Name: in vitroでのパラクリン非標準Wntシグナル伝達のモデリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学ぶパラクリン非標準Wntシグナル伝達のin vitroモデリング法。マウス神経堤細胞とC2C12筋芽細胞を用いてWnt5aの機能的・分子的評価を行い、細胞移動とシグナル機構を解析する再現性の高いプロトコルです。

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この研究の一部は、NIHがO.T.にF30HL154324を、S.R.K.にK08HL121191およびR03HL154301を授与したことによって支援されました。著者らは、この原稿の 図1 の回路図が biorender.com で作成されたことを認めたいと思います。

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
<li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+instruction+to+output%3A+Wnt%2FPCP+signaling+in+development+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer.</a> Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).</li>
<li>Shi, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Dishevelled-Mediated+Wnt+Signaling+in+Vertebrate+Early+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370(2020).</li>
<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
<li>Bradshaw, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+for+neural+crest+cells+during+outflow+tract+septation+in+the+neural+crest-deficient+mutant+Splotch2H%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H.</a> Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).</li>
<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
<li>Schleiffarth, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+is+required+for+cardiac+outflow+tract+septation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice.</a> Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).</li>
<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。

非標準的なWnt/平面細胞極性(PCP)シグナル伝達経路は、複数の発生24,25および疾患プロセス24,26に関与している非常に重要な細胞シグナル伝達経路です。胚発生中、非標準的なWntシグナル伝達は、シグナル伝達細胞からの分子シグナルの広範なネットワークを含み、最終的にはシグナル受信細胞における形態の変化、非対称組織、および方向性の移動を誘導する11。以前の研究では、このシグナル伝達を駆動する特定のリガンド受容体経路は多様で状況依存的であり、細胞タイプ間で異なることが多いことが示されています12、13、14、15。</...

非標準的なWntシグナル伝達は、細胞フィラメントの構成と方向性の移動を調節する進化的に保存された経路です。この経路は、胚組織形態形成1,2,3、リンパおよび血管血管新生4,5,6,7、および癌の成長および転移8,9,10を含む複数の生物学的プロセスに関与しています。.細胞レベルでは、非標準的なWntシグナル伝達は、シグナル伝達細胞とシグナル受信細胞の間の協調的なパラクリン相互作用を介して行われます。これらの相互作用は、異なる系統またはタイプの細胞間で頻繁に起こり、最大19個のリガンドおよび複数の受容体、共受容体、および下流のシグナル伝達エフェクターを含む多様な分子ネットワークを含む11。このシグナル伝達プロセスをさらに複雑にしているのは、リガンドと受容体の組み合わせが状況依存的および組織依存的に変化する可能性があることが以前の研究で示されている12,13、およびシグナル受信細胞で非標準的なWntシグナル伝達を駆動する同じソースリガンドが複数のシグナル送信細胞タイプによって生成される可能性があることが示されています14,15。.非標準的なWntシグナル伝達に関連する細胞および分子の複雑さを考えると、in vivoで個々の臨床的に関連するメカニズムを研究する能力は限られています。
 インビトロでの細胞培養技術を用いて非標準的なWntシグナル伝達を研究する試みがなされている。例えば、細胞単層で実施される創傷治癒アッセイは、細胞指向性移動を機能的に評価するために使用されてきた4、16、17、18、19。免疫染色技術は、細胞形態7,10、構造、および非対称分極における非標準的なWnt誘発変化を評価するために、表面タンパク質発現の空間解析を実行するために使用されています7,10,および非対称分極18,19,20。 これらのアプローチは、シグナル受信細胞におけるWnt関連の表現型を特徴付けるための重要なツールを提供してきましたが、これらのプロトコルにシグナル送信コンポーネントがないため、in vivoで観察されるパラクリンシグナル伝達メカニズムを正確にモデル化する能力が制限されています。その結果、非標準的なWnt経路のシグナル送信細胞と受信細胞、特に異なる細胞タイプの細胞間のパラクリンシグナル伝達相互作用の堅牢で再現性のある評価を可能にするin vitroシステムを開発することが依然として重要です。
この目的のために、この研究の主な目的は、in vitroでパラクリン非標準的なWntシグナル伝達相互作用をモデル化するためのプロトコルを確立することでした。私たちは、これらの相互作用のシグナル送信およびシグナル受信成分を再現し、標準的な分子、遺伝、または薬理学的アプローチを使用して、非標準的なWnt経路における特定のリガンド受容体メカニズムを独立して研究できる非接触共培養システムを開発しました。NCCを介したWntシグナル伝達のメカニズムを、確立されたマウス細胞株を用いて筋芽細胞で調べました。原理の証明として、このモデルは、NCCs21とSHF心筋芽細胞前駆細胞との間の関連する非標準的なWntシグナル伝達経路としてWnt5a-ROR2軸を関与させるマウスにおける以前のin vivo研究の所見を裏付けるために使用された3,22,23。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>退色防止封入剤 DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>4°Cで保存C</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td><td>sc-2323</td><td>4°C;C</td></tr><tr><td>C2C12 マウス筋芽細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ、75 cm2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Chamber Slide System, 4-well</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'のモディファイドイーグル」s ミディアム (DMEM)、高グルコース (4.5 g/L)、L-グルタミン (2 mM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td>4 °C;C</td></tr><tr><td>Falcon コニカル遠心チューブ、15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 透過性サポート 24 ウェルプレート用 0.4 &micro;M 透明 PET 膜</td><td>コーニング</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>W3381E</td><td>50 mL アリコートに -20 >C</td></tr><tr><td>ゼラチン溶液、0.1%</td><td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>目盛り付き滅菌ピペットチップ、10 & マイクロ;L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子 (LIF), 106 unit/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>最小必須培地 (MEM)</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm</td><td>Springside Scientific</td><td>HRTCG2455</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 神経堤細胞株</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒドPBSの溶液、4%</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mLペニシリンおよび10,000 &mu;g/mL streptomycin)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>10 mL アリコートで -20 °C で保存。C</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>-20 °Cで保存。C、軽い</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1x、カルシウムとマグネシウムなし、pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>4°Cで保存してください。C</td></tr>組<tr><td>換えヒト線維芽細胞増殖因子-塩基性(rhFGF-basic)</td><td>R&D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト/マウス Wnt5a タンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム、100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>グリッド付き正方形ペトリ皿</td><td>Thomas Scientific</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO マウス線維芽細胞フィーダー細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA、0.25%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>W3513C</td><td>4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>Zeiss Apotome.2 蛍光顕微鏡</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss inverted Axio Vert.A1 光学顕微鏡</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012 顕微鏡ソフトウェア</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>イメージングソフトウェア</td></tr></tbody></table>

in vitroでのパラクリン非標準wntシグナル伝達のモデリング

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

非標準的なWntシグナル伝達は、胚形成中の細胞内アクチンフィラメント組織および前駆細胞の分極した遊走を調節する。このプロセスには、シグナル伝達細胞とシグナル受信細胞の間の複雑で協調的なパラクリン相互作用が必要です。これらの相互作用が異なる系統のさまざまな種類の細胞間で発生する可能性があることを考えると、細胞特異的欠陥の in vivo 評価は困難な場合があります。本研究では、 in vitro でパラクリン非標準的なWntシグナル伝達を評価するための再現性の高い方法について説明します。このプロトコルは、(1)関心のある任意の2つの細胞型間で非標準的なWntシグナル伝達の機能的および分子的評価を実施する能力を備えて設計されました。(2)非標準的なWntシグナル伝達経路におけるシグナル伝達分子とシグナル受信分子の役割を分析する。(3)標準的な分子学的または薬理学的アプローチで表現型レスキュー実験を実施する。
このプロトコルは、筋芽細胞における神経堤細胞(NCC)を介した非標準的なWntシグナル伝達を評価するために使用されました。NCCの存在は、筋芽細胞におけるファロイジン陽性細胞質糸状足および層状突起の数の増加、ならびに創傷治癒アッセイにおける筋芽細胞遊走の改善と関連している。 Wnt5a-ROR2 軸は、NCCと第二心野(SHF)心筋芽細胞前駆細胞との間の重要な非標準的なWntシグナル伝達経路として同定されました。結論として、これはin vitroでパラクリン非標準的なWntシグナル伝達メカニズムを研究するための非常に扱いやすいプロトコルです。

マウス筋芽細胞の遊走能に及ぼすNCCの影響 このアッセイは、筋芽細胞の移動能力に対するNCCの影響を評価するために最初に適用されました。 図1 は、アッセイの概略モデルの概要を示す。この影響をテストするために、スクラッチアッセイは、インサートの存在下で増殖したものと比較して、分離して増殖した筋芽細胞(NCCインサートなし)で実施されました。ポジティブコントロールとして、500 ng/mLの組換えWnt5a(rWnt5a)をNCCインサートを備えたチャンバーウェルに加えました。このrWnt5aの濃度は、C2C12細胞において実施された用量反応分析によって決定された(補足図S1)。NCCインサートの代表的な画像を 補足図S2に示し、NCCが現時点で健康であることを示しています。免疫蛍光は、50 nMの Wnt5a siRNAとのインキュベーション後にタンパク質レベルでWnt5aの堅牢なノックダウンを示します(補足図S3)。9...

本研究では、パラクリンの非標準的なWntシグナル伝達イベントを in vitroで 研究するための再現性が高く扱いやすい方法を概説しています。このプロトコルは、マウス神経堤細胞および筋芽細胞におけるパラクリンWnt5aシグナル伝達の影響を評価するために適用されました。

in vitroでのパラクリン非標準Wntシグナル伝達のモデリング

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

このプロトコルは、関心のある任意の細胞集団におけるパラクリン非標準的なWntシグナル伝達を機能的および分子的に評価するための再現性の高い方法を概説しています。機能評価および分子評価は同じ細胞集団で行われ、Wnt/PCP経路の任意の成分の研究に適用できます。まず、以前にペレット化したC2C12細胞を10ミリリットルのC2C12培地に再懸濁します。細胞を1:20の比率で希釈するには、9.5ミリリットルの新鮮なC2C12培地を含む15ミリリットルのチューブに0.5ミリリットルの細胞懸濁液を加え、P1000ピペットを使用して血清学的ピペットと穏やかに混合し、1ミリリットルの希釈細胞懸濁液を新しい4チャンバーウェルの各ウェルに加え、インキュベーターに入れます。O9-1細胞インサートをプレーティングするには、O9-1細胞ペレットを10ミリリットルのO9-1増殖培地に再懸濁します。また、C2C12細胞希釈と同様に、O9-1細胞を1:20の比率で希釈します。次に、1ミリリットルのO9-1増殖培地で満たされた新しい4つのチャンバーウェルの各ウェル内に単一の透過性インサートを配置します。300マイクロリットルの希釈したO9-1細胞懸濁液を各インサートに加え、インサートが完全に水没していることを確認します。それから摂氏37度で井戸をインキュベートします。O9-1細胞でsiRNAノックダウンを行うには、siRNAとトランスフェクション試薬を還元血清培地でメーカーの推奨に従って所望の濃度に希釈します。希釈したsiRNAとトランスフェクション試薬を穏やかに混合し、室温で7分間インキュベートします。18〜24時間の細胞プレーティング後、siRNA脂質複合体をO9-1細胞インサートに追加し、約34〜48時間インキュベートします。細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、C2C12チャンバーから培地をよく取り出し、PBSで細胞を1回洗浄します。PBSを除去した後、滅菌P10ピペットチップを一方向にしっかりと通過させて、細胞単層の全長または幅にまたがることにより、細胞を引っ掻き始めます。細胞に傷がついたら、すぐに1ミリリットルのPBSを加えます。次に、コンピューターと顕微鏡の電源を入れます。チャンバースライドをステージに置き、対物レンズダイヤルを5倍の倍率に回転させます。イメージングソフトウェアを開きます。カメラタブをクリックし、ライブボタンをクリックして、AxioCam ICタブのセルを視覚化します。光フィルターが完全に引き出されていることを確認して、光がカメラとコンピューター画面を通過できるようにし、チャンバースライドを手動で移動または回転させて、AxioCam ICタブのライブ画像の中央に創傷領域を配置します。画像を撮影するには、[スナップ]をクリックして、画像を含むAxioCam ICタブの横に新しいタブを開きます。この静止画を保存するには、ファイルをクリックして[名前を付けて保存]を選択し、左側のバーで[デスクトップ]を選択してファイルをデスクトップに保存し、ファイル名ボックスにファイル名を入力して、図をcziファイル形式で保存します。画像を tiff として保存するには、[ファイル] をクリックし、[名前を付けて保存] を選択して、[ファイル名] ボックスにファイル名を入力します。[ファイルの種類]ボタンをクリックし、ドロップダウンメニューからtiffを選択します。チャンバースライドを手動で再配置して、同じウェル内の創傷の他のポイントでさらに2〜3枚の画像を撮影します。イメージング後、各ウェルからPBSを取り出し、1ミリリットルのC2C12培地を加えます。O9-1細胞を含むインサートをチャンバーウェルの各ウェルに手動で配置して、ウェルインサート共培養システムを組み立てます。インサートの底部が下にあるC2C12セルのすぐ上になるように、インサートをウェルにゆっくりと押し下げます。ウェルインサートコンストラクトをインキュベーターに戻し、細胞を合計9〜12時間遊走させます。最適な移動時間を決定するには、創傷作成後6時間で細胞をチェックし、その後2〜3時間ごとに細胞を確認します。対照条件の細胞が創傷を完全に覆ったら実験を終了する。遊走アッセイの終了を開始し、遊走期間の9〜12時間後にO9-1細胞インサートを取り外してウェルインサートシステムの解体を開始します。C2C12培地を注意深く吸引します。チャンバーウェルに0.5ミリリットルのPBSを加え、遊走後の細胞の最終画像を撮影します。培地と混合したすべてのPBSを注意深く吸引し、キットの指示に従ってチャンバーウェルからプラスチックチャンバーを取り外します。C2C12 セルを含む下にあるスライドを残します。免疫染色の場合は、直ちにスライドを4%パラホルムアルデヒドで室温で10分間インキュベートします。次に、パラホルムアルデヒドを除去し、スライドをPBSTを含む0.1%Triton X-100で室温で15分間洗浄します。15分後、PBSTを注ぎ、スライドをPBSでそれぞれ10分間2回洗浄します。次に、スライドの周りに疎水性ペンで疎水性境界を作成し、スライドから溶液がこぼれるのを防ぎ、接着細胞の破壊を防ぎます。次に、疎水性境界内のスライドに約0.5ミリリットルの1%BSAブロッキング溶液を加え、加湿したスライドチャンバー内で室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、ブロッキング溶液を除去し、疎水性境界内のこのスライドにファロイジン抗体を加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、光にさらされないように保護されたスライドホルダーにスライドを置きます。細胞をPBSで室温でそれぞれ10分間3回洗浄する。DAPI含有封入剤を追加し、スライドをガラスカバースリップでマウントし、標準の蛍光顕微鏡を使用して細胞をキャプチャします。本研究では、組換えWnt5aを共培養ウェルに添加すると、筋芽細胞遊走が加速し、一部の領域が完全に9時間回復しました。3つの条件すべてにおいて、遊走筋芽細胞は、整形式および突出した糸状突起およびラメリポディアおよびアクチン細胞骨格突起の非対称分極を含む正常な遊走細胞形態を示した。NCC由来のWnt5aの筋芽細胞遊走に対するパラクリン効果を研究した。Wnt5aに対する50ナノモルsiRNAによる処理は、陰性対照と比較してWnt5a遺伝子発現を64%減少させた。NCCのWnt5aノックダウン後に有意に減少したC2C12マイルブラストの移動と外因性組換えWnt5aの追加により、これらの筋芽細胞におけるこの移動性欠損と形態学的欠陥が救済されました。パラクリンモデルにおけるシグナル受信細胞メカニズムをよりよく理解するために、ROR2受容体がノックダウンされ、遺伝子発現が54%減少しました筋芽細胞におけるROR2のノックダウンは、NCCの存在にもかかわらず、それらの遊走能力を低下させます。外因性組換えWnt5aは、ROR2ノックダウン後の筋芽細胞遊走を救出できず、ROR2の枯渇が筋芽細胞がWnt5aシグナルを受信する能力を破壊することを示唆しています。P10チップで引っ掻いて適切な密度に細胞を一度だけ培養し、下にある細胞を破壊することなく注意して組み立てられていない共培養システム。この手法は、神経堤細胞および第二心野生物学に関連する複雑なWnt / PCP経路内の特定の分子シグナル伝達軸を研究するための概念実証として使用されました。

modeling-paracrine-noncanonical-wnt-signaling-in-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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in vitroでのパラクリン非標準Wntシグナル伝達のモデリング

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