Name: ACT1-CUP1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学ぼう、出芽酵母におけるACT1-CUP1アッセイによるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性の決定方法。成長表現型を用いた効率的なプレメッセンジャーRNAスプライシング評価プロトコルです。

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ウィスコンシン大学マディソン校のアーロン・ホスキンスとホスキンス研究室のメンバーに、図3〜5の生成に酵母株と機器を使用していただきありがとうございます。Harpreet KaurとXingyang Fuさん、原稿に対する洞察に満ちたコメントに感謝します。この論文の執筆、編集、撮影中にノースウェスト大学の支援的な学生、スタッフ、および教員に感謝します。この方法の撮影を手伝ってくれたイザベルマラシガンに感謝します。

1.酵母株の構築
<ol><li>leu2およびcup1Δを含むバックグラウンドを持つS.cerevisiae株を生成または取得します。このバックグラウンドを生成するには、酢酸リチウムと一本鎖DNA39を使用する確立された酵母法を使用します。 注:一倍体酵母株には、CUP1 6,38の1つ、2つ、またはそれ以上のコピーが含まれている場合があります。CUP1遺伝子の位置に隣接するノックアウトプライマーを設計する際には、選択した酵母株のゲノム情報を参照してください。</li>
	<li>酵母の形質転換を実行して、ゲノムの組み込みまたはプラスミドのいずれかを介してQSPを組み込みます。以前の研究40、41、42に記載されているような十分に確立されたプロトコルを使用してください。</li>
	<li>ステップ1.2で得られた菌株で酵母の形質転換を実行します。をクリックして、目的のACT1-CUP1レポータープラスミドを追加します。 注:この形質転換後のACT1-CUP1レポータープラスミドを確実に保持するために、細胞はロイシンドロップアウト(-Leu)プレートおよび培地上で維持する必要があります。</li>
	<li>手順 1.2 を実行します。および1.3。試験される各QSPおよび各ACT1-CUP1レポータープラスミドについて、対照株を含む。</li>
</ol>2.銅板の準備
<ol><li>テストするレポーターに適した銅濃度範囲を選択します(頻繁に使用されるレポーターの致死率については 、表1 を参照してください)。 注:包括的な銅濃度範囲の例は、0 mM、0.025 mM、0.05 mM、0.075 mM、0.1 mM、0.15 mM、0.2 mM、0.25 mM、0.3 mM、0.35 mM、0.4 mM、0.45 mM、0.5 mM、0.6 mM、0.7 mM、0.8 mM、0.9 mM、1.0 mM、1.1 mM、1.2 mM、1.3 mMの30種類の銅濃度です。 1.4 mM、1.5 mM、1.6 mM、1.7 mM、1.8 mM、1.9 mM、2.0 mM、2.25 mM、および 2.5 mM Cu2+</li>
	<li>1 M CuSO4 のストック溶液を作り、0.22 μm PES(ポリエーテルスルホン)滅菌フィルターを通して滅菌フィルターを通します。</li>
	<li>所望の銅板につき、滅菌水中のCuSO4ストックの2mL希釈液を調製する。 注意: 0 mM Cu 2+のプレートは常に分析され、参照として画像化されるため、メッキステップの開始時と終了時に1つずつ、2つの0 mM Cu2+プレートを作成することをお勧めします(ステップ3.4)。<ol><li>プレート容量の40 mLにおける最終的な所望の銅濃度のストック量を計算する(補足表1)。</li>
		<li>計算した量の滅菌水と1 M CuSO4 ストックを滅菌済みの2 mLチューブに加えます。</li>
	</ol></li>
	<li>ACT1-CUP1アッセイ用のポアプレート。 注:以下のプロトコルに代わる方法は、最初に大きな容器で培地と寒天を混ぜ合わせ、オートクレーブ処理後に小さな容器にアリコートして、プレートごとに異なる銅濃度を達成することです。どちらの方法を使用する場合でも、それぞれが異なる銅濃度を持っているにもかかわらず、培地濃度がすべてのプレート間で一貫していることを確認することが重要です。<ol><li>注ぐ空のプレートごとに、含まれる最終的な銅濃度のラベルを付けます。テストする銅濃度ごとに少なくとも1つの正方形のプレートを準備します。</li>
		<li>テストする銅濃度ごとに100mLのボトルにラベルを付けます。</li>
		<li>各ボトルに、790 mgの寒天(2%w / v寒天)と攪拌子を加えます。</li>
		<li>大きなビーカーで、注ぐすべての銅板に-Leu成長培地を組み合わせます。プレートあたり、265 mgの酵母窒素塩基(YNB)と64 mgのドロップアウトミックスからロイシン(および細胞内のQSPプラスミドを維持するために必要なその他の栄養素)を34 mLの脱イオン水に溶解します。</li>
		<li>34 mLの-Leu増殖培地溶液を、準備した各100 mLボトルおよびアルミホイルでキャップに加えます。目的の銅濃度でホイルにラベルを付けます。</li>
		<li>オートクレーブは、オートクレーブに推奨される液体サイクルを使用して寒天を滅菌および溶解します。</li>
		<li>できるだけ早く、4 mLの20%w / vグルコース(滅菌ろ過)を各ボトルに追加します。.</li>
		<li>ラベルを一致させ、CuSO4 の2 mL希釈液を目的のボトルに追加します。 注意: それぞれ濃度の異なる数十枚の銅板を同時に製造できるため、すべてのボトル、チューブ、プレートに目的の銅濃度を明確にラベル付けすることで、プレート注入時の混乱を防ぐことができます。</li>
		<li>攪拌プレートを使用して~30秒間混合し、気泡を避けて35 mLをラベル付きプレートに注ぐかピペットで固定します。保管または使用する前に冷ましてください。 注:多くの場合、プレートはアッセイの1日または2日前に作成され、使用の数時間前まで4°Cで保存されます。プレートは、めっきを開始する前に室温(RT)である必要があります(ステップ3.4)。</li>
	</ol></li>
</ol>3. ACT1-CUP1アッセイ
<ol><li>-Leuプレート上の目的のひずみをストリークします。 注:クライオストックで作業する場合は、メッキする前に細胞が保管場所から十分に復活するように注意する必要があります。このための推奨される手順は、極低温ストックからストリークし、30°Cで3〜5日間成長させることです。 次に、小さな見本を並べ替え、30°Cでさらに2〜3日間成長させます。</li>
	<li>10 mLの培地で一晩培養します。<ol><li>ステップ2.4.2で説明したのと同じ比率を使用して-Leu増殖培地を準備します。培地10 mLあたり、66 mgの酵母窒素塩基(YNB)と16 mgのドロップアウトミックスからロイシンを差し引いたものを9 mLの脱イオン水に加えます。0.22 μm PES滅菌フィルターを通過させます。</li>
		<li>酵母株ごとに、9 mLの-Leu増殖培地と1 mLの20%w / vグルコース(滅菌ろ過)を滅菌50 mLコニカルチューブに追加します。</li>
		<li>滅菌スティックまたはピペットチップを使用して、酵母の小さな(~1 mmラウンド)見本を集め、培地に接種します。</li>
		<li>すべての一晩培養物を180rpmおよび30°Cで振とうする。 注:可能であれば、シェーカーの代わりにローテーターを使用できます。</li>
	</ol></li>
	<li>株を10%グリセロール中のOD600 0.5±0.05に希釈します。<ol><li>1株あたり、900 μLの水を含むキュベットに100 μLの培養液を加えます。</li>
		<li>分光光度計でOD600 を測定します。</li>
		<li>最終容量2 mLでOD600 を0.5にするために必要な希釈率を計算します。</li>
		<li>各菌株を10%グリセロール(滅菌)中のOD600 0.5に希釈する。</li>
		<li>OD600 を再測定して、セル密度が0.5±0.05の所望の範囲内にあることを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>銅板にひずみをプレートします。 注:5〜10 μL容量のハンドピペッティング、リピートピペッターまたはマルチチャンネルピペッターの使用、ピンリプリケーターによるスタンピングなど、さまざまな方法を使用して菌株をプレート化できます。この最後の方法を以下に説明しますが、ほとんどの手順は方法に関係なく似ています。<ol><li>無菌の作業場所と火のついたブンゼンバーナーを設置します。</li>
		<li>48ピンレプリケーターの場合、希釈した各株200 μLを96ウェルプレートの別々のウェルにピペットします。6 x 8グリッドの空きスペースを200 μLの10%グリセロール(滅菌済み)で満たします。 注:9つの酵母株のプレーティングスキームの例は、 補足表2にあります。</li>
		<li>レプリケーターを95%(v / v)エタノールと炎の浅い皿に浸して滅菌します。熱が細胞に熱衝撃を与えないように、炎が消えた後、少なくとも2分間冷まします。</li>
		<li>バーナーの近くに4枚のプレートを置き、蓋を外します。</li>
		<li>リプリケーターを96ウェルプレートに浸し、1回の素早い動きで持ち上げます。</li>
		<li>プレートにそっと置き、前後に軽く揺らして、うまく移動できるようにします。</li>
		<li>1回の素早い動きで持ち上げ、96ウェルプレート内でまったく同じ向きに置きます。</li>
		<li>最大3つの他のプレートについても繰り返します。レプリケーターをエタノールに浸し、炎上させて滅菌し、4枚ごとに冷却するのを待つプロセスを繰り返します。</li>
		<li>プレートがメッキされた後、滑らかな動きで横に移動しますが、それでも炎の滅菌傘内にあります。 注:炎の近くで酵母の希釈とメッキを行うことをお勧めします。プレートは乾燥中に簡単に汚染される可能性があります。</li>
		<li>蓋をする前に、プレートを完全に乾かしてください(通常3〜5分)。</li>
		<li>プレートを30°Cで3日間インキュベートします。</li>
	</ol></li>
</ol>4. データ収集と分析
<ol><li>インキュベーターからプレートを取り出し、それらを目視検査する。</li>
	<li>利用可能なカメラまたは他のデジタルイメージングシステムでプレートの画像を記録します。</li>
	<li>各菌株について、目に見える成長が観察される最後の銅濃度の記録(またはスコア)。 注:細胞はスプライスすることができ、その濃度まで生存し続けることができます。一貫性を保つために、目で見るか、プレート画像から常に同じ方法を使用して、最後の実行可能な銅濃度をスコアリングします。非常に小さなコロニーは、目には見えることがありますが、画像には見えません。直接目視検査と画像からの記録の違いは小さく、通常はグラデーションのステップです。コロニーの画像は出版物でよく使用されるため、画像によるスコアリングをお勧めします。</li>
	<li>同じ株の複数のACT1-CUP1アッセイのデータを組み合わせて、QSPがスプライシングにどのように影響するかについて結論を導き出します。 注:出版物の数字は、通常、0 mM Cu2+ 濃度、最後の生存可能な銅濃度、およびコロニーが死んだその後の濃度での酵母コロニーの画像を示しています。データは、反復間の標準偏差の誤差バーを含む棒グラフとして表示することもできます。データは正規化する必要はありませんが、WTスプライシング因子コントロールの生存率を1に設定し、導入された突然変異の効果を比較することによって正規化することができます。</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

ACT1-CUP1は増殖アッセイであり、観察された増殖差がスプライシング欠陥にのみ起因するように注意する必要があります。すべての菌株は、同様の長さとタイプの成長および保管条件を有することを含め、めっき前に同様の方法で取り扱うべきである。温度感受性株を使用する場合、ACT1-CUP1アッセイは、それらの株が野生型と同等に増殖する条件下でのみ実施する必要があります。関連して、QSPコンポーネントについては、結果の解釈を曇らせないように、QSP遺伝子の酵母の背景と発現レベルを同一にすることをお勧めします。使用するQSPとレポーターの数を考慮する場合、ピンリプリケーター法で一度に30株を超える株をアッセイすることはお勧めしません。各ステップを実行するための追加の時間で、細胞は沈降し、アッセイ結果は細胞の生存率の低下のために一貫性がなくなります。
ACT1-CUP1が増殖アッセイとして本質的に有する制限に加えて、QSPは、この方法で解決できるよりも複雑なスプライシングに影響を与える可能性があります。スプライシングは多段階のプロセスであり、因子はリサイクルされるため、観察された表現型は、摂動が...

スプライソソームは、前駆体メッセンジャーRNA(pre-mRNA)のイントロン、非コード領域の除去を触媒する大型の生物学的機械です1,2。約100のタンパク質と5つのノンコーディングRNAのうちの1つにおけるシングルポイント変異体の効果を特徴付けることは、タンパク質またはRNAを単独で研究する場合、しばしば曖昧です。変異した成分の機能の変化は、完全に機能するスプライソソームとの関連でin vivoで最もよく評価できます。
ここで説明する銅成長アッセイは、 サッカロミセス・セレビシエ または出芽酵母におけるスプライシング効率の迅速な測定です。C.F. LesserとC. Guthrieによって開発され、1993年に発表されたこのアッセイは、単純なモデル生物での作業の容易さと細胞生存率の簡単な読み出しを兼ね備えています3。生存率は、これらの細胞のスプライソソームがレポーター転写物をどれだけうまく認識して接合できるかと相関しています。
この銅成長アッセイは、より一般的にはACT1-CUP1アッセイと呼ばれます。ACT1-CUP1という名前は、スプライシング効率のレポーターを作成するために融合された2つの遺伝子に由来しています。ACT1は酵母のアクチン遺伝子であり、高発現し、効率的にスプライスされたイントロン4,5を有する。Cup1pは、細胞内の銅を隔離して通常の細胞機能との干渉を防ぐ銅キレート剤です6,7,8。ACT1-CUP1レポーターには、ACT1のイントロンのプレmRNAスプライシングが発生した場合にのみ、CUP1が適切な読み取りフレームに入るように、これらの遺伝子が順番に含まれています(図1)。得られた融合タンパク質には、アクチンの最初の21アミノ酸と全長Cup1pタンパク質が含まれており、銅が豊富な環境で酵母の生存率を高めます3。したがって、レポーターのスプライシング量の増加は、Cup1pの濃度が高くなり、銅抵抗が高くなります(図1)。他のレポーター遺伝子と比較して、CUP1は低レベルでも細胞生存率に影響を与え、感度範囲が広く、スプライシング変異を直接選択するために使用できます3,6,7。さらに、CUP1は標準的な酵母の増殖に必須ではないため、このアッセイのセットアップ中に細胞の恒常性は影響を受けません。ACT1-CUP1は、欠失または温度増殖アッセイを補完するもので、最適な酵母増殖条件下でのスプライシングへの影響に関する情報を提供します。
スプライソソームは、5'スプライス部位(5' SS)、分岐部位(BS)、および3'スプライス部位(3' SS)の3つのイントロン配列を介してその基質を認識します。これらの部位では、非コンセンサス配列を含む多数のACT1-CUP1レポーターが生成されています。最も一般的なACT1-CUP1レポーターの選択を 図 1と 表1に示します。スプライソソームはスプライシングサイクルの異なる時点で各スプライス部位と一意に相互作用するため、スプライソソームの堅牢性は、どの非コンセンサスレポーターを使用するかに基づいて、異なるステップでテストできます。非コンセンサスレポーターは、イントロン内の突然変異した位置とそれが突然変異した塩基にちなんで名付けられます。例えば、A3cは、5'SS、具体的にはコンセンサスアデノシンからシトシンまでの3位に変異を有するレポーターである。このレポーターは、5' SSの選択と使用に影響を与えるスプライソソーム変異と強く相互作用します。彼らの最初の研究で、レッサーとガスリーはどの5'SS変異がスプライシングを阻害するかを決定しました3。同じ年の後半、3つのスプライスサイトすべての非コンセンサスレポーターが、ATPase Prp16p9の突然変異のサプレッサースクリーニングでバージェスとガスリーによって発表されました。コンセンサスを非コンセンサス報告者と比較すると、ACT1-CUP1アッセイは、酵母スプライソソームの堅牢性と選択性を理解し、他の真核生物のスプライソソームの機能を推測するための重要な鍵となっています。
非コンセンサスACT1-CUP1レポーターはスプライソソームをさらに摂動させるために感作するため、単一のスプライシング因子変異の影響は、それがプラスまたはマイナスの影響を与えるレポーターを通して特徴付けることができます。これは、さまざまな方法で研究課題のスプライシングに適用されています。まず、ACT1-CUP1アッセイは、スプライシング因子の変異の遺伝子スクリーニングとして使用でき、使用されています。例えば、最大のスプライシングタンパク質であるPrp8pは、スプライソソームのRNAコアがスプライシング反応を触媒するプラットフォームとして機能します。これは、Prp8p変異体が異なるACT1-CUP1レポーター10、11、12、13、14、15、16、17のスプライシングをどのように改善または減少させたかによって部分的に推測されました。スプライソソームの他のタンパク質成分も、Hsh155p、Cwc2p、Cef1p、およびEcm2p18、19、20、21、22、23、24、25を含むACT1-CUP1を使用して調べられています。スプライソソーム移行に関与するPrp16pおよび他の4つのATPアーゼのエネルギー閾値も、このアッセイ9、26、27、28、29、30で研究されています。低分子核RNA(snRNA)は、ACT1-CUP1を利用して、それらが配位するプレmRNA配列と、スプライシング中にsnRNAが受ける二次構造の変化を特定するために広く研究されています3,31,32,33,34,35,36,37。
ACT1-CUP1アッセイには、CUP1遺伝子のすべてのコピーがノックアウトされた酵母株が必要です。CUP1は高いコピー数6,38を有する可能性があるため、フルノックアウト株の調製には、複数回のラウンドまたは広範なスクリーニングが必要になる場合があります。その結果、cup1Δ酵母株は、報告者と同様に、ラボ間で共有されることがよくあります。
スプライシング因子の変異がプラスミドコピーから評価されている場合、この因子の野生型遺伝子をノックアウトする必要があります。さらに、酵母のバックグラウンドでは、ACT1-CUP1レポーターを含むプラスミド、歴史的にロイシン栄養選択プラスミドを含むプラスミド、および研究されるスプライシング機構の突然変異または摂動を含むプラスミドの少なくとも2つのプラスミドの選択を可能にする必要があります(図2)。通常、1回のアッセイで、それぞれがクエリスプライシング摂動(QSP)と異なるレポーターを運ぶ複数の酵母株が、スプライシングに対するクエリの影響をテストします。
ACT1-CUP1アッセイの独立変数により、研究者はQSPの重症度を評価することができます。これらの独立変数は、銅の濃度と複数の非コンセンサスプライシングレポーターの選択です。まず、酵母株が銅濃度の範囲を含むプレート上で増殖するため(図2)、アッセイの設定には、使用する濃度の勾配の選択が含まれます。研究では、コース銅濃度勾配を利用して生存率の初期測定値を取得し、次により細かい勾配でアッセイを繰り返して、微妙な生存率の違いを特定できます。2番目の変数は、テスト可能な広範囲のACT1-CUP1レポーターです(図 1および 表1)。QSPが非コンセンサスレポーターの存在下で野生型とで酵母の生存率に異なる影響を与える場合、QSPはスプライシングのステップまたはイントロンのその領域の認識または処理中に重要なスプライソソームの領域に影響を与えるという結論を下すことができます。
酵母ツールボックスは広範であり、ACT1-CUP1アッセイはスプライシング研究の不可欠な部分です。ACT1-CUP1アッセイは、QSPの影響に関するより詳細な遺伝的、構造的、および/または生化学的分析と並行して実行されることがよくあります。これらのより詳細な研究は一般的により長い手順および/またはより高い値札を持っているので、頻繁なアプローチは最初にACT1-CUP1を持つ興味深い変異体をスクリーニングすることです。
ここで提供されるのは、銅板調製を含むACT1-CUP1アッセイプロトコルです。このアッセイは、スプライシングに対するQSPの影響と、摂動の影響を最も受けるイントロニック領域に対する最初の答えを研究者に提供します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL滅菌微量遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-408-129</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>2 mL滅菌微量遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-408-138</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>50mL滅菌遠心分離チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-201-332</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>96ウェル丸底マイクロプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-760</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>190プルーフエタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-032-600</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>500 mLフィルターシステム(0.22 &micro;m)</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229707</td><td>または異なるメーカーの同等の製品。</td></tr><tr><td>寒天</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1423-500</td><td>任意の分子グレードの寒天で動作します。</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>Tuttnauer</td><td>3870EA</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td>フンボルト</td><td>PN6200.1</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>細胞密度計</td><td>VWR</td><td>490005-906</td><td>または、595nmの吸光度を測定できる他のスペクトルデバイス。</td></tr><tr><td>硫酸銅五水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>LC134051</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>デジタルイメージングシステム</td><td>「Cytiva</td>」<td>29399481</td><td>ImageQuant 4000(図3に使用)&nbsp;Amersham ImageQuant 800、または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>ドロップアウトミックス (-Leu)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>D9525</td><td>実験に適したドロップアウトミックスを使用してください。それはあなたがまたあなたのクエリ摂動のために酵母栄養素マーカーを使用することになることは可能です。その場合、ドロップアウトミックスは、そのマーカーとLeu</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1682836</td><td>または別のメーカーの同等のアイテムである必要があります。</td></tr><tr><td>ゲルバンド定量ソフトウェア</td><td>Cytiva</td><td>29-0006-05</td><td>ImageQuant TL v8.1 (図 5A に使用) または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>ハンドヘルドカメラ</td><td>Nikon</td><td>D3500</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>近赤外線ゲルイメージングデバイス</td><td>Cytiva</td><td>29238583</td><td>Amersham Typhoon NIR(図5aに使用)または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>実験室グレードのクランプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-769-7Q</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>実験室グレードのスタンドとクランプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-000-101</td><td>または異なるメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>マグネティックスターバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-513-51</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>ピンリプリケーターVP</td><td>サイエンティフィック</td><td>VP407AH</td><td></td></tr><tr><td>セミマイクロ使い捨てキュベット</td><td></td><td>VWR97000-590</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>JEIO Tech</td><td>IST-3075</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Biowave</td><td>80-3000-45</td><td>または600nmの吸光度を測定できる任意の分光光度計。</td></tr><tr><td>スクエアプレート</td><td>VWR</td><td>102091-156</td><td>円形プレートも使用できますが、ピンリプリケーターを使用する場合はより困難です。</td></tr><tr><td>攪拌板</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-520-16S</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr><tr><td>酵母窒素ベース</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>Y2025</td><td>または別のメーカーの同等のアイテム。</td></tr></tbody></table>

act1-cup1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

スプライソソームまたはその基質に導入された変異は、スプライソソーム機能の複雑さの理解に大きく貢献しています。疾患関連であろうと機能的に選択されたものであろうと、これらの変異の多くは、モデル生物 Saccharomyces cerevisiae (酵母)の成長アッセイを使用して研究されています。スプライシング特異的銅成長アッセイ(ACT1-CUP1アッセイ)は、表現型レベルでの変異の包括的な分析を提供します。ACT1-CUP1アッセイは、正しくスプライスされた場合に銅耐性を付与するレポーターを利用します。したがって、銅の存在下では、酵母の生存率の変化はスプライシングによるmRNA産生の変化と相関しています。典型的な実験では、酵母スプライソソームは、スプライシングに対する相乗的または反対の影響を検出するために、さまざまな非コンセンサスプライシングレポーターと目的のスプライシング因子変異に挑戦されます。ここでは、銅板の調製、酵母細胞のめっき、およびデータ評価の完全な説明が与えられます。ACT1-CUP1レポーターの多様性を強調する補完的な実験の選択が説明されています。ACT1-CUP1アッセイは、突然変異効果を直接読み出し、現場での継続的な使用による比較の可能性により、スプライシングツールボックスの便利なツールです。

ACT1-CUP1のような増殖アッセイでは、複数のコロニーの視覚的比較評価が必要です。ここでは、各菌株を一晩飽和状態まで増殖させ、OD600 を0.5に希釈し、0 mMから1.1 mMCuSO4 の範囲の銅濃度を含む20枚のプレートに播種しました(図3)。この範囲は、以下で使用および説明するQSPおよびACT1-CUP1レポーターの影響を完全に評価できるため、プロトコルにリストされている範囲よりも小さくなっています。プレートを画像化し、スコアを付けた(図 3および 補足表3)。
この代表的な実験では、酵母のバックグラウンドには破壊された ADE2 遺伝子が含まれており、その結果、コロニーはさまざまな赤の色合いになります(図3A、B)。アデノシン産生経路におけるこの一般的な酵母の...

銅成長アッセイであるACT1-CUP1アッセイは、前駆体メッセンジャーRNA(pre-mRNA)スプライシングと、変異体スプライシング因子がスプライソソーム機能に与える影響を迅速に読み取ることができます。この研究はプロトコルを提供し、関心のあるスプライシングの問題に対処するために可能なカスタマイズを強調しています。

ACT1-CUP1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

ACT1-CUP1アッセイは、変異がプレメッセンジャーRNAスプライシングに影響を与えるかどうかを識別し、どのスプライシングステップが最も影響を受けるかを示すことができます。ACT1-CUP1アッセイは、スプライシング因子の変異をスプライシングの複雑なプロセスへの影響に関連付けます。成長表現型の単純な読み出しを利用し、広い感度範囲を有する。ACT1-CUP1アッセイを実施する際には、時間の効率的な使用が重要です。ストレスによる成長異常を最小限に抑えるために、5〜10株のアッセイから始めます。このプロセスを実演するのは、私と私の研究室の学部生研究者であるイザベル・マラシガンです。はじめに、各ボトルに790ミリグラムの寒天と攪拌子を加えます。大きなビーカーで、注ぐすべての銅板用のロイシンドロップアウト成長培地を準備します。これには、注ぐ各プレートに265ミリグラムの酵母窒素ベース、64ミリグラムのドロップアウトミックス、ロイシンを差し引いたもの、および34ミリリットルの脱イオン水が含まれます。攪拌して溶解し、次に、34ミリリットルのロイシンドロップアウト増殖培地溶液を各調製した100ミリリットルのボトルに加え、アルミホイルでキャップする。次に、オートクレーブを滅菌し、寒天を溶解し、オートクレーブに推奨される液体サイクルを使用する。オートクレーブ後できるだけ早く、各ボトルに4ミリリットルの20%グルコースを加えます。次に、チューブラベルをボトルラベルに合わせ、2ミリリットルの硫酸銅希釈液をそれぞれ目的のボトルに追加します。攪拌プレートを使用して、約30秒間混合し、気泡を避けて、ラベル付けされたプレートに35ミリリットルを注ぐかピペットで入れます。酵母株あたり、9ミリリットルのロイシンドロップアウト増殖培地と1ミリリットルの20%グルコースを滅菌済みの50ミリリットルの円錐管に加えます。滅菌スティックまたはピペットチップを使用して、酵母の小さな見本を集め、培地に接種します。次に、すべての一晩培養物を180 RPMと摂氏30度で振ってください。次に、1株あたり900マイクロリットルの水を含む100マイクロリットルの培養物をキュベットに加えます。その後、分光光度計で光学密度を測定し、最終容量2ミリリットルで光学密度0.5になるために必要な希釈率を計算します。その後、各菌株を10%グリセロールで光学濃度0.5に希釈し、光学濃度を再測定して、細胞密度が所望の範囲内にあることを確認する。無菌の作業場所を設定した後、ブンゼンバーナーに火をつけます。48ピンレプリケーターの場合、希釈した各株200マイクロリットルを96ウェルプレートの別々のウェルにピペットで入れ、6×8グリッドの空きスペースに200マイクロリットルの10%グリセロールを入れます。次に、レプリケーターを95%エタノールと炎の浅い皿に浸して滅菌します。細胞に熱衝撃を与えないように、炎が消えた後、少なくとも2分間冷まします。バーナーの近くに4枚のプレートを置き、蓋を外します。リプリケーターを96ウェルプレートに浸し、1回の素早い動きで持ち上げます。次に、プレートにそっと置き、前後に軽く揺り動かして、うまく移動できるようにします。1回の素早い動きで持ち上げ、96ウェルプレート内でまったく同じ向きに置きます。プレートがメッキされた後、滑らかな動きで横に移動しますが、それでも炎の滅菌傘内にあります。蓋をする前に、プレートを完全に乾かしてください(通常は3〜5分)。次に、プレートを摂氏30度で3日間インキュベートします。プレートをインキュベーターから取り出した後、それらを目視検査する。成長アッセイは、銅濃度が増加するにつれて、スプライシングの低い株がコンフルエント性を低下させ、銅濃度が致命的になることを示しました。酵母の背景には破壊されたADE2遺伝子が含まれており、その結果、コロニーはさまざまな赤の色合いになります。そして成熟したコロニーは濃い赤でした。プレーティング中に、レプリケーターを左右に動かしながら持ち上げたり、斜めに持ってきたり、プレート上で振ったりすれば、細胞溶液の小さな液滴から楕円形のコロニーやマイクロコロニーを作ることができる。A3cレポーターを含む酵母は0.15ミリモルの銅まで生存しましたが、野生型レポーター細胞はテストされた銅濃度の範囲の終わりまで生存率を維持しました。アッセイ結果は、U6 snRNA位置57の異なる塩基が、5プライムまたは分岐部位変異と組み合わせてスプライソソームに独特の影響を与えることを示しました。U57cは加加突然変異ですが、A3cおよびブランチサイトGレポーターと組み合わせて銅耐性を低下させます。対照的に、U57aは第2段階への進行を促進するため、銅耐性を高めます。ACT1-CUP1によってスプライシング摂動が同定された後、研究はプライマー伸長やEMSAや酵素プロービングによる破壊された分子相互作用の同定など、より定量的な方法に移行できます。ACT1-CUP1は、酵母スプライソソームの堅牢性と選択性に関する理解を深めるための基礎となるアッセイです。そして、それはスプライソソーム機能の理解を拡大し続けています。

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学ぼう、出芽酵母におけるACT1-CUP1アッセイによるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性の決定方法。成長表現型を用いた効率的なプレメッセンジャーRNAスプライシング評価プロトコルです。

ACT1-CUP1アッセイは、出芽酵母におけるスプライソソーム変異体の基質特異的感受性を決定

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