Name: アシネトバクター・バウマンニO結合型糖ペプチドの同定のためのオープンサーチに基づくアプローチの適用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶオープンサーチを用いた細菌糖ペプチド同定法。Acinetobacter baumanniiをモデル生物として、ZIC-HILIC濃縮と質量分析で糖鎖修飾を探索し、糖基化の多様性と菌株間差異を解明する革新的アプローチです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

N.E.S.は、Australian Research Council Future Fellowship(FT200100270)とARC Discovery Project Grant(DP210100362)の支援を受けています。我々は、MS機器へのアクセスについて、Bio21分子科学バイオテクノロジー研究所のメルボルン質量分析およびプロテオミクス施設に感謝する。

著者には利益相反はありません。

オープン検索は、未知の修飾を識別するための効果的かつ体系的な方法です。細菌プロテオームサンプル中の未知のグリカンの同定は、伝統的に時間がかかり、技術的に専門的な作業であったが、MSfragger21,41およびByonic31,38などのツールの最近の開発により、ペプチドに結合した潜在的なグリカンとしてさらなる特性評価のためのデルタ塊の迅速かつ効果的な同定が可能になった。標準プロテオームサンプルと糖ペプチド富化プロテオームサンプルの両方をオープンサーチすることで、潜在的な糖ペプチドを同定できます(図1)。多くの細菌系のプロテオーム内の糖ペプチドの共通性と豊富さは、糖ペプチド濃縮なしでこれらの修飾の直接検出を可能にする6。糖ペプチド富化アプローチは、典型的には、多くのグリコシル化系<sup class...

タンパク質グリコシル化は、タンパク質分子に炭水化物を結合させるプロセスであり、自然界で最も一般的な翻訳後修飾(PTM)の1つである1,2。生命のすべての領域にわたって、無数の細胞機能に影響を与える糖タンパク質の生成に特化した一連の複雑な機械が進化してきました1,3,4,5。タンパク質グリコシル化はアミノ酸6、7の範囲で起こるが、N結合型およびO結合型グリコシル化事象は、自然界で観察される2つの支配的な形態である。N結合型グリコシル化は、アスパラギン(Asn)残基の窒素原子へのグリカンの結合を伴うが、O結合型グリコシル化において、グリカンは、セリン(Ser)、スレオニン(Thr)、またはチロシン(Tyr)残基の酸素原子に結合している7。グリコシル化系によって標的とされる残基の類似性にもかかわらず、タンパク質に結合しているグリカン内の相違により、グリコシル化は自然界で見出されるPTMの最も化学的に多様なクラスである。
真核生物グリコシル化系はグリカンの多様性を有するが、これらの系は典型的には、利用される固有の炭水化物の数に制限されている。結果として生じる多様性は、これらの炭水化物がグリカン8、9、10、11、12にどのように配置されるかに由来する。対照的に、細菌および古細菌種は、これらの系内で生成されるユニークな糖の膨大な配列のために、事実上無限のグリカン多様性を有する2、10、13、14、15、16、17。生命のドメイン間で観察されるグリカン多様性のこれらの違いは、グリコシル化事象の特性評価および同定のための重要な分析上の課題を表す。真核生物のグリコシル化の場合、グリカン組成物を予測する能力は、糖生物学への関心の高まりを促進してきた。しかし、細菌のグリコシル化についても同じことは当てはまらず、専門の研究室による研究にはまだ大きく制限されています。バイオサイエンスにおいて質量分析(MS)機器のアクセシビリティが高まるにつれて、MSベースのアプローチがグリコプロテオーム分析の主要な方法になりました。
MSはグリコシル化の特性評価のための典型的なツールとして浮上しており、トップダウンとボトムアップの両方のアプローチが糖タンパク質6の特性評価に一般的に使用されています。トップダウンプロテオミクスは、特定のタンパク質のグローバルなグリコシル化パターンを評価するために使用されるが18,19、ボトムアップアプローチは、複雑な混合物6、20、21、22、23からでさえも、糖ペプチドのグリカン特異的特性評価を可能にするために使用される。糖ペプチドの分析のためには、有益な断片化情報の生成が、グリコシル化事象の特性評価に不可欠である24、25。現在、共鳴イオントラップベースの衝突誘起解離(IT-CID)、ビーム型衝突誘起解離(CID)、電子移動解離(ETD)など、さまざまなフラグメンテーションアプローチが機器で日常的にアクセス可能です。各アプローチは、糖ペプチド分析25,26に対して異なる長所と短所を有しており、これらの断片化アプローチをグリコシル化6,20の分析に適用する上で過去10年間で著しい進歩を遂げている。しかし、細菌のグリコシル化分析にとって、重要な制限は糖ペプチドを断片化する能力ではなく、むしろサンプル内の潜在的なグリカン組成を予測できないことでした。これらのシステム内では、多様な細菌グリカンの未知の性質は、O-Pair27、GlycopeptideGraphMS28、およびGlycReSoft29などの真核生物糖ペプチドの分析のために現在一般的であるグリコシル化に焦点を当てた検索ツールを使用しても、糖ペプチドの同定を制限する。この問題を克服するためには、細菌のグリコシル化30の研究のための強力なアプローチとして、オープンな検索ツールの使用が浮上している代替の検索方法が必要である。
オープン検索は、ブラインドまたはワイルドカード検索としても知られており、不明または予期しないPTM21、30、31、32を有するペプチドの同定を可能にする。オープン検索は、キュレーションされた修正検索、多段階データベース検索、または広質量耐性検索33、34、35、36、37を含む様々な計算技術を利用する。オープン検索は大きな可能性を秘めているが、その使用は、典型的には、制限された検索と比較して、分析時間の有意な増加および非修飾ペプチドの検出の感度の損失によって妨げられてきた31、32。非修飾ペプチドスペクトルマッチ(PSM)の検出の減少は、これらの技術に関連する偽陽性PSM率の増加の結果であり、所望の偽発見率(FDR)を維持するためには、より厳格なフィルタリングの増加が必要である33、34、35、36、37.最近、Byonic 31,38、Open-pFind39、ANN-SoLo 40、MSFragger21,41など、オープン検索のアクセシビリティを大幅に向上させるいくつかのツールが利用可能になりました。これらのツールは、分析時間を大幅に短縮し、不均一なグリカン組成物を処理するためのアプローチを実装することによって、グリコシル化イベントの堅牢な同定を可能にします。
本稿では、グラム陰性院内病原体であるアシネトバクター・バウマンニをモデルとして、オープンサーチによる細菌糖ペプチドの同定のための合理化された方法を提示する。A. baumanniiは、PglLタンパク質グリコシル化システム42、43、44として知られる複数のタンパク質基質の修飾に関与する保存されたO結合型グリコシル化システムを有する。類似のタンパク質が株間のグリコシル化を標的としているが、PglLグリコシル化システムは、タンパク質グリコシル化に使用されるグリカンの生合成がカプセル遺伝子座(K遺伝子座として知られている)に由来するため、非常に可変である44,45,46。これは、単一または限定された重合K単位に由来する多様なグリカン(K単位としても知られる)を、タンパク質基質30、44、46に付加する結果とする。この研究の中で、ソフトウェアFragPipe内のオープン検索ツールMSfraggerの使用は、A. baumannii株全体のグリカンを同定するために使用される。オープン検索と手作業によるキュレーションを組み合わせることで、「糖鎖に着目した探索」を行い、細菌の糖ペプチドの同定をさらに向上させることができます。一緒に、この多段階同定アプローチは、新規グリコシル化事象の特性評価において広範な経験なしに糖ペプチドの同定を可能にする。

<table><tbody><tr><td>14 G Kel-F ハブ ポイント スタイル 3</td><td>ハミルトン会社</td><td>hanc90514</td><td></td></tr><tr><td>2-クロロアセトアミド</td><td>シグマ アルドリッチ Pty Ltd</td><td>C0267-100G</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>シグマ アルドリッチ Pty Ltd</td><td>34851-4L</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム (28%)</td> <td>シグマ アルドリッチ Pty Ltd</td><td>338818-100ML</td><td></td></tr><tr><td>BCA タンパク質アッセイ試薬 A</td><td>ピアス</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>BCAの蛋白質の試金の試薬B</td><td>Pierce</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>C8 Empore SPE</td><td>のSigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66882-U</td><td>C8材料の代わりのベンダーはAffinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>5.33002</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>650447-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーケミカルです</td><td>M/4058/17</td><td></td></tr><tr><td>SDB-RPS Empore SPE (逆相スルホン酸)</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>66886-U</td><td>SDB-RPSの代替ベンダーは、Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2232000083</td><td></td></tr><tr><td>trifluoroacetic acid</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td>です。<td>302031-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>トリス 2-カルボキシエチルホスフィン塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン</td><td>Sigma Aldrich Pty Ltd</td><td>252859-500G</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/Lys-C プロテアーゼ混合物</td><td>Promega</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>真空濃縮器</td><td>Labconco</td><td>7810040</td><td></td></tr><tr><td>ZIC-HILIC 材料</td><td>シングル</td>ユースのSPEカラムで使用するためのMerck<td>の1504580001</td><td>樹脂は、より大きな形態のカラムを空にし、遊離樹脂を使用することで入手できます</td></tr></tbody></table>

アシネトバクター・バウマンニo結合型糖ペプチドの同定のためのオープンサーチに基づくアプローチの適用

The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides

タンパク質グリコシル化は、細菌生物内の一般的な修飾としてますます認識されており、原核生物生理学および病原種の最適な感染力に寄与する。このため、細菌のグリコシル化を特徴付けることへの関心が高まっており、これらの事象を同定するためのハイスループット分析ツールの必要性が高まっています。ボトムアッププロテオミクスは豊富な糖ペプチドデータの生成を容易に可能にするが、原核生物種で観察されるグリカンの幅広さと多様性は、細菌のグリコシル化事象の同定を非常に困難にしている。
従来、細菌プロテオミクスデータセット内のグリカン組成の手動測定は、これを主に分野固有の専門家に限定されたオーダーメイドの分析にしました。最近、オープンな検索ベースのアプローチが、未知の変更を特定するための強力な代替手段として浮上しています。ペプチド配列で観察されるユニークな修飾の頻度を分析することにより、オープンサーチ技術により、複雑なサンプル内のペプチドに結合した一般的なグリカンの同定が可能になります。この記事では、グリコプロテオームデータの解釈と分析のための合理化されたワークフローを提示し、グリカン組成の事前知識なしに細菌の糖ペプチドを同定するためにオープン検索技術をどのように使用できるかを実証する。
このアプローチを使用して、サンプル内の糖ペプチドを迅速に同定し、グリコシル化の違いを理解することができます。 モデルとしてアシネトバクターバウマンニ を使用して、これらのアプローチは、株間のグリカン組成の比較および新規糖タンパク質の同定を可能にする。まとめると、この研究は、細菌のグリコシル化を同定するためのオープンデータベース検索技術の汎用性を実証し、これらの非常に多様なグリコプロテオームの特性評価をこれまで以上に容易にする。

細菌糖ペプチド分析のためのオープン検索の有用性を例示するために、A. baumannii-AB307-0294、ACICU、およびD1279779-の3つの株におけるO結合型グリカンの化学的多様性を評価した。O結合型グリコプロテオームは、グリコシル化に使用されるグリカンが高度に可変のカプセル遺伝子座44、45、46に由来するため、A.バウマンニ株間で高度に可変である。この化学的多様性により、A. baumanniiはオープンサーチ研究に理想的なモデルシステムとなっています。3つの菌株のグリコプロテオームはこれまで評価されていないが、これらの株のうちの2つ、AB307-029464およびACICU65のカプセル構造は公知であり、D1279779のカプセルはまだ解明されてい...

オープン検索は、これまで知られていなかった糖鎖組成で装飾された糖ペプチドの同定を可能にする。この記事では、 アシネトバクター・バウマンニを モデルとして細菌サンプルについて、オープン検索とその後のグリカン中心の糖ペプチド検索を行うための合理化されたアプローチを紹介します。

アシネトバクター・バウマンニO結合型糖ペプチドの同定のためのオープンサーチに基づくアプローチの適用

Protein glycosylation is increasingly recognized as a common modification within bacterial organisms, contributing to prokaryotic physiology and optimal ...

このプロトコルは、細菌のglycop%eptideの同定を合理化し、研究者が新規なグリコシル化事象、ならびに株間のグリコシル化に使用されるグリカンの違いを同定することを可能にする。この技術の主な利点は、非グリコシル化の専門家が細菌プロテオームサンプル中の潜在的なグリコシル化事象を同定できることである。オープン検索は、グリコシル化だけでなく、さまざまな修飾の同定に使用できる一般的に適用可能なアプローチであり、任意のプロテオームサンプルに適用することができます。STB-RPS ストップアンドゴー抽出チップを準備するには、14 ゲージの鈍い針を使用して、47 平方ミリメートルの STB-RPS メンブレンから 3 枚の STB-RPS ディスクを切除し、50 マイクログラムのペプチドを結合させます。ペプチド量が多い場合は、それに応じてディスクの数を増やします。SDB-RPSステージチップを使用する前に、150マイクロリットルの100%アセトニトリルを加え、遠心分離またはシリンジを使用して静かに圧力をかけることによって緩衝液を回転させてチップを洗浄する。次に、1%TFAを含む150マイクロリットルの30%メタノールで先端を洗浄し、次いで1%TFAを含む150マイクロリットルの90%イソプロパノールで先端を平衡化する。平衡化後、遠心分離またはシリンジを使用して、プロテオームサンプルをSTB-RPSステージチップにロードします。次に、1%TFAを含む150マイクロリットルの90%イソプロパノールで先端を洗浄し、続いて1%TFAを150マイクロリットル洗う。STB-RPS段階の先端からペプチドを溶出させるには、1つの先端に150マイクロリットルの5%水酸化アンモニウムと80%アセトニトリルを加え、シリンジを使用して静かに圧力をかけることによって溶出したサンプルを個々のチューブに集めます。あるいは、遠心分離によって溶出する場合は、すべての段階チップに添加した80%アセトニトリル中の5%水酸化アンモニウムで150マイクロリットルを使用し、きれいなプレートに集める。溶出したペプチドを摂氏25度で真空遠心分離により乾燥させる。次に、糖ペプチドサンプルを富化するために、両性イオン親水性相互作用液体クロマトグラフィー、またはZIC-HILIC、ステージチップを調製する。14ゲージの鈍い針を使用して、470平方ミリメートルのC8メンブレンから1枚のC8ディスクを取り出し、ディスクをP-200チップに詰めてフリットを作成します。次に、シリンジを使用して静かに圧力をかけることによって、50%アセトニトリルに再懸濁された約5ミリメートルのZIC-HILIC材料をフリットに加える。チップを使用する前に、20 床分の ZIC-HILIC 溶出バッファーで樹脂を平衡化し、樹脂の上に 10 マイクロ

the-application-open-searching-based-approaches-for-identification

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを "ミックス·アンド·読む"を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、...

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

我々は、迅速な菌の検出および同定のための電気化学センサの測定方法を説明する。アッセイは、リボソームRNA（rRNAの）種特異的配列のためのDNAオリゴヌクレオチド捕捉プローブで官能化されたセンサアレイを含む。捕捉プローブと西洋ワサビペルオキシダーゼ連動DNAオリゴヌクレオチドの検出プローブでターゲットのrRNAのサンドイッチハイブリダイゼーションは、測定電流測定電流を生成する。...

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)および分子技術(16S...

16S rRNAの遺伝子配列決定およびMALDI-TOF MSによるレア細菌性病原体の同定

IDBacは、細菌コロニーから掻き取られた細胞材料に収集された、無傷のタンパク質と特殊な代謝スペクトルの両方からのデータを統合するオープンソースの質量分析ベースのバイオインフォマティクスパイプラインです。このパイプラインにより、研究者は数百から数千の細菌コロニーを種置分類群に迅速に組織し、特殊な代謝産物生産に基づいてそれらをさらに区別することができます。...

微生物タンパク質および特殊代謝産物データの分析にオープンソースのMALDI TOF-MS IDBacパイプラインを使用

グラム陰性細菌は、2つの空間的に分離された膜を生成する。外膜は、内膜から、ペリプラズムとペプチドグリカン層によって分割される。これらの微生物の二重二重層を単離する能力は、その生理学と病因を理解するために重要であった。...

アシネトバクターバウマンニの技術的調整によるグラム陰性細菌の細胞エンベロープの内膜および外膜分画への分離

このプロトコルは、液体クロマトグラフィー質量分析と高度な特徴抽出およびバイオインフォマティクス分析ソフトウェアを組み合わせたペプチドグリカン組成の詳細な分析をカバーしています。...

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

ここでは、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法を用いて、ゲノム的に配列された病原性細菌によって産生されるタンパク質を迅速に同定するためのプロトコルを、社内で開発したソフトウェアを用いて提示する。アスパラギン酸効果とこの特異性のために、メタスタブルタンパク質イオン断片は、タンパク質同定のために利用されます。...

MALDI-TOF-TOF-MS/MSとトップダウンプロテオミクス解析を用いた 、大腸菌 における抗菌性免疫タンパク質の同定

EUCASTは、自動血液培養のための直接抗菌剤感受性試験(AST)プロトコルを開発しました。しかし、質量分析に基づく微生物同定への依存は、自動微生物同定システムにおける直接接種調製プロトコルを使用することで回避することができます。このアプローチでは、サンプル収集から24時間以内にASTレポートを提供できます。...

質量分析を伴わないEUCAST RAST法を容易にする自動微生物同定システムを用いた直接微生物同定(英語)

アシネトバクター・バウマニーの迅速かつ正確な検出を容易にするために、A.

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12aベースシステムを用いた Acinetobacter baumannii 感染症の迅速かつ特異的な検出

私たちは、脂肪酸を精製する必要なしに、脂肪酸を特定するためのプロトコルを提案します。これは、保持時間に関する情報と、脂肪酸メチルエステル(FAME)、4,4-ジメチルオキサゾリン誘導体(DMOX)、および3-ピリジルカルビニルエステル(ピコリニル)の3種類の脂肪酸誘導体の質量スペクトルを組み合わせたものです。...

脂肪酸の同定で<em&gt;セレウス菌</em

学ぶオープンサーチを用いた細菌糖ペプチド同定法。Acinetobacter baumanniiをモデル生物として、ZIC-HILIC濃縮と質量分析で糖鎖修飾を探索し、糖基化の多様性と菌株間差異を解明する革新的アプローチです。

アシネトバクター・バウマンニO結合型糖ペプチドの同定のためのオープンサーチに基づくアプローチの適用

さらに動画を探す