Name: カンナビノイド前臨床試験のための昆虫モデルシステムとしてのタバコホーンワーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 学ぶカンナビノイド前臨床試験のための昆虫モデルシステムとしてのタバコホーンワームManduca sextaの飼育とCBD処理方法。成長、摂食量、運動性の評価により、カンナビノイドの急性および長期的影響を効率的に解析できます。

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この研究は、コロラド州立大学プエブロ校の大麻研究所と科学・ICT省(2021-DD-UP-0379)、チュンチョン市(2020-2021年)によって支援されました。

1. ホーンワームの準備とカンナビジオールの治療
<ol><li>150-200実行可能な Mを得る。 セクスタ 卵と小麦胚芽ベースの人工食( 資料表を参照)。</li>
	<li>ホーンワームの卵を小麦胚芽ベースの人工食(AD)層を持つポリスチレンペトリ皿に入れ、40%〜60%の相対湿度で25°Cに維持された昆虫飼育室( 材料表を参照)に卵を移します。</li>
	<li>タバコの角虫の卵を1〜3日間、40%〜60%の相対湿度で25°Cに保った昆虫飼育室内で孵化させます。</li>
	<li>20 mLのEtOH(200証明)または100%中鎖トリグリセリド(MCT)油( 材料表を参照)に1.26gの>98%純度CBD分離物を加えることによって、カンナビジオール(CBD)ストック溶液(200 mM)を調製する。 注:CBD分離は光に敏感なので、暗い時に扱います。</li>
	<li>200 mM CBD ストック溶液の 5 mL と 10 mL を AD の 1,000 g に加え、それぞれ 1 mM と 2 mM のダイエットの最終濃度を CBD に加えます。 注:完全に均一な混合物が形成されるまで、ダイエットとCBDストック溶液が十分にブレンドされていることを確認してください。CBDの在庫を含むADを手で少なくとも45分間ビニール袋に入れ、ブレンドしてください。 注意:コーヒーミキサーまたは他の金属グラインダーは効果がないように見えました。</li>
	<li>3つの媒体の20gを分配し、制御(AD)、車両(AD+ 0.1%のEtOHまたはMCTオイル)、およびCBD含有媒体(AD + 0.1%のEtOHまたはMCTオイル+CBDの1mM/2 mM)を50mLチューブの底部に塗布する。</li>
	<li>1番目のインスター幼虫(長さ約2mm)を50mLの試験管にランダムに分散させ、穿孔蓋またはチーズクロスで覆います( 材料表参照)。 注:チューブを逆さまに置き、40%〜60%の相対湿度で25°Cを維持した昆虫飼育室で昆虫を育ててください。</li>
	<li>12時間の明暗サイクルで25°Cに維持された昆虫飼育室( 材料表を参照)内で成長させます。</li>
</ol>2 . M. 六者 幼虫の成長、食事消費量、死亡率測定
<ol><li>幼虫の成長(すなわち、サイズと重量)を、個々の容器に移された後、硬くなった外皮層の濃褐色化として認識されるまで、2日間間隔で分析的バランスと死亡率を測定する。<ol>
<li>それぞれの食事に幼虫を導入する前に幼虫の各グループの最初の質量(グラム)を記録し、幼虫が子犬の段階を完了するまで幼虫発生段階間の質量利益を決定するために、最初の質量から各測定で幼虫の質量を差し引きます。</li>
		<li>各食事療法の子犬までの幼虫の成長段階間の発達時間枠の違いを理解するために、インスター発達段階間の日数を記録します。 注:カビの汚染を避けるために、容器から便の物質を削り取ります。実験目的に依存する将来のテスト(例えば、CBD蓄積率の計算、微生物プロファイリング)のために問題を収集します。ア多項異症またはエクスダイシスの脆弱な時期に、昆虫を注意深く扱うことが重要です。容器から幼虫を取り出すときは、平らな先端と広い鉗子で昆虫の本体をそっとつかみ、昆虫が脱落する過程で皮膚の外層を取り除くことを強制しない。</li>
	</ol>
</li>
	<li>第1インスター幼虫と子犬との間の容器の食生活損失を比較検討することによって食餌消費量31を測定する。実験の開始時にダイエットの最初のグラムを記録し、幼虫が完全な子犬の段階に入ったときの食事の残量から初期量を差し引きます。 注:便の物質は、ダイエットの測定から除外する必要があります。便の物質および他の破片(すなわち、皮の小屋)は容器を上下逆に置くことによって媒体から容易に取除くことができる。</li>
	<li>移動性測定では、受けた昆虫が少なくとも5分間チャンバー環境に順応し、5番目のインスター昆虫の3つのグループ(長さ80〜100mm)が自動化されたコンピュータ化された恐怖調節室を使用して移動した距離31を追跡することを可能にする(材料表を参照)。</li>
	<li>モーションインデックスを生成するモーション検出ソフトウェア(材料表を参照)を使用して、5分間の60フレーム/sを記録したビデオを通じてモビリティレスポンス31を解析します。</li>
</ol>3. 統計分析
<ol><li>歯の成長(サイズと重量)と運動指数の違いをTukeyの事後test32で一方行ANOVAで分析します。</li>
	<li>生存曲線の比較には、ログランク(マンテル-コックス)test33 を使用します。 注:統計解析は、すべて統計解析ソフトウェアを使用して実行されました( 資料表を参照)。</li>
</ol>

<ol><li>Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+attenuates+seizures+and+social+deficits+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).</li>
<li>Leehey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+tolerability+of+cannabidiol+in+Parkinson+Disease%3A+An+open+label%2C+dose-escalation+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cannabis+and+Cannabinoid+Research%22%5BJournal%5D)">Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).</li>
<li>Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+cannabinoids%2C+delta+9-+tetrahydrocannabinol+and+cannabidiol%2C+ameliorates+experimental+multiple+sclerosis+by+suppressing+neuroinflammation+through+regulation+of+miRNA-mediated+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1921(2019).</li>
<li>Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+%28CBD%29+as+a+promising+anti-cancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug.</a> Cancers (Basel). 12 (11), 3203(2020).</li>
<li>Garcia-Morales, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBD+reverts+the+mesenchymal+invasive+phenotype+of+breast+cancer+cells+induced+by+the+inflammatory+cytokine+IL-1beta%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta).</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429(2020).</li>
<li>Jeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+promotes+apoptosis+via+regulation+of+XIAP%2FSmac+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (11), 846(2019).</li>
<li>Devinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-label+use+of+highly+purified+CBD+%28Epidiolex%C2%AE%29+in+patients+with+CDKL5+deficiency+disorder+and+Aicardi%2C+Dup15q%2C+and+Doose+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes.</a> Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).</li>
<li>de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBD+activation+of+TRPV1+induces+oxidative+signaling+and+subsequent+ER+stress+in+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).</li>
<li>Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+and+sertraline+regulate+behavioral+and+brain+gene+expression+alterations+in+an+animal+model+of+PTSD%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 694510(2021).</li>
<li>Aso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol-enriched+extract+reduced+the+cognitive+impairment+but+not+the+epileptic+seizures+in+a+Lafora+disease+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cannabis+and+Cannabinoid+Research%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).</li>
<li>Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+recruitment+and+retention+of+clinical+trial+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Perspectives+in+Clinical+Research%22%5BJournal%5D)">Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects.</a> Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
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<li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+as+biological+models%3A+Practical+steps+for+more+reliable+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li>
<li>Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+antiseizure+efficacy+of+cannabidiol+and+clonazepam+in+a+conditional+mouse+model+of+Dravet+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome.</a> Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).</li>
<li>Orvos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrophysiological+effect+of+cannabidiol+on+hERG+current+and+in+guinea-pig+and+rabbit+cardiac+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16079(2020).</li>
<li>Verrico, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study+of+daily+cannabidiol+for+the+treatment+of+canine+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis.</a> Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).</li>
<li>Barata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+by+cannabidiol+and+hypothermia+in+a+piglet+model+of+newborn+hypoxic-ischemic+brain+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).</li>
<li>Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+agonistic+activity+of+delta+9-11-tetrahydrocannabinol+in+mice%2C+dogs+and+rhesus+monkeys+and+its+interactions+with+delta+9-tetrahydrocannabinol%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).</li>
<li>Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+effects+on+arachidonic+acid+metabolism+of+low+doses+of+cannabidiol+following+oral+administration+to+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Testing+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses.</a> Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).</li>
<li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mighty+Mouse%3A+The+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Missouri+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBD+promotes+oral+ulcer+healing+via+inhibiting+CMPK2-mediated+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome.</a> Journal of Dental Research. , (2021).</li>
<li>Mastinu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosocial+effects+of+nonpsychotropic+Cannabis+sativa+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cannabis+and+Cannabinoid+Research%22%5BJournal%5D)">Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).</li>
<li>Justice, M. J., Dhillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+mouse+to+model+human+disease%3A+increasing+validity+and+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility.</a> Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).</li>
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<li>He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoids+modulate+food+preference+and+consumption+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4709(2021).</li>
<li>Kanost, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+biological+insights+from+a+draft+genome+sequence+of+the+tobacco+hornworm+moth%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).</li>
<li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+roles+of+cannabidiol+as+an+insecticide+and+rescuing+agent+for+ethanol-induced+death+in+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10481(2019).</li>
<li>Tukey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li>
<li>Mantel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+survival+data+and+two+new+rank+order+statistics+arising+in+its+consideration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+Reports%22%5BJournal%5D)">Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration.</a> Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).</li>
<li>Watts, S., Kariyat, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picking+sides%3A+Feeding+on+the+abaxial+leaf+surface+is+costly+for+caterpillars%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars.</a> Planta. 253 (4), 77(2021).</li>
<li>McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptors+in+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptors in invertebrates.</a> Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

摂食研究は、CBDの高用量(2 mM)が昆虫の成長を阻害し、死亡率を増加させたことを実証した31。昆虫モデルはまた、エタノールに対する感受性を示した。しかし、CBDはエタノール毒性を効果的に解毒し、その生存率、食事消費、および食物探索行動を対照群と同様のレベルまで増加させた(図3A、B)31。説明された昆虫モデルシステムは、(1) M.sextaの卵が大きさとタイミングで均一に孵化することを保証し、(2)カンナビノイドと均一にブレンドされた成長培地を標的濃度に調製し、(3)理想的な湿度レベルを維持しながら増殖培地を真菌汚染から解放する3つの重要なステップで構成される。昆虫モデルシステムは、メディアの準備からデータ収集、解釈まで、25日以内に研究課題に取り組む機能を提供しました。最も重要なことは、昆虫システムは、大規模な標本から一貫した結果を生成した。
栽培された M.セ...

過去数年間、てんかん1、パーキンソン病2、多発性硬化症3、カンナビジオール(CBD)を有する癌の様々な形態を含む、治療の可能性のためにカンナビノイドに注目が集まりてきました。 大麻は2018年の農業改善法で農産物として合法化されているため、公法115-334(2018ファーム法案)、大麻およびその食品、化粧品、製薬業界におけるカンナビノイド誘導体が指数関数的に増加しています。さらに、単一のカンナビノイドおよびカンナビノイド混合物の臨床グレードの分離株は、ヒト被験者7、細胞株5、8、および多様な動物モデルシステム9,10で試験に成功した。
臨床試験は、特定の疾患に対するカンナビノイドの有効性および副作用を検証するのに理想的であろう。しかし、臨床試験には、倫理的/IRBの承認、採用、および被験者11の保持を含む多くの課題があります。これらのハードルを克服するために、人間由来の細胞株は費用対効果が高く、取り扱いやすく、倫理的な問題を回避し、細胞株が他の細胞や化学物質の交差汚染を持たない細胞の純粋な集団であるため、様々なヒト細胞株が使用されました。
Alves et al. (2021)13 は、胚移植および脱卵性母体子宮との相互作用に不可欠な役割を果たす胎盤の特殊な細胞である胎盤栄養芽細胞において用量依存的な方法でCBDを試験した。その結果、CBDは細胞生存率の低下、細胞周期進行の中断、アポトーシス誘導を引き起こした。これらの観察は、妊娠中の女性による 大麻 使用の潜在的な負の影響を示す13。同様に、一連の細胞株はまた、ヒト疾患、特に様々な形態の癌におけるCBDの薬理学的効果を調べるためにも使用された。 インビトロ 研究は、膵臓15、乳房8、および大腸癌細胞16における抗癌効果を実証した。しかし、広く利用可能で扱いやすい一方で、HeLa、HEK293などの特定の細胞株は、その成長条件の変化または取り扱い17による遺伝的および表現型の変化を起こしやすい。
カンナビス研究では、mouse18、モルモット19、ウサギ19などの小動物から、イニヌ20、ピグレット21、monkey22、horse23などの大型動物に至るまで、さまざまな動物モデルシステムが未知の治療効果を探求するために使用されてきた。マウスは、解剖学的、生理学的、および遺伝的類似性から、カンナビノイド研究において最も好ましい動物モデルシステムである。最も重要なことは、マウスはヒトに存在する神経系にCB1/2受容体を有する。彼らはまた、人間の被験者よりも短いライフサイクルを持ち、メンテナンスが容易で豊富な遺伝資源を持ち、ライフサイクル全体を通してカンナビノイドの影響を監視することがはるかに容易になります。哺乳動物系は広く使用されており、CBDが発作障害1、心的外傷後ストレス障害9、口腔潰瘍25、および認知症様症状10を緩和することを実証した。マウスモデルはまた、大規模な動物やヒト26では非常に困難であるコミュニティ内の個人の社会的相互作用研究を可能にしました。
動物モデルシステムのすべての利点にもかかわらず、それはまだ高価であり、薬物投与とデータ収集中に集中治療を必要とします。さらに、実験計画やrigor27の制限により、再現性が悪く、人間の状態の再現性が悪いため、研究にマウスを使用する精査があります。
カンナビノイドの医療/前臨床試験の需要が高まっていると、非哺乳類モデルシステムが必要です。無脊椎動物モデルは、伝統的に脊椎動物モデルよりも独特の利点を与えました。重要な利点は、多くの標本を飼育し、研究者が遺伝的に均質な集団の複数の世代を監視することを可能にする容易さと低コストが含まれます28。最近の研究では、フルーツフライ、 ショウジョウバエメラノガスターは、 摂食行動を調節するカンナビノイドの薬理学的機能を調査するための効果的な昆虫モデルシステムであることが証明されました29。昆虫モデルシステムの中で、著者らはカンナビノイド研究のための新しい昆虫モデルシステムとして、タバコの角虫、 マドゥカ・セクスタ(カロライナ・スフィンクス・ガまたはタカガとも呼ばれる)に焦点を当てた。
マドゥカ・セクスタ はスフィンヒダ科の家族のものです。昆虫は、彼らがソラナス植物を食べる米国南部で最も一般的な植物害虫です。昆虫モデルは、昆虫生理学、生化学、神経生物学、薬物相互作用研究の研究に長い歴史を持っています。 Manduca sextaの研究ポートフォリオには、ゲノム配列の草案が含まれており、本質的な細胞プロセス30の分子レベルの理解を可能にする。このモデルシステムのもう一つの重要な利点は、幼虫の開発の18-25日で長さが100ミリメートル以上、重量が10g以上に達する、その大きなサイズです。大きいサイズは研究者が容易にCBDの処置に応じてリアルタイムで形態学的および行動の変化を監視することを可能にする。また、サイズに起因して、高解像顕微鏡設定なしで幼虫から解剖された神経節を含む、腹部神経系で電気生理学的応答を検査した。ユニークな機能により、研究者は投与されたカンナビノイドに対する急性および長期的な反応を容易に調査することができます。
このような汎用性にもかかわらず、M.sextaは最近、大麻およびカンナビノイド研究の実験モデルとしての適合性について検討されました。2019年、著者らは、カンナビスが昆虫草食動物30,31から身を守るためにカンナビジオールを産生するように進化したという仮説に初めて対処するために、昆虫モデルシステムを使用しました。その結果、植物が摂食抑止力としてCBDを利用し、害虫昆虫M.sexta毛虫の成長を阻害し、死亡率31の増加を引き起こしたことが明らかになった。この研究はまた、CBDのキャリアとしてエタノールの潜在的な車両効果を同定し、中毒エタノール幼虫に対するCBDの救出効果を実証した。示されるように、昆虫モデルシステムは、他の動物システムよりも少ない人数とコストで3〜4週間以内にカンナビノイドの治療効果を効果的に調査した。昆虫モデルはカンナビノイド受容体(すなわち、CB1/2受容体なし)を欠いているが、モデルシステムはカンナビノイド受容体非依存的な方法を通してカンナビノイドの薬理学的役割を理解するための貴重なツールを提供する。
この研究の著者は、以前にカンナビノイド研究31のモデルシステムとしてタバコホーンワームと協力してきました。 M.sextaを使用する利点とリスクを慎重に検討した結果、将来の前臨床検査室での使用の機会を可能にする前臨床試験のための食事の適切なケアと準備を含む方法を提供しました。

<table><tbody><tr><td>分析天びん</td><td>メトラー・インストゥルメント・コーポレーション</td><td>AE100S</td><td></td></tr><tr><td>カンナビジオールアイソレート (>99.4%)</td> <td>Lilu's Garden</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cheesecloth</td><td>VWR INTERNATIONAL</td><td>470150-438</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50mL 透明ポリプロピレン (PP) 遠心分離管</td><td>VWR</td><td>89093-192</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール、200プルーフ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EX0276-1</td><td></td></tr><tr><td>フィアーコンディショニングチャンバー</td><td>Coulbournインスツルメン</td><td></td><td></td></tr>ツ <tr><td>昆虫飼育室</td><td>ダーウィンチャンバー</td><td>INR034</td><td></td></tr><tr><td>中鎖トリグリセリド (MCT) オイル</td><td>ウォルマート</td><td></td><td></td></tr><tr><td>モーション検出ソフトウェア (Actimetrics)</td><td>Coulbourn Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンペトリ皿 (120 mm x 120 mm x 17mm)</td><td>VWR INTERNATIONAL</td><td>688161</td><td></td></tr><tr><td>タバコホルムワーム人工ダイエット</td><td>カロライナ生物供給会社</td><td>アイテム#143908</td><td>すぐに使用できるホーンワームダイエット</td></tr><tr><td>タバコホルムワーム卵</td><td>カロライナ生物供給会社</td><td>アイテム#143880</td><td>30-50の単位</td></tr></tbody></table>

カンナビノイド前臨床試験のための昆虫モデルシステムとしてのタバコホーンワーム

Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies

薬のカンナビノイドに対する注目が高まる中、いくつかの哺乳類モデル生物が未知の医薬品機能を解明するために使用されてきた。しかし、哺乳類の研究には多くの困難が残っており、カンナビノイド研究のために非哺乳類モデル生物の開発が必要です。著者らは、タバコの角虫 マドゥカ・セクスタ を新しい昆虫モデルシステムとして示唆している。このプロトコルは、様々な量のカンナビジオール(CBD)で人工食事を準備し、栽培環境を設定し、CBD治療に応じてそれらの生理学的および行動変化を監視する上での情報を提供する。簡単に言えば、ホーンワームの卵を受け取ると、卵は12:12の明暗サイクルで25°Cで1〜3日間孵化させ、無作為に制御に分配される(小麦胚芽ベースの人工食。AD)、車両(AD + 0.1%中鎖トリグリセリドオイル;MCTオイル)および処置群(AD + 0.1% MCT + 1 mMまたはCBDの2 mM)。培地が準備されると、1番目 のインスター幼虫を木製の串刺しで50mLの試験管に個別に入れ、その後、試験管をチーズクロスで覆った。測定は、CBD投与に対する生理学的および行動的応答に対して2日間間隔で測定した。この簡単な栽培手順により、研究者は特定の実験で大きな標本をテストすることができます。さらに、比較的短いライフサイクルにより、研究者は同種集団の複数世代にわたるカンナビノイド治療の影響を研究することができ、より高い哺乳類モデル生物における実験計画をサポートするデータを可能にする。

カンナビノイド毒性を調べるモデルシステムとしてのカンドゥカ・セクスタ 図1 は、タバコホーンワーム ・マドゥカ・セクスタを用いたCBD実験の主要成分を示しています。多数の昆虫(&gt;20)を12時間:12時間=明るい:暗循環で25°Cで個別に飼育した。昆虫の大きさ、重量、死亡率を2日間間隔で測定し、高用量CBD(2mM)治療後の短期および長期応答を監視した。
図2 は、昆虫の成長と発達に対するCBDの悪影響を示す。人工食餌(AD)で飼育された昆虫は、最高の成長性能を示した。CBD分離物の溶解剤として0.1%中鎖トリグリセリド(MCT)油を使用した車両制御も、有害な影響を及ぼすことなく正常な成長を示した。しかし、高用量のCBD(2mM)は体重減少を誘発し(図2C)、対照群および車両群のものよりも...

本プロトコルはカンナビノイド研究でタバコホーンワーム ・カンドゥカ・セクスタ を使用するための教育情報を提供する。 ここで説明する方法には、カンナビジオール(CBD)治療に応答して昆虫モデルの生理学的および行動変化を監視するために必要なすべての供給およびプロトコルが含まれる。

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical ...

このプロトコルは、カンナビノイド前臨床試験のための昆虫モデルシステムとしてタバコホーンワームを使用して提案しています。このシステムは、研究者がカンナビノイドに対する急性および長期的な反応を容易に調査することを可能にする。昆虫モデルシステムは、研究者が他の動物システムよりも少ない人数とコストで3〜4週間以内に大規模な集団におけるカンナビノイド治療効果を調査することを可能にする。150〜200個の実行可能なM.sexta卵と小麦胚芽ベースの人工食を得る。小麦胚芽ベースの人工ダイエット層を備えたポリスチレンペトリ皿にホーンワームの卵を入れ、40〜60%の相対湿度で摂氏25度に維持された昆虫飼育室に卵を移します。卵が昆虫飼育室の中で1〜3日間孵化することを許可します。200ミリモルカンナビジオールストック溶液を調製するには、エタノールの20ミリリットルまたは100%中鎖トリグリセリド油で98%純度カンナビジオール分離株の1.26グラムを追加します。1ミリモルとカンナビジオールの2ミリモルの人工食の1,000グラムに200ミリモルカンナビジオールストック溶液の5ミリリットルと10ミリリットルを追加します。50ミリリットルチューブの底に制御車両とカンナビジオール含有培地の20グラムを分配します。50ミリリットルの試験管に約2ミリメートルの最初のインスター幼虫をランダムに分配し、穿孔蓋またはチーズクロスで覆います。12時間の明暗サイクルで摂氏25度に維持された昆虫飼育室内でそれらを成長させます。幼虫の成長を測定するには、各グループの初期質量とサイズを分析バランスと定規でそれぞれ記録し、それぞれの食事に幼虫を導入します。初期の質量から2日間間隔で各測定で幼虫の質量を差し引き、幼虫発生段階間の質量増加を決定します。また、インスター発達段階間の日数を記録して、子犬までの発達期間の違いを理解する。食事の消費量を測定するには、実験の開始時にダイエットの最初のグラムを記録し、幼虫が完全な子犬の段階に入ったときの食事の残量から減算します。幼虫移動度測定では、受けた昆虫が少なくとも5分間恐怖調節室に順応し、5分間移動した5番目のインスター昆虫の3つのグループの距離を追跡することを可能にする。次に、動き検出ソフトウェアを実行して、移動応答を解析します。人工食で飼育された昆虫は、最高の成長性能を示しました。CBD分離剤の溶解剤として0.1%中鎖トリグリセリド油を使用した車両制御も、有害な影響を及ぼすことなく正常な成長を示した。しかし、2ミリメートルの高用量のCBDは体重減少を誘発し、対照群および車両群よりも高い死亡率につながった。1ミリメートルCBDでADで飼育されたM.sexta幼虫は、エタノール添加食で飼育されたものよりも少なくとも3.1倍大きな食事を消費した。しかし、2つのミリモルCBD添加培地で飼育された昆虫の食事消費量は、エタノールのみの食事で飼育された幼虫と有意に変わらなかった。異なる条件で飼育されたM.sexta幼虫の移動式指数は、1%エタノールおよび1ミリモルCBD処理幼虫が移動性に影響を与えなかったことを示している。2%エタノール処理は致死的であることが判明した。2%エタノールを含むADに高用量のCBDを添加すると、低移動性が回復した。CBDが食事に追加されると、完全に食事CBD混合物を均質化し、真菌の発生を避けるために40〜60%の湿度で摂氏25度で維持昆虫飼育室で昆虫を成長させます。電気生理学的応答はまた、CBDがタバコホーンワームの中枢神経系に影響を与えるかどうかを判断するために、カンドゥカ・セクスタから解剖された腹側鎖神経節で監視することができる。昆虫モデルシステムは、研究者が複数世代にわたってテストすることにより、他の主要およびマイナーカンナビノイドの医薬的役割を探求することを可能にし、より高い哺乳類の実験的設計を可能にする。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶカンナビノイド前臨床試験のための昆虫モデルシステムとしてのタバコホーンワームManduca sextaの飼育とCBD処理方法。成長、摂食量、運動性の評価により、カンナビノイドの急性および長期的影響を効率的に解析できます。

カンナビノイド前臨床試験のための昆虫モデルシステムとしてのタバコホーンワーム

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