Name: 昆虫病原性真菌、メタリシウム・ロベルツィイおよびメタリシウム・ピンヘーンセの大量生産、害虫に対する商業利用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶ昆虫病原性真菌Metarhizium robertsiiおよびM. pinghaenseの感染性子嚢胞の大量生産法。米を基質とした固体培養とブラストスポア接種技術により、商業的バイオコントロール剤の最適な収量を達成する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

著者らは、このプロジェクトに資金を提供してくれたHort Pome、Hort Stone、およびTechnology and Human Resources for Industry Programme(THRIP:TP14062571871)に感謝したい。
オルシド: レトディ・L・マトゥルウェ http://orcid.org/0000-0002-5118-3578
アントワネット・P・マラン・http://orcid.org/0000-0002-9257-0312
ノマコルワ・F・ストクウェ http://orcid.org/0000-0003-2869-5652

1.真菌株の供給源
<ol><li>南アフリカの西ケープ州のリンゴ果樹園から採取したM. pinghaense 5 HEID(GenBankアクセッション番号:MT367414/MT895630)とM. robertsii 6EIKEN(MT378171/MT380849)の両方の南アフリカの単離真菌株を使用してください。</li>
	<li>各EPF分離株の培養物を、1gの酵母エキス(SDAY)および10μLのストレプトマイシンを添加した60gのサブローデキストロース寒天培地上で増殖させる。 注:EPF培養物を暗所で±25°Cの制御された温度でインキュベートする。</li>
</ol>2. メタリシウム・ピンヘーンセ  および M.ロベルツィイ 分生子懸濁液接種
<ol><li>固体基質の調製<ol>
<li>発酵バッグとして、2つのEPF分離株およびオートクレーブバッグ(305mm×660mm)の成長培地として、2つの農産物、すなわちフレークドオート麦およびフレークドオオムギを使用する。</li>
		<li>小さなポリ塩化ビニル廃液パイプ(1000mm×50mm)を使用して、オートクレーブバッグの開放端に発酵バッグ用のネックを作成し、オートクレーブテープを使用してパイプをバッグに固定します。</li>
		<li>発酵中に十分なガス交換を可能にするために、滅菌コットンウールプラグでパイプを閉じます。</li>
		<li>フレークドオート麦とフレーク大麦の両方の乾燥穀物(200g)を計量して発酵バッグに入れ、各バッグに100mLの蒸留水を加え、バッグの内容物を十分に混合する。</li>
		<li>濡れた穀物を15〜30分間休ませて、オートクレーブと滅菌の前に水分を吸収します。粒種ごとに6袋を用意し、汚染を防ぐため、他のオートクレーブ袋に袋を入れ、基材を121°Cで55分間オートクレーブした。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分生子懸濁液接種の調製<ol>
<li>M. pinghaenseおよびM. robertsiiの両方の真菌培養物から2〜3週齢の真菌分生子を掻き取り、滅菌手術ブレードを使用して収穫する。</li>
		<li>回収した真菌分生子を20mLの滅菌蒸留水に懸濁し、0.05%Tween 20を補充し、分生子懸濁液を2分間ボルテックスミックスする。</li>
		<li>1 ~107 分生子/mLの濃度で20 mLの分生子懸濁液を調製し、それぞれフレークドオート麦×フレーク大麦固体基質を接種する。 注:分生子濃度を決定するために血球計数器を使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>固体基質の接種<ol>
<li>コットンウールネックプラグを取り外して各袋を開き、調製した20mL分生子懸濁液を冷却したオートクレーブ処理基材に加える。</li>
		<li>首栓を使用して袋をもう一度閉じ、袋の内容物をマッサージして、真菌の接種物が穀物基質と均一に混合されるようにします。</li>
		<li>発酵バッグを±25°Cの制御された温度でインキュベートし、培養物と環境との間の十分なガス交換を確実にする。 メモ: この手順は、層流キャビネットの下で行う必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>発酵段階<ol>
<li>接種およびインキュベーションの2日後に発酵バッグ内の穀物基質を手動でマッサージし、目に見える菌糸成長が起こり、基質が増殖する真菌によって凝集し始めたとき。 注:これは、菌類の栄養成長の最初の初期段階で菌糸枝分かれが起こることを可能にするために、接種された顆粒を混合するために行われる。</li>
		<li>キッチンの麺棒を使用して基板ベッドを操作し、粒子基板ベッドの物理的な不均一性および基板質量のベッド厚さを回避します。 注:このプロセスは、真菌の胞子産生を最適化し、表面積を最大化し、分生子収量を促進する真菌代謝を促進する18。</li>
		<li>発酵プロセスを最大4〜5週間継続させ、発酵プロセス中に発生する可能性のある白い栄養過成長の存在について発酵バッグをチェックし、真菌の分生子収量に大きく影響する可能性があります。 注:任意の白色栄養過剰増殖を含む発酵バッグ内の発酵を直ちに終了し、真菌培養物18を乾燥させる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 芽球胞子接種
<ol><li>芽胞子の産生と接種<ol>
<li>M. pinghaenseとM. robertsiiの両方について、1Lの蒸留水、30gのグルコース、20gの酵母エキス、4gのリン酸亜塩基性カリウム(K2HPO4)、15mLのコーンスティープリカー、および10μg/mLの抗生物質ストレプトマイシンを含む液体培地を調製する。</li>
		<li>まず、蒸留水を加熱し、沸点に達する前にスイッチを切って、ストレプトマイシンを除く各成分を鍋の中のお湯に加えます。培地を3〜4分間穏やかに沸騰させ、成分の適切な混合を可能にし、ポットの底にいくつかの成分が沈降するのを防ぐために培地を絶えず攪拌する。</li>
		<li>合計100mLの培地を9つの異なる250mLフラスコに注ぎ、各フラスコにコットンウールプラグを置き、ストッパーとしてコットンウールをアルミホイルで覆った(図1A)。</li>
		<li>フラスコ内の培地を121°Cで55分間オートクレーブする。 オートクレーブ処理に続いて、フラスコ内の培地を冷却し、各フラスコ内の培地に10mg/mLのストレプトマイシンを加えます(図1B)。</li>
		<li>EPF分離株M. pinghaenseおよびM. robertsiiの両方について、2〜3週齢の真菌培養プレートから真菌分生子の2〜3細菌ループを収集し、滅菌条件下で、250mLフラスコ内の各100mL液体培地に移し、フラスコを密封する。</li>
		<li>液体培養フラスコを±25°Cでインキュベートし、140rpmでオービタルシェーカー上で3日間、培養物が真菌芽胞子増殖を伴う高い濁度の徴候を示したらインキュベーションを停止した(図1C)。</li>
		<li>培養物からの細菌汚染の可能性を検出するには、インキュベーション中に24時間後に各液体培養フラスコから100μLのサンプルを引き出し、単離物ごとに3つのSDAプレート上にプレートします。プレートを±25°Cの制御温度で48時間インキュベートする。</li>
	</ol></li>
	<li>固体基板の作製<ol>
<li>M. pinghaenseとM. robertsiiの両方の芽胞子の固体基質培地として、パーボイルした長粒白米を使用する(JaronskiとJackson18から適応)。</li>
		<li>上記のように発酵バッグをステップ2.1.1〜2.1.3で準備し、各バッグに1kgの米と300mLの滅菌蒸留水を加える。</li>
		<li>発酵バッグの内容物を穏やかに混合し、外側のオートクレーブバッグに直立姿勢で入れ、オートクレーブを121°Cで55分間行った。オートクレーブ処理に続いて、滅菌条件下で基板を± 45分間冷却します。</li>
	</ol></li>
	<li>接種と発酵<ol>
<li>層流下で M. pinghaense および M. robertsii の両方の液体培養フラスコの各々の閉鎖を解除し、各フラスコの縁を10秒間炎上させる。</li>
		<li>100mLの液体培養物を発酵バッグに注ぎ、コットンウールプラグを首から取り外します(図2)。綿のプラグを元に戻し、バッグの首の上部を輪ゴムで固定された手術用紙で覆います。 注:血球計数器を使用して各フラスコの胚盤胞子濃度を決定し、1 ×107 - 5 × 108 胚芽胞子/mLの胚芽胞子濃度を使用して基質28を無菌化する。</li>
		<li>袋の上部をひねり、マッサージによる基板の振とうと軽い操作により袋の内容物を混ぜ合わせ、±25°Cで袋をインキュベートし、袋内の基板を平らにすることにより、厚いベッド18の形成を防止する。</li>
		<li>袋の内容物をマッサージすることによって発酵バッグ内の基質を破り、接種およびインキュベーションの2〜3日後に、真菌による基質の目に見える菌糸成長および結合が生じていた(JaronskiおよびJackson18の技術から適合)。 注:発酵を4週間継続させる。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig01.jpg"> 図1:250mLフラスコ内の液体培養液。(b)オートクレーブ処理後、EPF胞子を接種する。(c)真菌芽球胞子を有する濁質培地。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig02.jpg"> 図2:胚盤胞子液体培地を調製した。 (A)メタリシウム・ロベルツィイ及び(B)メタリシウム・ピンヘンセは、固体基質としてのイネの接種前。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
4. 真菌培養物の乾燥
<ol><li>真菌培養物を発酵後10〜12日間乾燥させ、試験に使用する前に、胞子状培養物を26〜30kg(30 x 43 x 15250 cm3)の茶色の紙袋に移す。</li>
	<li>紙袋の引張強度を向上させるために、各袋の上部の3分の1を水平に切り落とし、袋の底部を線で引いた(図3A、B)。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig03.jpg"> 図3:紙袋の調製、培養物の乾燥手順、および包装。(C,E)パーボイルド米および(D,F)フレーク大麦上で栽培したメタリジウム種培養物の乾燥手順。(G)紙袋をステープルで閉じて三角形のテント構造を作る。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="3"><li>各発酵袋内の基質を穏やかに崩壊させ、各袋の角を切り取り、切り取られた角が残した空間を通して培養物全体を紙袋に移す(図3C-F)。真菌胞子の空気中への過度の逃避を避けるために、このプロセスをゆっくりと実行してください。 注:汚染を避けるために、層流を使用して滅菌条件下でこのプロセスを実施してください。</li>
	<li>各紙袋にラベルを付け、各袋の上端を2回折り、ステープルで閉じて三角形のテント構造を作成し、ワイヤー乾燥ラックに袋を置き、±25°Cの制御された温度と30〜40%の低湿度で適切で乾燥させる。</li>
	<li>培養物の乾燥を均一にし、収穫可能な真菌胞子の収量を低下させる可能性のある栄養再成長を避けるために、毎日袋を回してください。</li>
	<li>乾燥工程中に2日毎に各乾燥袋を秤量し、連続する日の間に袋の質量にほとんどまたは全く変化が認められなくなるまで各袋について乾燥処理を継続する。</li>
</ol>5.真菌分生子の収穫
<ol><li>3つの入れ子付きふるいを用いて培養物から機械的に真菌分生子を採取し、試験篩(ETS)メッシュ番号35(500μm開口付き)、試験篩(212μm開口付き)、ETSメッシュ100号(150μm開口付き)に入れ子にし、収集パンに取り付けた。</li>
	<li>乾式培養サンプルをETSメッシュ35号篩にゆっくりと装填し、真菌分生子が空気中に放出されないようにふたをふるいにかける。</li>
	<li>10〜12個のガラス大理石をふるいに追加して、メッシュスクリーンを通る真菌分生子の通過を支援し、篩内の分生子の保持を回避し、胞子の回復を減少させる可能性がある。</li>
	<li>電気テープを使用してふるいの目地をテープで留めて密封し、分生子のほこりが逃げないようにします。</li>
	<li>粘着性パッドを取り付けた振動シェーカーの上にふるいを置き、収集パンとふるいを毎分560〜640振動の動きで20〜25分間固定します(図4)。 注:ヤロンスキーとジャクソン18から適応したテクニック。</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig04.jpg"> 図4:イネおよびフレーク化オオムギ上の乾燥 メタリジウム・ロベルツィイ 培養物からの真菌胞子の収穫。 (A)メッシュスクリーンを通る真菌分生子の通過を助けるためにふるいに10〜12個のガラス大理石を加える。 M. robertsii conidiaは、(B)米の培養物から収穫され、(C)かろうじてフレークされた。(D)振動シェーカーでふるいにかける。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63246/63246fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="6"><li>試験ふるいを収集パンから取り出し、分生子を収集し、収集した分生子を気密で水不透過性のジッパーロックバッグに保管し、長期保存(3〜6ヶ月)します。</li>
</ol>6. 生産される真菌分生子の定量化
<ol><li>各基質から真菌分生子を採取する前に、各粒子基質の質量を測定し、記録する。</li>
	<li>固体基質の質量から収集された胞子の質量を差し引くことによって、収集された分生子の全体重量を測定する。 注:総分生子収量は、収穫された分生子だけでなく、固体基質上に残された真菌分生子も含む。</li>
	<li>基板を秤量し、秤量した基板から10gを取り出す。10 gの基質を0.05%Tween 20に懸濁し、10 mLの滅菌蒸留水で希釈する。</li>
	<li>懸濁液を2分間ボルテックスミックスし、血球計数器を使用して胞子数を行い、基質から洗浄した分生子の数を求めた。</li>
	<li>10 mL洗浄した分生子懸濁液1000 μLを9 mLの滅菌蒸留水に移してさらに希釈を行い、10 mLの希釈懸濁液を作ります。</li>
	<li>分生子懸濁液を2分間渦混合し、分生子濃度を決定する。 注:Inglis、Enkerli、およびGoettel30 によって説明されている手順および式に従って、懸濁液の分生子濃度を決定する。</li>
	<li>各培養物から回収した分生子粉末の合計0.1gを0.05%Tween 20を添加した滅菌蒸留水10mLに回収・懸濁し、分生子懸濁液を2分間ボルテックスミックスし、血球計数器を用いて分生子濃度を求めた。</li>
	<li>10 mLの分生子懸濁液1000 μLを9 mLの滅菌蒸留水に移してさらに希釈を行い、10 mLの懸濁液希釈液を作ります。</li>
	<li>渦 - 分生子懸濁液を2分間混合し、分生子濃度を計算し、グラムあたりの分生子の数を決定する。</li>
	<li>採取した粉末のグラム当たりの分生子の数に、採取した分生子粉末の初期質量を掛ける。基質から洗浄された分生子の数に、分生子が採取された基質である使用済み基質の総重量を掛ける。</li>
	<li>2つの所与の値を一緒に加算し、基質の初期乾燥重量で除して、基質18のkgまたはg当たりの分生子の数を計算する。 注:計算は主に米基質について行われた。発芽または分生子生存率試験を 、M. pinghaense 分離株および M. robertsii 分離株の両方について実施し、産生された分生子の生存率を決定した。</li>
</ol>7. データ解析
<ol><li>適切なコンピュータソフトウェアプログラムを使用して、得られた結果の統計分析を行います。 注: データの統計分析は、STATISTICA バージョン 13.5.0.17 を使用して行われました。</li>
</ol>

<ol><li>Shah, P. A., Pell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+fungi+as+biological+control+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic fungi as biological control agents.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 61 (5), 413-423 (2003).</li>
<li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+biology+and+control+of+the+obscure+mealybug%2C+Pseudococcus+viburni+%28Hemiptera%3A+Pseudococcidae%29%2C+with+special+reference+to+biological+control+using+entomopathogenic+fungi+and+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22African+Entomology%22%5BJournal%5D)">A review of the biology and control of the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae), with special reference to biological control using entomopathogenic fungi and nematodes.</a> African Entomology. 29 (1), 1-16 (2020).</li>
<li>Ibrahim, L., Laham, L., Touma, A., Ibrahim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production%2C+yield%2C+quality%2C+formulation+and+efficacy+of+entomopathogenic+Metarhizium+anisopliae+conidia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Journal+of+Applied+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Mass production, yield, quality, formulation and efficacy of entomopathogenic Metarhizium anisopliae conidia.</a> Current Journal of Applied Science and Technology. 9 (5), 427-440 (2015).</li>
<li>Banu, J. G., Rajalakshmi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardisation+of+media+for+mass+multiplication+of+entomopathogenic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Standardisation of media for mass multiplication of entomopathogenic fungi.</a> Indian Journal of Plant Protection. 42 (1), 91-93 (2014).</li>
<li>Roberts, D. W., Humber, R. A. Entomogenous fungi. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoberts%2C+DW+%22Biology+of+Conidial+Fungi%22">Biology of Conidial Fungi</a>. Cole, G. T., Kendrick, W. B. , Academic Press. New York. 201-236 (1981).</li>
<li>Feng, M. G., Poprawski, T. J., Khachatourians, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+formulation+and+application+of+the+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+for+insect+control.+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control. Current status.</a> Biocontrol Science and Technology. 4 (1), 3-34 (1994).</li>
<li>Karanja, L. W., Phiri, N. A., Oduor, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+solid+substrates+on+mass+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae+entomopathogens%5BTitle%5D)+AND+%22The+Proceedings+of+the12th+KARI+Biennial+Scientific+Conference%22%5BJournal%5D)">Effect of different solid substrates on mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae entomopathogens.</a> The Proceedings of the12th KARI Biennial Scientific Conference. , Nairobi, Kenya. 8-12 (2010).</li>
<li>Prasad, C. S., Pal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+and+economics+of+entomopathogenic+fungus%2C+Beauveria+bassiana%2C+Metarhizium+anisopliae+and+Verticillium+lecanii+on+agricultural+and+industrial+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Scholars+Journal+of+Agriculture+and+Veterinary+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mass production and economics of entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae and Verticillium lecanii on agricultural and industrial waste.</a> Scholars Journal of Agriculture and Veterinary Sciences. 1 (1), 28-32 (2014).</li>
<li>Ehlers, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+entomopathogenic+nematodes+for+plant+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mass production of entomopathogenic nematodes for plant protection.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (5), 623-633 (2001).</li>
<li>Pham, T. A., Kim, J. J., Kim, S. G., Kim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+blastospore+of+entomopathogenic+Beauveria+bassiana+in+a+submerged+batch+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mycobiology%22%5BJournal%5D)">Production of blastospore of entomopathogenic Beauveria bassiana in a submerged batch culture.</a> Mycobiology. 37 (3), 218-224 (2009).</li>
<li>Bhadauria, B. P., Puri, S., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+using+agricultural+products%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bioscan%22%5BJournal%5D)">Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products.</a> The Bioscan. 7 (2), 229-232 (2012).</li>
<li>Latifian, M., Rad, B., Amani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+Metarhizium+anisopliae+by+using+agricultural+products+based+on+liquid-solid+diphasic+method+for+date+palm+pest+control%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Farming+and+Allied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mass production of entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae by using agricultural products based on liquid-solid diphasic method for date palm pest control.</a> International Journal of Farming and Allied Sciences. 3 (4), 368-372 (2014).</li>
<li>Agale, S. V., Gopalakrishnan, S., Ambhure, K. G., Chandravanshi, H., Gupta, R., Wani, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+%28Metarhizium+anisopliae%29+using+different+grains+as+a+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Current+Microbiology+and+Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mass production of entomopathogenic fungi (Metarhizium anisopliae) using different grains as a substrate.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (1), 2227-2232 (2018).</li>
<li>Jackson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+nutritional+conditions+for+the+liquid+culture+production+of+effective+fungal+biological+control+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimizing nutritional conditions for the liquid culture production of effective fungal biological control agents.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 19 (3), 180-187 (1997).</li>
<li>Deshpande, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycopesticides+production+by+fermentation.+Potential+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mycopesticides production by fermentation. Potential and challenges.</a> Critical Reviews in Microbiology. 25 (3), 229-243 (1999).</li>
<li>Sahayaraj, K., Namasivayam, S. K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+production+of+entomopathogenic+fungi+using+agricultural+products+and+by+products%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mass production of entomopathogenic fungi using agricultural products and by products.</a> African Journal of Biotechnology. 7 (12), 1907-1910 (2008).</li>
<li>Feng, K. C., Liu, L. B., Tzeng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verticillium+lecanii+spore+production+in+solid-state+and+liquid-state+fermentations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+Engineering%22%5BJournal%5D)">Verticillium lecanii spore production in solid-state and liquid-state fermentations.</a> Bioprocess Engineering. 23 (1), 25-29 (2000).</li>
<li>Jaronski, S. T., Jackson, M. A. Mass production of entomopathogenic Hypocreales. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJaronski%2C+ST+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology+2nd+edition%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology 2nd edition</a>. Lacey, L. A. , Academic Press. London. 255-284 (2012).</li>
<li>Vega, F. E., Jackson, M. A., Mercandier, G., Poprawski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+nutrition+on+spore+yields+for+various+fungal+entomopathogens+in+liquid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The impact of nutrition on spore yields for various fungal entomopathogens in liquid culture.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 19 (4), 363-368 (2003).</li>
<li>El Damir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+growing+media+and+water+volume+on+conidial+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of growing media and water volume on conidial production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Journal of Biological Sciences. 6 (2), 269-274 (2006).</li>
<li>Pandey, A. K., Kanaujia, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+grains+as+solid+substrates+on+sporulation%2C+viability+and+pathogenicity+of+Metarhizium+anisopliae+%28Metschnikoff%29+Sorokin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Effect of different grains as solid substrates on sporulation, viability and pathogenicity of Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin.</a> Journal of Biological Control. 22 (2), 369-374 (2008).</li>
<li>Kassa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whey+for+mass+production+of+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae%5BTitle%5D)+AND+%22Mycological+Research%22%5BJournal%5D)">Whey for mass production of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Mycological Research. 112 (5), 583-591 (2008).</li>
<li>Sharma, S., Gupta, R. B. L., Yadavam, C. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+suitable+medium+for+mass+multiplication+of+entomofungal+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Selection of a suitable medium for mass multiplication of entomofungal pathogens.</a> Indian Journal of Entomology. 64 (3), 254-261 (2002).</li>
<li>Bich, G. A., Castrillo, M. L., Villalba, L. L., Zapata, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+rice+by-products%2C+incubation+time%2C+and+photoperiod+for+solid+state+mass+multiplication+of+the+biocontrol+agents+Beauveria+bassiana+and+Metarhizium+anisopliae%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of rice by-products, incubation time, and photoperiod for solid state mass multiplication of the biocontrol agents Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae.</a> Agronomy Research. 16 (5), 1921-1930 (2018).</li>
<li>Price, R. E., Müller, E. J., Brown, H. D., D'Uamba, P., Jone, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+trial+of+a+Metarhizium+anisopliae+var.+acridum+mycoinsecticide+for+the+control+of+the+red+locust+in+a+recognised+outbreak+area%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Tropical+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">The first trial of a Metarhizium anisopliae var. acridum mycoinsecticide for the control of the red locust in a recognised outbreak area.</a> International Journal of Tropical Insect Science. 19 (4), 323-331 (1999).</li>
<li>Hatting, J. L., Moore, S. D., Malan, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+control+of+phytophagous+invertebrate+pests+in+South+Africa.+Current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Invertebrate+Pathology%22%5BJournal%5D)">Microbial control of phytophagous invertebrate pests in South Africa. Current status and future prospects.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 165, 54-66 (2019).</li>
<li>Mathulwe, L. L., Malan, A. P., Stokwe, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+screening+of+entomopathogenic+fungi+and+nematodes+for+pathogenicity+against+the+obscure+mealybug%2C+Pseudococcus+viburni+%28Hemiptera%3A+Pseudococcidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biocontrol+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Laboratory screening of entomopathogenic fungi and nematodes for pathogenicity against the obscure mealybug, Pseudococcus viburni (Hemiptera: Pseudococcidae).</a> Biocontrol Science and Technology. , (2021).</li>
<li>Inglis, G. D., Enkerli, J., Goettel, M. S. Laboratory techniques used for entomopathogenic fungi: Hypocreales. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInglis%2C+GD+%22Manual+of+Techniques+in+Invertebrate+Pathology%22">Manual of Techniques in Invertebrate Pathology</a>. , Academic Press, Elsevier. Chapter 7 189-253 (2012).</li>
<li>Mehta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+carbon+%26+nitrogen+sources+on+the+Trichoderma+viride+%28Biofungicide%29+and+Beauveria+bassiana+%28entomopathogenic+fungi%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of carbon & nitrogen sources on the Trichoderma viride (Biofungicide) and Beauveria bassiana (entomopathogenic fungi).</a> European Journal of Experimental Biology. 2 (6), 2061-2067 (2012).</li>
<li>Burges, H. D. Formulation of mycoinsecticides. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurges%2C+HD+%22Formulation+of+Microbial+Biopesticides%22">Formulation of Microbial Biopesticides</a>. , Springer. Dordrecht. 131-185 (1998).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

農業生態系における重要な農業害虫の生物学的防除のための微生物剤の統合の成功は、実験室条件下での第一歩としての昆虫病原体の成功と大量生産の容易さの両方に依存する。EPFの大量生産は、生物学的制御9、10、11、12、13を用いたIPMプログラムのためのEPF製品の大規模な適用と入手可能性にとって重要である。異なるEPF分離株の大量生産の成功は、生産基質または培地の栄養成分によって影響され、これは、それらの有効性、乾燥耐性、圃場の持続性、および分生子収量を含む、結果として生じる分生子の属性に大きく影響する8、19、20、</...

昆虫病原性真菌(EPF)は、重要な農業害虫の生物学的防除における作物保護剤として重要性を増している1、2。土壌中に自然に発生する昆虫病原体は、様々な害虫種の集団に流行を引き起こす3。EPFの種は宿主特異的であり、非標的種を攻撃するという点で比較的リスクが少なく、環境に対して毒性がない4。EPF には、ホストに侵入するための独自のメカニズムと、その直接の環境での伝播と永続化のための独自のメカニズムがあります 1。彼らは主に宿主のキューティクルに付着して浸透する無性胞子を介して宿主を攻撃し、宿主のヘモコエルに侵入して増殖する。宿主は、最終的に血リンパ栄養素の枯渇のために、または真菌によって放出される毒性代謝産物によって引き起こされる毒素血症の結果として死亡する。死後、理想的な環境条件下で、真菌は宿主死体5,6の外表面(明白な真菌症)に出現する。
残留化学物質が人間の健康、環境汚染、および害虫抵抗性の開発に及ぼす悪影響に関する懸念の高まりは、化学ベースの殺虫剤の投入を減らし、作物保護と害虫駆除のための代替的で斬新で持続可能な戦略を見つける世界的な推進力をもたらしました6,7,8 .これは、従来の化学防除よりも生態学的に有利な戦略である統合害虫管理(IPM)プログラムで使用するための微生物ベースの殺虫剤を開発する機会を提供しました3,8。
農業害虫のための微生物防除剤の開発を成功させるためには、まず適切な生物を単離し、特徴付け、同定し、標的害虫に対するその病原性を確認しなければならない。しかしながら、微生物剤の大規模生産のための容易で費用対効果の高い方法は、生物学的制御プログラム9、10、11、12、13において使用するための生存可能な生成物を製造するために必要とされる。相当量の良質の昆虫病原体の大量生産は、微生物株、環境、標的害虫、製剤、市場、施用戦略、および所望の最終製品に依存する14、15、16。EPFは、胚芽胞子を生成するための液体基質発酵または空中分生子6、17、18を生成する固体基質発酵プロセスを使用して大量生産することができる。しかし、昆虫病原体の大量生産および製剤化プロセスは、最終製品の病原性、コスト、貯蔵寿命、および現場有効性に直接影響する。IPMでの使用を成功させるためには、昆虫病原体の生産プロセスは、実行が容易で、最小限の労力を必要とし、毒性、生存可能、および持続性の高収量濃度のプロパグルを生産し、低コストでなければならない4,13,14,16。
昆虫病原体の栄養要件を理解することは、すべての培養方法による大量培養にとって重要である4,12。生産培地の栄養成分は、生物防除有効性、収量、乾燥耐性、および持続性を含む、結果として生じるプロパグルの属性に重大な影響を及ぼす8、19、20、21。生産手順の最適化は、このような要因に対処するように設計されています 22.EPFにとって、真菌分生子の良好な成長、胞子形成、および大量生産のための主な要件は、適切な水分、最適な成長温度、pH、CO2およびO2のガス交換、ならびに良好なリン、炭水化物、炭素、および窒素源を含む栄養である18。
JaronskiとJackson18は、自然条件下では、真菌の分生子が昆虫の死体の表面のような固体直立構造に担がれるため、固体基質発酵法を液体基質発酵法と比較してEPF生産のための自然プロセスに最も効率的かつ最も近い近似法として記述している。デンプンを含む農産物および副産物は、真菌が菌糸先端からの高濃度加水分解酵素の分泌を介してデンプンを容易に分解し、固体物質に浸透し、物質中に存在する栄養素にアクセスするため、主に低クレアリア菌の大量生産に使用されている11、17、18、23.穀物製品はまた、それらが水和および滅菌されると、基質が任意の液体媒体16、18、24からさらなる栄養素を吸収することができるので、健康なバイオマス生産のための要件を提供する。
以前は、いくつかの研究がボーベリア・バッシアナ(Bals)のようなEPF種を大量培養しようと試みた。Vuil., Cordyceps fumosorosea (Wize) Kelper B. Shrestha & Spatafora, Verticillium lecanii (Zimm.)ViegasとMetarhizium anisopliae(Metschn)の一部。ソロキン種複合体は、種々の基質16、23、24上に単離する。このような大量生産され商業的に開発された分離株には、M. anisopliae var Metarhizium acridum (Driver & Milner) J.F. Bisch, Rehner & Humberから開発されたGreen Muscle®(株IMI 330189)、Metarhizium 69(Meta 69株ICIPE69)、およびM. anisopliaeから開発されたReal Metarhizium 69(L9281)、およびB. bassiana25,26から開発されたBroadband® (株PPRI 5339)およびEco-Bb®が含まれる。.しかし、Metarhizium robertsii J.F. Bisch、S.A. Rehner & Humber、Metarhizium pinghaense Chen & Guoを大量培養する試みは限定的である。これら2つの分離株は、以前の研究で、ミツバチ、Pseudococcus viburni Signoret(半翅目:Pseudococcidae)の防除に最も効果的であるものとして選択されました27。したがって、現在の研究は、害虫に対する商業的適用のために、M. robertsiiおよびM. pinghaenseの局所分離株の十分な数の弾力性のある感染性プロパグルを処方し、大量生産することを目的としていた。固体基質発酵法を用いて、両方のEPF分離株について真菌分生子を大量生産した。2つのEPF接種法は、分生子懸濁液および胚芽胞子の液体真菌培養物を使用して、固体基質を接種するために使用した。

<table><tbody><tr><td>0.05% Tween 20</td><td>Lasec</td><td></td><td>分生子懸濁液に添加して、真菌胞子を水と混合できるように</td></tr><tr><td>20mL McCartney ボトル</td><td>Lasec</td><td></td><td>分生子懸濁液の製造に使用</td></tr><tr><td>アルミホイル</td><td></td><td></td><td>250mLフラスコの脱脂綿プラグのカバーとして使用</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td></td><td></td><td>分生子製造に使用される材料と成分の滅菌に使用プロセス</td></tr><tr><td>オートクレーブバッグ</td><td>Lasec</td><td></td><td>発酵バッグまたは固体基板容器</td></tr><tr><td>オートクレーブテープ</td><td>Lasec</td><td></td><td>発酵バッグのPVCパイプを固定するには</td></tr><tr><td>茶色のクラフト紙袋</td><td></td><td></td><td>農業用穀物の分生子培養物を乾燥させるために使用されます</td></tr><tr><td>Bunsen burnner</td><td>Labnet (Labnet International, Inc.)</td><td></td><td>装置(外科用ブレード、接種ループ、フラスコの縁)</td></tr><tr><td>クリアエッジテストふるい</td><td></td><td></td><td>農業用穀物基質から菌類分生子を分離するために使用される</td></tr><tr><td>トウモロコシの急な酒</td><td>SIGMA</td><td>66071-94-1</td><td>胞子液体媒体の成分</td></tr><tr><td>コットンウール</td><td>ラセック</td><td></td><td>発酵バッグの首のプラグとして使用</td></tr> デュ<tr><td>ラン研究所ボトル</td><td>Neolab</td><td></td><td>SDA培地および蒸留水オートクレーブに使用</td></tr><tr><td>電気テープ</td><td></td><td></td><td>針葉樹の粉塵の脱出を防ぐためにふるいジョイントをテープで固定し、シールするために使用されます</td></tr><tr><td>ENDECOTTS試験ふるい</td><td></td><td></td><td>農業用穀物基質から真菌性分生子を分離するために使用されます</td></tr><tr><td>三角フラスコ、ナローネック、250mLフラスコ</td> 胞子液体培地の<td>ラセック</td><td></td><td>キャリア</td></tr><tr><td>エタノール(99%)</td><td>Lasec</td><td></td><td>外科用ブレードと接種ループの滅菌に使用</td></tr><tr><td>フレーク状大麦</td><td>健康接続 ホールフーズ</td><td></td><td>農業用穀物 M. pinghaenseおよびM. robertsii</td></tr><tr><td>フレーク状オーツ麦</td><td>タイガーブランド</td><td></td><td>M. pinghaenseおよび. roberts<ii/em>グルコースの両方の分生子のための固体基質成長媒体として使用される農業穀物</td></tr> <tr><td></td><td>胚胞子液体培地</td><td></td>の成長チャンバー/インキュベーター 成長する真菌分生子培養用血球計算盤 分生子濃度を決定するために使用されます<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>接種ループ</td><td>Lasec</td><td></td> 胞子の成長<td>のための液体媒体を無菌化するために胞子を収穫するため</td></tr><tr><td>キッチン麺棒</td><td></td><td></td><td>固体穀物基質床を操作するために使用されます</td></tr><tr><td>層流キャビネット</td><td>ESCO 層流キャビネット</td><td></td><td>基質接種中に無菌環境として提供</td></tr><tr><td>Metarhizium pinghaense conidia</td><td>ステレンボッシュ大学</td><td>5HEID</td><td>分生子の大量培養に用いた培養物 Metarhizium pinghaense<</td></tr><tr><td>><>分生子 分生子</td><td>ステレンボッシュ大学</td><td>6EIKEN</td> 分<td>生子の大量培養に用いた培養物 Metarhizium robertsii</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>ZEIZZ (Scope.A1)</td><td></td><td>分生子濃度と分生子生存率の測定に使用</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>IncoShake-LABOTEC</td><td></td><td>胚胞子製造プロセスに使用</td></tr><tr><td>パーボイルド米</td><td>Spekko</td><td></td><td>農業用穀物 M. pinghaense M. robertsii</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>SIGMA</td><td></td><td>細菌汚染を防ぐためにSDA培地</td></tr>に追加 <tr><td>ペトリ皿</td><td>SDA培地用ラ</td><td>セック</td><td></td>容器</tr><tr><td>ピペットとピペットチップ</td><td>ラブネット(BioPette PLUS)</td><td></td><td>液体成分の測定に使用</td></tr><tr><td>ポリ塩化ビニルマーリー 廃棄物パイプ</td><td></td><td></td><td>発酵バッグのネックを作成するために使用</td></tr><tr><td>リン酸二塩基性カリウム(K2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>胚胞子液培地の成分</td></tr><tr><td>ゴムバンド</td><td></td><td></td><td>発酵バッグに外科用紙を固定するために使用されます PVCパイプネック</td></tr><tr><td>Sabaroud dextrose 寒天培地 (SDA)</td><td>NEOGEN 培養培地</td><td></td><td>Metarhizium pinghaense と Metarhizium robertsii滅菌蒸留水の両方の胞子を培養するために使用される培地</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>農業用穀物を水和させるため、針生子懸濁液を作るために</td></tr><tr><td>粘着パッド</td><td></td><td></td><td>振動シェーカーのセイブを固定するために使用されます</td></tr><tr><td>外科用ブレード</td><td>ラセック</td><td></td><td>真菌培養物から胞子をこすり落とすために使用されます</td></tr><tr><td>サージカルペーパー</td><td>ラセック</td><td></td><td>発酵バッグのPVCネックと脱脂綿プラグを覆うために使用されます</td></tr><tr><td>振動シェーカー</td><td></td><td></td><td>農業用穀物基材の分生子を振り落とすために使用</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Labnet(Labnet International, Inc.)</td><td></td><td>マックカートニーボトルの分生子懸濁液を混合するために使用されます</td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Biolab</td><td></td><td>は、胞子の発芽と成長を改善するためにSDA培地に追加</td></tr>されました <tr><td>ジッパーロックバッグ</td><td>GLAD</td><td></td><td>収穫した真菌分生子を保存するために使用されます</td></tr></tbody></table>

昆虫病原性真菌、メタリシウム・ロベルツィイおよびメタリシウム・ピンヘーンセの大量生産、害虫に対する商業利用

Mass Production of Entomopathogenic Fungi, Metarhizium robertsii and Metarhizium pinghaense, for Commercial Application Against Insect Pests

メタリジウム・アニソプリアエ種複合体の昆虫病原性真菌は、農業害虫の生物防除剤として重要性を増している。化学殺虫剤に対する害虫抵抗性の増加、殺虫剤の人間の健康への悪影響に関する懸念の高まり、および農薬による環境汚染は、作物保護と害虫駆除のための新しい持続可能な戦略を見出す世界的な推進力をもたらしました。これまで、ボーベリア・バッシアナのような昆虫病原性真菌(EPF)種を大量培養する試みが行われている。しかしながら、昆虫害虫に対する使用のためにメタリジウム・ロベルツィイおよびM. pinghaenseを大量培養する試みは限定的にしか行われていない。この研究は、M. robertsiiおよびM. pinghaenseの南アフリカの分離株の十分な数の弾力性感染性伝播剤を商業用途のために大量生産することを目的としていた。3つの農業穀物製品、フレークドオート麦、フレーク大麦、および米をEPF固体発酵基質として使用した。2つの接種方法、分生子懸濁液および胚芽胞子の液体真菌培養物を固体基質に接種するために使用した。分生子懸濁液を用いた接種は、ブラストスポア接種法を使用した場合と比較して固体基質上に増加したレベルの汚染が観察されたため、比較的効果が低いことが観察された。フレーク状のオート麦は、M. robertsiiとM. pinghaenseの両方にとって適切な成長基質ではないことが判明し、基質から乾燥分生子が採取されなかった。フレーク状の大麦は、M. pinghaenseのそれよりもM. robertsii conidiaの生産に有利であることが見出され、平均1.83g±1.47gの乾燥M. robertsii分生子および0グラムのM. pinghaense分生子が基質から収穫された。 米粒は、M. pinghaense分離株とM. robertsii分離株の両方の分生子大量生産に有利に働くことが見出され、基質から収穫された±平均8.2g±4.38gおよび6gである。

M. pinghaenseとM. robertsiiの両方について、イネ上の培養物の含量質量の減少は、真菌培養物の乾燥段階で経時的に観察され、培養物が乾燥した後、質量に変化は見られなかったか、またはほとんど観察されなかった(図5)。M. pinghaenseとM. robertsiiの両方の回収された乾燥真菌分生子粉末を図6に示す。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63246/63246fig05.jpg"> 図5:10日間にわたるイネ(95%信頼区間)上の メタリシウム・ロベルツィイ および M. pinghaense 培養物...

昆虫病原性真菌は、農業害虫の生物防除剤として重要性を増している。この研究では、害虫に対する商業利用のために、 Metarhizium robertsii および M. pinghaense の両方の南アフリカの分離株の十分な数の弾力性感染性プロパグルの大量生産が、農業穀物製品を使用して首尾よく行われた。

Entomopathogenic fungi of the Metarhizium anisopliae species complex have gained importance as the biological control agents of agricultural insect pests. ...

この方法は、環境や人間の健康に対する毒性の影響が懸念され、ほとんどの殺虫剤が段階的に廃止されている現状を踏まえ、商業農業生態系における重要な害虫を防除するために、昆虫病原性真菌の感染性分生子を大量生産する方法に関する新しい情報を提供します。この技術は、大量生産中にEPF分生子の最適な収率を保証するために使用される方法を説明しています。この方法は、農業生態系における有害な殺虫剤耐性昆虫害虫の大規模管理に対する大量生産分生子の有効性に関する洞察を提供することにより、統合された害虫管理および生物学的防除に役立つ。この手順は、Letodi Luki Mathulwe博士、Nomakholwa Faith Stokwe博士、Antoinette Paula Malan教授によって開発され、実証されました。1リットルの蒸留水を加熱し、沸点に達する前に火を止めます。次に、30グラムのグルコース、4グラムのリン酸カリウム二塩基、20グラムの酵母エキス、15ミリリットルのコーンスティープリカーを加え、内容物を2〜3分間穏やかに沸騰させます。合計100ミリリットルの培地を9つの異なる250ミリリットルフラスコに注ぐ。各フラスコにコットンウールプラグを置き、栓としてアルミホイルでコットンウールを覆います。フラスコ内の培地を121°Cで55分間オートクレーブする。その後、フラスコ内の培地を冷却し、各フラスコ内の培地にストレプトマイシン1ミリリットル当たり10ミリグラムを加える。両方のEPF分離株について、2〜3週齢の真菌培養プレートから真菌分生子の2〜3個の細菌ループを収集する。真菌分生子を滅菌条件下で250ミリリットルフラスコ内の液体培地の各100ミリリットルに移し、フラスコを密封する。液体培養フラスコを約25°Cで140RPMのオービタルシェーカー上で3日間インキュベートし、培養物が真菌芽胞子の成長を伴う高い濁度の徴候を示したらインキュベーションを停止する。培養物からの細菌汚染の可能性を検出するために、24時間の培養後に各液体培養フラスコから100マイクロリットルのサンプルを引き出し、単離物ごとに3つのSDAプレート上にプレートする。プレートをプラスまたはマイナス25°Cの制御された温度で48時間インキュベートする。小さなポリ塩化ビニル廃液パイプを使用して、オートクレーブバッグの開放端に発酵バッグ用のネックを作成し、オートクレーブテープを使用してパイプを固定します。発酵中に十分なガス交換を可能にするために、滅菌コットンウールプラグでパイプを閉じます。パーボイルド長粒白米を、メタリシウム・ピンヘンセとメタリシウム・ロバーツイの両方の芽胞子の固体基質培地として使用する。発酵袋ごとに、1キログラムの米と300ミリリットルの滅菌蒸留水を加える。発酵袋の内容物を静かに混ぜる。それらを外側

mass-production-entomopathogenic-fungi-metarhizium-robertsii

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、農業における害虫防除のための「最良適合」昆虫病原菌、 Metarhizium anisopliaeの単離、同定、スクリーニング、および選択を含む、効果的な除草剤の知識ベース開発に関わる様々な段階を報告する。...

開発<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Mycoinsecticideとして：分離から畑作まで

ここでは、土壌サンプルから病原性真菌(EPF)を単離・選択するために用いたミミズ(テネブリオモリター)-ベイトシステムに基づくプロトコルを提示する。有効なコニディア数(ECN)式は、現場での害虫微生物制御のための生理学的特性に基づいて高い耐ストレスEPFを選択するために使用される。...

土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価

昆虫病原性真菌コロニーは、 テネブリオ 餌、 ガレリア...

土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較

ここでは、森林のウッドボーラーから昆虫病原性真菌を取得するためのプロトコルと、鞘翅目モデル昆虫を使用してそれらの昆虫病原性活性を評価するための代替方法を示します。この方法は、自然林の木材を退屈する害虫から昆虫病原性真菌資源を探索するのに効率的で便利です。...

森林ウッドボーラーからの昆虫病原性真菌の分離、行動同定、および病原性評価

私たちは、生物殺虫剤として昆虫病原性線虫を大量増殖させるための農家向けの2つの方法を提案します。最初の方法はポリアクリルアミドゲルを線虫培養基質として使用し、2つ目はポリマーコーティングされた綿を培養基質として使用します。いずれの方法も昆虫死体内で線虫の生 体内...

昆虫病原性線虫の栽培者ベース in vivo 増殖

昆虫細胞を調製し、mCD1d四量体を生成する組換えmCD1d...

昆虫細胞における組換えmCD1dタンパク質の製造方法。

Kindlinsは、インテグリンを介して細胞間接着の基本であるが、それらの研究では、細菌宿主において組換えそれらを発現で遭遇する困難によって妨げられてきた。ここでは、バキュロウイルス感染昆虫細胞での効率的な生産のための方法を記載している。...

生物物理学研究のための昆虫細胞からの効率的な生産と組換えマウスKindlin-3の精製

RNA-Seq解析は、非モデル生物の適応形質の分子基盤を特定するためにますます重要になってきています。ここでは、蚊の飼育からRNAシーケンシング、RNA-Seqデータのバイオインフォマティクス解析まで、休眠時と非休眠型のAedes...

アジアのタイガーモスキートにおける日長休眠のRNA-seqの分析のための実験とバイオインフォマティクス·プロトコル、ヒトスジシマカ

重要な蛍光色素は、現代の真菌細胞生物学における生細胞イメージング解析に不可欠なツールです。本論文では、糸状菌における血漿膜動態、エンド/エキソサイトーシスおよび細胞壁形態形成を追跡するための確立された、あまり知られていない蛍光色素の適用について詳しく述べる。...

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

CRISPR/Cas9は、非モデル生物の遺伝子機能を特徴付けるためにますます使用されています。このプロトコルは、注射ミックスの調製から蚊の胚の取得と注入に、および必要な突然変異のために注入された蚊とその子孫を飼育、横断、およびスクリーニングする方法に 、Culex...

CRISPR/Cas9を使用してヌル突然変異を生成するための Culex 蚊の胚の調製と注入

学ぶ昆虫病原性真菌Metarhizium robertsiiおよびM. pinghaenseの感染性子嚢胞の大量生産法。米を基質とした固体培養とブラストスポア接種技術により、商業的バイオコントロール剤の最適な収量を達成する方法です。

昆虫病原性真菌、メタリシウム・ロベルツィイおよびメタリシウム・ピンヘーンセの大量生産、害虫に対する商業利用

さらに動画を探す