 nm励起したときのGCaMP6s標識ニューロン(緑)、テキサスレッド標識血管(赤)、および第三高調波生成(青)の多色3 PM。 (A)270 x 270 μm(フレームあたり512 x 512ピクセル)の視野で脳表面から1,200 μmまでのZスタック画像。レーザー出力は、焦点で〜1.5nJパルスエネルギーを維持するために、イメージング深度に応じて変化させた。目標の下での最大平均出力は70mWであった。(B)様々な撮像深度で選択された2D画像。(C)270 x 270 μm(256 x 256ピクセル)の視野を有する硬膜下750μmの活動記録部位。(d)(C)に示される標識ニューロンから覚醒マウスに記録された自発的な脳活動痕跡。フレームレートは8.3Hzで、ピクセルドウェルタイムは0.51μsでした。レーザーの繰り返し速度は2MHzであり、対物レンズ下の平均パワーは56mWであった。各トレースはベースラインに正規化され、時定数0.72秒のハミングウィンドウを使用してローパスフィルタリングされました。スケールバー = 50 μm。このフィギュアとフィギュア凡例を10から再現。略語:3PM = 3光子顕微鏡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig4v5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63213/63213fig05.jpg"> 図5:マウス脳の新皮質における有効減衰長。EALは、組織散乱(赤線)と組織中の吸水率(青線)から、75%の水分組成を想定して算出される。黒い星は、マウス脳の新皮質におけるEALの報告された実験データを示す3、21、28、29。EALは組織によって異なることに注意してください。省略形: EAL = 有効減衰長。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63213/63213fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>励起波長 (nm)</td>
			<td>浸漬水</td>
			<td>最大レーザー出力 (ミリアンペア時)</td>
			<td>フォーカス時の最大パルスエネルギー* (日本)</td>
			<td>マウス皮質における典型的なEALの (μm)</td>
			<td>マウス皮質のイメージング深度** (ミリメートル)</td>
			<td>目標の下のパルスエネルギー*** (日本)</td>
			<td>最大レーザー繰り返し速度**** (メガヘルツ)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1300</td>
			<td rowspan="4">H2OまたはD2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">100</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">2</td>
			<td rowspan="4">~300</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~14</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~55</td>
			<td>~2</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~210</td>
			<td>~0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~1100</td>
			<td>~0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">1700</td>
			<td rowspan="4">D2O</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">50</td>
			<td rowspan="4">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63213/63213eq03v2.jpg">3</td>
			<td rowspan="4">~400</td>
			<td>0.8</td>
			<td>~7</td>
			<td>~7</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>~20</td>
			<td>~2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.6</td>
			<td>~55</td>
			<td>~1</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.1</td>
			<td>~190</td>
			<td>~0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:マウス皮質イメージングのための典型的な3P励起条件。 *高いNA(〜1.0)対物レンズ、〜50fsのパルス幅、および蛍光タンパク質(GFPおよびRFPなど)などの典型的な蛍光色素。 ** EALが皮質全体で均一であるという前提で。 焦点で〜1 nJ /パルスを達成するために、EALとイメージング深度から計算されます。 対物レンズの下のパルスエネルギーと最大許容レーザー出力から計算されます。 略語: = 3光子;NA = 開口数;GFP = 緑色蛍光タンパク質;RFP = 赤色蛍光タンパク質;EAL = 有効減衰長。

3光子顕微鏡は、マウスやゼブラフィッシュの脳などの生体組織の奥深くで、高い時空間分解能で高コントラストの蛍光イメージングを可能にします。

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

このプロトコルは、マウス脳および成体ゼブラフィッシュにおいてインビボ深部組織三光子顕微鏡検査を行う方法を示す。生命科学における2つの重要なモデルシステム。長波長3光子顕微鏡は、2光子顕微鏡ではアクセスできない深さの無傷の組織または器官のin vivo高空間分解能イメージングを可能にする。この技術は、アルツハイマー病や自閉症など、病気が脳にどのように影響するかを完全に理解していない神経学的疾患の根底にあるメカニズムを理解するのに役立ちます。マウスの脳イメージング手順の実演は、当研究室のポスドク研究員であるKibaek Choe氏、ゼブラフィッシュの脳イメージング手順の実演は、フェッチョ研究所の助手であるクリスティン・コルクマン氏です。まず、レーザーの電源を入れ、非共線光パラメトリックアンプのアイドラー出力の中心波長を1、300または1、700ナノメートルに設定し、パルスコンプレッサーを光路に配置してフェムト秒レーザーをプリチャープし、3光子イメージングのパルス持続時間を最適化します。シリコンプレートとレーザーパスの間の角度をブリュースターの角度に設定してレーザー透過率を最大化し、シリコンプレートを回転させて反射を最小限に抑えてブリュースターの角度を実現します。次に、フリッパーミラーを配置して、1、300、1、700ナノメートルのビームラインを便利に切り替えます。回転ステージに取り付けられた半波長板と偏光ビームスプリッターを配置してレーザーの強度を制御し、ビームスプリッターの反射経路にビームブロッカーを配置します。0.5センチメートルの2%高融点寒天を含むペトリ皿を準備する。寒天が冷えて固まったら、寒天の長方形の穴を魚よりも長く、わずかに広く切ります。ワックスを使用して、細いチューブを長方形に、より大きな直径のチューブをペトリ皿の端に取り付けます。次に、魚を1ミリリットルあたり0.2ミリグラムのトリカイン溶液に入れて麻酔をかけ、麻酔をかけた魚を濡れたスポンジの上に置き、次にマイクロシリンジを使用して、3マイクロリットルの臭化パンクロニウムを後眼窩に注入して魚を麻痺させ、ハンクスの溶液に短時間入れて完全に麻痺していることを確認する。次に、魚の背側をペトリ皿に上げて頭をチューブの方に置き、鉗子を使って魚の口を静かに開き、チューブを口の中にスライドさせます。チューブが魚の口の後ろに来るように、魚をチューブに向かって静かにスライドさせます。素早く、しかし穏やかに、魚の周りの寒天を乾燥させ、魚の上に水を取り除きます。実験組織の小片を実験室の接着剤に浸し、魚の両側と魚の後ろの尾からえらまでの寒天の上に組織を置きます。次に、頭の表面に直接ブピバカインの小さな滴を置いて魚の皮膚を麻酔し、魚の入ったペトリ皿を顕微鏡に持って行きます。魚の施設の水で皿を満たし、チューブをウォーターポンプに接続して、魚の口にシステム水をポンプで送り込みます。水がバブラーで酸素化され、水槽のヒーターで摂氏30度に温められていることを確認してください。イメージングのために、3光子顕微鏡上に低倍率対物レンズを置き、魚とチューブを含むペトリ皿を顕微鏡下に置き、LED光源を使用してペトリ皿を照らす。画像取得ソフトウェアから、カメラモードを開き、[ライブ]をクリックし、画面の右側にあるチャンネルAを選択して、ヒストグラム設定を調整して画像が鮮明に表示されます。モーターコントローラーのモーター設定をベースに設定したら、魚が見えるまで目標を下げます。魚の頭の中心を視野の中心に置き、目標を魚の頭から上へ動かします。低倍率対物レンズを高開口数対物レンズに交換して3光子イメージングを行い、魚の頭に近づけます。すべてのモーターの軸値をゼロに設定します。対物レンズをゆっくりと下げ、対物レンズが頭部に物理的に接触しないようにします。CCDカメラソフトウェアでは、頭頂部が見えたら対物レンズの動きを止め、X、Y、Zの位置をゼロに設定します。LED光源をオフにしてシステムの周りの暗いカーテンを閉じてから、イメージング取得ソフトウェアを3光子イメージング用のマルチフォトンGGモードに設定し、対物レンズの下のパワーを1ミリワット未満に設定します。画像取得ソフトウェアの[ライブ]ボタンをクリックします。PMTチャンネルを開き、必要に応じてPMTゲインとバックグラウンドレベルを調整します。対物レンズをゆっくりと上に移動し、大血管と窓ガラス表面からのTHGチャネルを監視して、頭部の表面を見つけます。対物レンズを窓に近づけた後、対物レンズと頭蓋窓の間に水をかけ、すべてのモーターの軸値をゼロに設定します。画像取得ソフトウェアの[ライブ]ボタンをクリックします。PMTチャンネルを開き、必要に応じてPMTゲインとバックグラウンドレベルを調整し、対物レンズをゆっくりと上に移動して、大血管と窓ガラス表面からTHGチャンネルを監視して、カバースリップの表面を見つけます。必要に応じて窓の向きを調整し、モーターをゼロにして脳の表面を定義します。イメージングを行い、撮影深度に応じてパワーレベルを調整します。成体ゼブラフィッシュ脳内の遺伝子標識ニューロンの高解像度、非侵襲的、および深いイメージングは、3光子顕微鏡を用いて達成される。視蓋および小脳における細胞層の分布も観察することができる。顕微鏡のカメラ機能を使用して魚の位置を特定しました。頭蓋骨はTHGチャネルで見られ、脳をナビゲートして上面を見つけるのに役立ちます。ニューロンは、成人の脳の奥深くで高いシグナル対バックグラウンド比で区別可能です。成体マウス脳におけるGCaMP6s標識ニューロンおよびテキサスレッド標識血管の多色3光子像とTHGシグナルを併せて示す。セットアップの最適化により、CA1海馬領域の脳表面から1.2ミリメートルまでの高コントラスト画像を得ることに成功しました。10分間の記録セッションで750マイクロメートルの深さにあるGCaMP6s標識ニューロンのカルシウム活性痕跡は、高い記録忠実度を示した。この設定は、脳機能を理解するためにニューロン活動を視覚化するのに役立ちます。また、様々な生物学的システムを理解するために、生物学的組織内の細胞の動きを追跡するために使用することができます.さらに、血流速度を測定して動物の健康状態を監視することもできます。

deep-tissue-three-photon-fluorescence-microscopy-intact-mouse

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目覚めしたゼブラフィッシュ幼虫と頭蓋骨と皮膚除去による若年組織の完全に活性な脳組織のインビボイメージング

この研究は、マウスへの反復性外傷性脳損傷の送達と、2光子顕微鏡を使用したニューロン発現EGFPのその後の生体内イメージングのための頭蓋窓の同時移植を示しています。...

2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング

ここでは、3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ仔魚の in vivo...

インビボ 3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

本プロトコルには、蛍光発泡スチレン微小球を用いた in vivo 二光子顕微鏡イメージングに最適な慢性頭蓋ウィンドウおよび微小血管塞栓症マウスモデルの段階的アプローチを詳細に記述しています。...

蛍光発泡スチレン微小球を用いた 生体内 2光子顕微鏡用微小血管塞栓症マウスモデル

学ぶ 深部組織3光子蛍光顕微鏡法を用いたマウスおよびゼブラフィッシュ脳の生体イメージング手法。高解像度で深部まで観察でき、アルツハイマーや自閉症などの神経疾患のメカニズム解明に貢献します。

インタクトマウスおよびゼブラフィッシュ脳における深部組織3光子蛍光顕微鏡

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