Name: 考古学的遺跡から古代DNAを検索するための最適化された骨サンプリングプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学ぶ考古学的遺跡からの古代DNA抽出のための最適化された骨粉末採取プロトコル。歯や椎骨など複数の解剖学的部位からDNA収量を最大化する方法を解説。法医学的応用にも対応可能です。

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著者らは、これらのプロトコルの開発と実施に協力してくれたマックスプランク人類史科学研究所の研究室スタッフに感謝したいと思います。この研究は、グイド・ブラント博士、エリザベス・ネルソン博士、アンティエ・ウィセゴット、フランツィスカ・アロンのインプットと努力なしには不可能でした。この研究は、マックスプランク協会、欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラムの下で、助成金契約No.771234-PALEoRIDER(WH、ABR)および開始助成金番号805268 CoDisEASe(KIBへ)の下で、欧州研究会議(ERC)によって資金提供されました。

<ol><li>Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+recovery+of+DNA+from+ancient+teeth+and+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+Science%22%5BJournal%5D)">Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones.</a> Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).</li>
<li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Ancient+DNA%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).</li>
<li>Palsdottir, A. H., Bläuer, A., Rannamäe, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+a+limitless+resource%3A+ethics+and+guidelines+for+destructive+sampling+of+archaeofaunal+remains%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains.</a> Royal Society Open Science. 6 (10), 191059(2019).</li>
<li>Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+the+human+cochlea+to+generate+bone+powder+for+ancient+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis.</a> Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).</li>
<li>Latham, K. E., Miller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+recovery+and+analysis+from+skeletal+material+in+modern+forensic+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sciences+Research%22%5BJournal%5D)">DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts.</a> Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).</li>
<li>Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+preservation+in+skeletal+elements+from+the+World+Trade+Center+disaster%3A+Recommendations+for+mass+fatality+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management.</a> Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).</li>
<li>Gamba, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+flux+and+stasis+in+a+five+millennium+transect+of+European+prehistory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory.</a> Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Alberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+DNA+sampling+of+ancient+bones+using+Computed+Tomography+scans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans.</a> Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).</li>
<li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).</li>
<li>Sirak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+auditory+ossicles+as+an+alternative+optimal+source+of+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA.</a> Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).</li>
<li>Parker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+investigation+of+human+DNA+preservation+in+medieval+skeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18225(2020).</li>
<li>Pinhasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+ancient+DNA+yields+from+the+inner+ear+part+of+the+human+petrous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0129102(2015).</li>
<li>Sirak, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally-invasive+method+for+sampling+human+petrous+bones+from+the+cranial+base+for+ancient+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis.</a> BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).</li>
<li>Orfanou, E., Himmel, M., Aron, F., Haak, W. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w">https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w</a> (2020).</li>
<li>Damgaard, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+access+to+endogenous+DNA+in+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).</li>
<li>Harney, É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally+destructive+protocol+for+DNA+extraction+from+ancient+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth.</a> Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).</li>
<li>Cooper, A., Poinar, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+DNA%3A+Do+it+right+or+not+at+all%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ancient DNA: Do it right or not at all.</a> Science. 289 (5482), 1139(2000).</li>
<li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+field+to+the+laboratory%3A+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era%5BTitle%5D)+AND+%22STAR%3A+Science+%26+Technology+of+Archaeological+Research%22%5BJournal%5D)">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+field+to+the+laboratory%3A+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era%5BTitle%5D)+AND+%22STAR%3A+Science+%26+Technology+of+Archaeological+Research%22%5BJournal%5D)">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Boessenkool, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bleach+and+mild+predigestion+improves+ancient+DNA+recovery+from+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones.</a> Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).</li>
<li>García-Garcerà, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragmentation+of+contaminant+and+endogenous+DNA+in+ancient+samples+determined+by+shotgun+sequencing%3B+Prospects+for+human+palaeogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics.</a> PLoS ONE. 6 (8), 24161(2011).</li>
<li>Malmström, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+on+contamination%3A+The+use+of+asymmetric+molecular+behavior+to+identify+authentic+ancient+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA.</a> Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).</li>
<li>Basler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+the+contaminant+fraction+of+DNA+obtained+from+an+ancient+giant+panda+bone%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone.</a> BMC Research Notes. 10, 754(2017).</li>
<li>Kemp, B. M., Smith, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bleach+to+eliminate+contaminating+DNA+from+the+surface+of+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%22%5BJournal%5D)">Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth.</a> Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).</li>
<li>Korlević, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+microbial+and+human+contamination+in+DNA+extractions+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth.</a> BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).</li>
<li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).</li>
<li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).</li>
<li>Gansauge, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79(2017).</li>
<li>Peltzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAGER%3A+efficient+ancient+genome+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">EAGER: efficient ancient genome reconstruction.</a> Genome Biology. 17 (1), 60(2016).</li>
<li>Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANGSD%3A+analysis+of+next+generation+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ANGSD: analysis of next generation sequencing data.</a> BMC Bioinformatics. 15, 356(2014).</li>
<li>Renaud, G., Hanghøj, K., Willerslev, E., Orlando, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gargammel%3A+A+sequence+simulator+for+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA.</a> Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).</li>
<li>Ponce de León, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bony+labyrinth+is+an+indicator+of+population+history+and+dispersal+from+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).</li>
<li>Nagaoka, T., Kawakubo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+petrous+part+of+the+temporal+bone+to+estimate+fetal+age+at+death%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%22%5BJournal%5D)">Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death.</a> Forensic Science International. 248, 188(2015).</li>
<li>Norén, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+angle%3A+A+method+for+sexing+using+the+petrous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Anthropology%22%5BJournal%5D)">Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone.</a> American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).</li>
</ol>

著者には、報告する利益相反はありません。

古代人集団遺伝学における現在の慣行は、可能な限りパースペトロサ(ステップ2.1)から優先的にサンプリングすることです。しかし、パース・ペトロサは、無数の骨格評価(例えば、集団歴32、死亡時の胎児年齢の推定33、性決定34)で高く評価されているため、入手が困難なサンプルになる可能性があり、歴史的に、DNA分析のためのパース・ペトロサのサンプリングは非常に破壊的である可能性があります3,4(ここに提示されたプロトコルを含む、 新しい、低侵襲プロトコル13,14は、この懸念を軽減するために現在広く採用されています)。これは、ごく最近まで、骨格全体のヒトDNA回収の大規模で体系的な研究が試みられていなかったという事実によってさらに悪化し11、石油ピラミッドが利用できないときに適切なサンプリング戦略を見つけることを困難にしています。
ここで紹介するプロトコルは、pars petrosaを含む考古学的/法医学的骨格遺跡からのDNAサンプリングのための一連の最適化された手順と、4つの追加の骨格要素にわたる7つの代替解剖学的サンプリング場所を提供することにより、その課題を軽減するのに役立ちます。含まれている重要なステップはすべて、非効率的なサンプリング(ステップ2.1.6および3.2.1.3)または穴あけ/切断中のサンプルの過熱(ステップ3.1.6)によるDNAの損失/損傷の可能性を最小限に抑えることを目的としています。さらに、プロトコル全体を通して、高度に劣化したサンプルで最高のパフォーマンスを確保するために、前処理ステップを変更/省略する必要がある場合があることが指摘されています。また、ここで提示された選択された要素の中でも、いくつかの可能な代替サンプリング技術(特にpars petrosa13,14)と、ここで提示された十分に活用されていない解剖学的サンプリング場所(すなわち、距骨:ステップ2.5および椎骨:ステップ2.3)をさらに最適化するための十分な余地が残っていることにも留意する必要があります。
これらのプロトコルは、内因性のヒトDNA分析の目的で、高品質の(良好な形態学的保存)古代の幼体と成人の遺体を使用して設計およびテストされていることを覚えておくことも重要です。提示された結果は、追加の状況でのこれらのプロトコルの使用に関するさらなる調査が依然として必要であるため、より高度に分解された材料、他の保存状況、乳児の遺体、人間以外の遺体、または病原体または微生物叢の研究には及ばない可能性があります。さらに、ここに提示された代替骨格要素(歯、椎骨、遠位指節骨、およびタリ)は、混合された遺体の中で単一の個人に割り当てるのが難しい場合があり、単一の起源を確保するために複数の要素からのサンプリングが必要です。これらの制限にもかかわらず、これらのプロトコルを広く利用できるようにすることで、ヒト遺体に関する将来の幅広いaDNA/法医学研究で使用するための一般化および定量的に最適化されたフレームワークを提供することにより、サンプルの選択と処理を取り巻く異質性の一部を軽減するのに役立ちます。

DNAの回収と分析を目的とした古代の人間の遺体のサンプリングは、本質的に破壊的です1,2,3,4。サンプル自体は貴重な標本であり、形態学的保存は可能な限り保存する必要があります。そのため、かけがえのない材料の不必要な破壊を回避し、成功の確率を最大化するために、サンプリング方法を最適化することが不可欠です。現在のベストプラクティス技術は、法医学調査5,6、最適なサンプリングの開発が研究の直接の目的ではない古代標本の研究7、または人間以外の遺体8または非常に少数の解剖学的サンプリング場所(ここでは、骨粉の骨格要素の特定の領域を示すために使用されます、 ダウンストリームDNA分析で使用するために、生成されました)9,10。ここで提示されたサンプリングプロトコルは、複数の個人からの複数の骨格要素にわたるDNA保存に関する最初の大規模な体系的研究で最適化されました11。すべてのサンプルは、ドイツのザクセンアンハルト州パイセン近くのクラカウアーベルクの放棄された中世の集落の教会の墓地から発掘された11人の個人から回収された骨格要素に由来し(詳細なサンプル人口統計については表1を参照)、そのため、この地理的/時間的範囲外のサンプルで使用するには変更が必要な場合があります。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>個体</td>
			<td>性</td>
			<td>推定死亡年齢</td>
			<td>14名C 日付 (CE, Cal 2-シグマ)</td>
		</tr><tr><td>KRA001</td>
			<td>男性</td>
			<td>25-35</td>
			<td>1058-1219</td>
		</tr><tr><td>KRA002</td>
			<td>女性</td>
			<td>20-22</td>
			<td>1227-1283</td>
		</tr><tr><td>KRA003</td>
			<td>男性</td>
			<td>25</td>
			<td>1059-1223</td>
		</tr><tr><td>KRA004</td>
			<td>男性</td>
			<td>15</td>
			<td>1284-1392</td>
		</tr><tr><td>KRA005</td>
			<td>男性</td>
			<td>10-12</td>
			<td>1170-1258</td>
		</tr><tr><td>KRA006</td>
			<td>女性</td>
			<td>30-40</td>
			<td>1218-1266</td>
		</tr><tr><td>KRA007</td>
			<td>女性</td>
			<td>25-30</td>
			<td>1167-1251</td>
		</tr><tr><td>KRA008</td>
			<td>男性</td>
			<td>20</td>
			<td>1301-1402</td>
		</tr><tr><td>KRA009</td>
			<td>男性</td>
			<td>不明</td>
			<td>1158-1254</td>
		</tr><tr><td>KRA010</td>
			<td>男性</td>
			<td>25</td>
			<td>1276-1383</td>
		</tr><tr><td>KRA011</td>
			<td>女性</td>
			<td>30-45</td>
			<td>1040-1159</td>
		</tr></tbody></table>表1:サンプリングされた11人全員の遺伝的に決定された性別、考古学的に決定された推定死亡年齢、および放射性炭素年代測定(14 C Cal 2-シグマ)。この表は、Parker, C. et al. 202011から改作されたものである。
これらのプロトコルにより、実験室によるDNA汚染を制限しながら、5つの骨格要素(パースペトロサを含む)にわたる8つの解剖学的サンプリング場所から比較的簡単で効率的な骨粉末の生成が可能になります。これらの5つの骨格要素のうち、4つの骨格要素に見られる7つの解剖学的サンプリング位置は、錐体ピラミッド11,12の破壊的サンプリングの実行可能な代替手段であると決定されています。これらには、永久大臼歯のセメント質、象牙質、および歯髄室が含まれます。皮質骨は、上椎骨ノッチおよび胸椎の体から集まった。先端房の下面および遠位指骨のシャフトに由来する皮質骨。タリの外側部分に沿った密な皮質骨。パースペトロサ4、12、13、14、象牙質、および歯髄室1,2,15のサンプリングにはいくつかの広く適用されている方法がありますが、セメント質からの骨粉末の生成の成功を説明する公開された方法16、椎体、下椎骨ノッチ、距骨は入手が困難な場合があります。そのため、ここでは、ペトロスピラミッド用に最適化されたサンプリングプロトコルを示します(ステップ3.1)。成人大臼歯のセメント質(ステップ3.2.1)、象牙質(ステップ3.2.2)、および歯髄(ステップ3.2.3)。椎体の皮質骨(ステップ3.3.1)および上椎弓(ステップ3.3.2)。遠位指節骨(ステップ3.4);aDNAと法医学研究の両方のためにこれらの骨格要素を効果的に利用するために、距骨(ステップ3.5)をより広く利用できるようにします。

<table><tbody><tr><td>#16歯科用ドリルビットNTI</td><td></td><td>H1-016-HP</td><td>の例ドリルビット</td></tr><tr><td>0.6mmスクロール鋸刃</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-949-097</td><td>宝石商用ブレード</td></tr><tr><td>22mmダイヤモンドカッティングホイール</td><td>カーラ</td><td>SKU 806.104.358.514 220</td><td>ドレメルカッティングアタッチメント</td></tr><tr><td>商業漂白剤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1818018</td><td></td></tr><tr><td>コントロールカンパニーウルトラクリーンSupreme アルミホイル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-078-29X</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind チューブ (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 225-01 フレックスシャフトアタッチメント</td><td>ドレメル</td><td>225-01</td><td>ドレメルフレキシブルエクステンション</td></tr><tr><td>ドレメル4300 ロータリーツール</td><td>ドレメル</td><td>4300</td><td>ドリル例</td></tr><tr><td>ドレメルコレットとナットキット</td><td>ドレメル</td><td>4485</td><td>各種アダプタードレメル ツールアタッチメント/ビット</td></tr><tr><td>イーグル 33 ガロン レッド バイオハザード ゴミ袋</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>17-988-501</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ DNA LoBind 2 mL 微量遠心チューブ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-698-792</td><td></td></tr><tr><td>エタノール (分子生物学グレード)</td> <td>ミリポア・シグマ</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>FDA 承認レベル 2 サージカルマスク</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>50-206-0397</td><td>PPE</td></tr><tr><td>フィッシャーブランドコンフォートニトリルグローブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-041-171X</td><td>PPE</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド安全メガネ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-130-208X</td><td>PPE</td></tr><tr><td>グレンジャーステーショナリーバイス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1336173</td><td>ベンチトップバイス</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure DNase/Rnaseフリー蒸留水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>宝石のこぎり</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-949-231</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Labconco 清浄機 ロジック バイオセーフティキャビネット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>30-368-1101</td><td></td></tr><tr><td>ルックアウト DNA 消去</td><td>ミリポア シグマ</td><td>L9042-1L</td><td></td></tr><tr><td>中量ボート</td><td>ヒースロー サイエンティフィック</td><td>HS120223</td><td></td></tr><tr><td>MSC 10pc プライヤー/クランプセット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-129-5352</td><td>その他&nbsp;穴あけ/切断中にサンプルをしっかりと保持するためのクランプ/バイスグリップ</td></tr><tr><td>ザルトリウス クインティックス セミマイクロバランス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィック</td><td>14-560-019</td><td>密閉型天びん</td></tr><tr><td>フード付きタイベックカバーオール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-361-7X</td><td>PPE</td></tr><tr><td>計量紙</td><td>ヒースローサイエンティフィック HS120116</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

考古学的遺跡から古代dnaを検索するための最適化された骨サンプリングプロトコル

Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains

ここで紹介する方法は、投入サンプル材料を制限しながら、古代の考古学的遺跡からヒトDNAを回収する可能性を最大化することを目指しています。これは、骨格全体のDNA回収率の比較分析において、最も多くの古代DNA(aDNA)を生成するように以前に決定された解剖学的サンプリング場所をターゲットにすることによって行われました。以前の研究では、これらのプロトコルが考古学的遺跡から古代のヒトおよび病原体DNAの回収に成功する可能性を最大化することが示唆されています。DNA収量は、ドイツ・パイセン近郊の放棄された中世の集落であるクラカウアーベルクの中世(西暦1040年から1400年頃の放射性炭素年代測定、較正された2シグマ範囲)墓地から回収された11人の個人からの複数の骨格要素にわたるaDNA保存の広範な調査で、Parkerらによって以前に評価されました。5つの骨格要素(ペトロサ、永久大臼歯、胸椎、遠位指節骨、距骨)にまたがるこれらの8つのサンプリングスポットは、すべての要素と個体の全体的な平均よりも収量が有意に高かった高品質の古代ヒトDNAを生成することに成功しました。収量は、ほとんどの一般的な下流集団遺伝子解析で使用するのに十分でした。私たちの結果は、考古学的遺跡からの古代の人間のDNAの分析を含むほとんどの研究で、これらの解剖学的サンプリング場所を優先的に使用することを支持しています。これらの方法の実装は、貴重な考古学的標本の破壊を最小限に抑えるのに役立ちます。

別の研究11では、石灰化した組織からの短い断片に最適化された標準的なDNA抽出プロトコルを使用して、11人の各解剖学的サンプリング場所から生成された骨粉末からDNAを抽出しました2。次に、一本鎖ライブラリを28個生成し、HiSeq 4000(75 bpペアエンド)でサンプルあたり~20,000,000リードの深さまでシーケンスしました。次いで、得られた配列データを、EAGERパイプライン29を用いて内因性ヒトDNA含量について評価した(BWA設定:シード長32、0.1ミスマッチペナルティ、マッピング品質フィルタ37)。すべての代表的な結果は、一貫性を保つためにParker et al. 202011と同じ指標を用いて報告されている。パルスペトロサの粉末部分からのライブラリは、調査された他の23の解剖学的サンプリング場所のどれよりも平均して高い内因性DNAを生成しました(図6A-B)。このプロトコルで提示された7つの追加の解剖学的サンプリング位置(セメント質、歯髄室の最初の通過、永久大臼歯の象牙質、椎体からの皮質骨および胸椎の上椎弓、遠位指節骨の頂端房からの皮質骨、および距骨の頸部からの皮質骨)は、次に高い収量を生み出しました(これらの解剖学的サンプリング位置の間に統計的有意性はありません。図6A-B;補足ファイル1:内因性DNAPreCap)。これらの代替場所はすべて、ミトコンドリア分析や一塩基多型(SNP)分析などの標準的な集団遺伝学分析に適したDNA収量を一貫して生成しました。すべての解剖学的サンプリング場所に由来するライブラリの重複率は低かった(クラスター係数&lt;平均1.2、一意のマッピングリードに対するすべてのマッピングリードの比率として計算、表2;補足ファイル1:ClusterFactor)、スクリーニングされたすべてのライブラリが非常に複雑であることを示しています。同様に、平均外因性ヒトDNA汚染推定値は低く、上椎弓を除くすべての解剖学的サンプリング場所で平均&lt;2%(男性のX染色体汚染、n = 7、ANGSD30パイプラインによって報告された)でした(平均推定汚染:2.11%、1つのサンプルは外れ値として削除されました。KRA005:19.52%、表2を参照。補足ファイル1:X汚染)。平均フラグメント長(30 bp&lt;すべての読み取り値を除去するためにフィルタリングした後)は、歯髄室および象牙質から収集された材料で最も低く、他の解剖学的サンプリング場所間で有意な変動はありませんでした(平均中央値62.87と比較して、それぞれ55.14 bpおよび60.22 bp、ペアワイズp値は0.019&lt;、表2;補足ファイル 1: AvgFragLength)。さらに、歯と胸椎にはそれぞれ、高い内因性DNA回収が観察された複数の解剖学的サンプリング場所が含まれているため、ペトロサの代替品として特に適しています。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63250/63250fig06.jpg"> 図6:スクリーニングされたすべてのサンプルのヒトDNA含有量。 黒い線は全体の平均を表し、赤い線は中央値を表します(実線:ヒトDNA比率、破線:生成された100万リードあたりのマッピングされたヒトリード)。平均ヒトDNA比率が全体平均(8.16%)よりも高い個々の解剖学的サンプリング場所は、すべての分析で色付けされています。(A)hg19リファレンスゲノムにマッピングするリードの割合。青い破線は、パイプラインのマッピングパラメータ(シミュレートされた損傷を伴うhg19参照ゲノムからの5,000,000リードのランダム分布をシミュレートするためにGargammel31 を使用して生成された)が与えられた理論上の最大値を表します。個々の平均(黒いX)と中央値(赤い円)は、全体の平均よりも平均ヒトDNA比率が高いサンプルについて報告されています。信頼区間は、統計的外れ値を除いた上限と下限を示します。(B)シーケンシング努力の100万リードあたりのhg19リファレンスゲノムにマッピングされた一意のリードの数(75 bpペアエンド)。信頼区間は、統計的外れ値を除いた上限と下限を示します。この図は、Parker, C. et al. 202011から改作されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/63250fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表2:すべての解剖学的サンプリング場所の平均重複レベル(マッピングリード/ユニークリード)、フラグメント長の平均および中央値、およびX染色体汚染推定値。 誤差は平均の標準誤差として報告されます。この表は、Parker, C. et al. 202011から改作されたものである。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>サンプリング場所</td>
			<td>平均重複係数 (# マップされた読み取り /# 一意のマップされた読み取り)</td>
			<td>平均フラグメント長 (bp 単位)</td>
			<td>X染色体汚染の平均推定割合</td>
		</tr><tr><td>ペトラピラミッド</td>
			<td>1.188 ± 0.006</td>
			<td>65.40 ± 1.36</td>
			<td>0.000 ± 0.003</td>
		</tr><tr><td>セメント</td>
			<td>1.197 ± 0.028</td>
			<td>67.28 ± 1.76</td>
			<td>±0.011± ±0.003</td>
		</tr><tr><td>象牙質</td>
			<td>1.188 ± 0.061</td>
			<td>60.22±2.37</td>
			<td>0.002 ± 0.007</td>
		</tr><tr><td>パルプ</td>
			<td>1.179 ± 0.024</td>
			<td>55.14 ± 2.90</td>
			<td>±0.013± 0.006</td>
		</tr><tr><td>遠位指節骨</td>
			<td>1.191 ± 0.049</td>
			<td>65.95±1.08</td>
			<td>0.013± 0.005</td>
		</tr><tr><td>椎体</td>
			<td>1.194 ± 0.037</td>
			<td>66.14 ± 1.03</td>
			<td>0.008± 0.003</td>
		</tr><tr><td>上椎弓</td>
			<td>1.19 ± 0.017</td>
			<td>63.02 ± 1.23</td>
			<td>0.021 ± 0.009*</td>
		</tr><tr><td>距骨</td>
			<td>1.198 ± 0.010</td>
			<td>68.20±1.24</td>
			<td>±0.011± ±0.003</td>
		</tr><tr><td>*サンプルKRA005は0.1952で外れ値として削除</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>コードの可用性 この原稿の分析に使用されたすべての分析プログラムとRモジュールは、それぞれの著者から無料で入手できます。すべてのカスタム R コードは、要求に応じて利用できます。
データの可用性 代表的な結果の計算に使用されるすべての生データは、欧州ヌクレオチドアーカイブENAデータリポジトリ(アクセッション番号PRJ-EB36983)またはParker、C.らの補足資料11で自由に入手できます。
補足ファイル 1.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/SupplementalFile1.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、中世の個人からの5つの異なる骨格要素(放射性炭素年代測定)にわたる8つの推奨される解剖学的サンプリング場所(特定の骨格要素の特定の場所)から骨粉末を収集するための一連のベストプラクティスプロトコルを提示します西暦1040年から1400年頃、較正された2シグマ範囲)。

考古学的遺跡から古代DNAを検索するための最適化された骨サンプリングプロトコル

The methods presented here seek to maximize the chances for the recovery of human DNA from ancient archaeological remains while limiting input sample ...

これらのプロトコルは、さまざまな骨格要素にわたるダウンストリームDNA抽出で使用するための骨粉末生成のベストプラクティスガイドラインとして機能します。象牙質と錐体ピラミッド以外の場所について、いくつかの公開された古代DNAサンプリングプロトコルがあります。今日は、3つの選択肢の詳細なサンプリング方法を紹介します。これらの方法は、劣化した法医学遺体での使用だけでなく、人間以外の標本で同様の技術を開発するためのベースラインとしても大きな可能性を示しています。すべてのサンプリングは、UV光を備えたPCRフードまたはバイオセーフティキャビネットの下にある専用のクリーンルームで実行します。空気の流れを止め、ベンチトップ全体に滅菌アルミホイルを広げて、浮遊骨粉や破片をキャッチします。計量紙のシートを滅菌計量トレイに入れます。ハンドヘルドクランプを使用して、根元を計量トレイの上に下に向けて、エナメル質で除染された大臼歯を保持します。歯科用ドリルにダイヤモンドエッジの円形カッティングホイールを装備します。ドリルを中速設定に設定した状態で、ドリルの端を約20度の角度で根元に軽く触れます。サンプルをトレイに下向きにこすり落とし、根元から黄色の最も外側の材料を収集します。象牙質の軽い材料が見えるようになったら、収集を停止します。粉末を2ミリリットルのLoBindセーフロックチューブに移し、この収集された粉末の塊を密閉された天びんを使用して少なくとも0.01ミリグラムの精度で記録します。粉末を計量紙から2ミリリットルのLoBindセーフロックチューブに移して抽出します。このチューブは摂氏20度で保管してください。すべての骨片とできるだけ多くの粉末を回収するようにしてください。各サンプリング間でホイルを交換し、使用済みのホイルをオートクレーブ可能なバイオハザードバッグに廃棄します。作業エリアを除染し、次の骨に移動する前に毎回ベンチトップ全体に滅菌アルミホイルを広げます。計量用紙の小さなシートを標準の計量トレイに入れます。歯科用ドリルを使用して、上椎骨弓の皮質骨の最外層を除去して廃棄します。次に、椎骨をハンドクランプで固定し、棘突起を外側に、上側を下にして固定します。椎骨を保持しながら、棘突起と低速および高トルクのラメラとの融合によって形成されたV字型のノッチの中心に上向きにドリルします。抵抗が著しく低下した場合は、掘削を中止してください。穴あけ位置を少し変えて、50〜100ミリグラムの骨粉が集まるまで繰り返します。骨粉を計量紙から抽出用の2ミリリットルのLoBindチューブに移し、摂氏20度で保管します。ホイルを廃棄する前に、すべての骨片とできるだけ多くの粉末が回収されていることを確認してください。前述のように、作業領域を除染し、サンプル収集の準備をします。計量用紙の小さなシートを標準の計量トレイに置きます。距骨ドームを上向きに保持し、内側の表面をコレクターに向かって、計量トレイの上に置きます。低速および高トルクに設定されたローゲージビットを備えた歯科用ドリルを使用して、距骨の首から約1ミリメートルの深さまで皮質骨をこすります。穴あけ位置を変更し、約50〜100ミリグラムの骨粉が収集されるまでこれを繰り返します。この骨粉を計量紙から2ミリリットルのLoBindチューブに移して抽出します。粉末は摂氏20度で無期限に保管してください。残りの骨と余分な粉末は、摂氏25度の乾燥した温度制御された無菌環境に保管してください。すべての廃棄物は、オートクレーブのバイオハザードバッグまたはレセプタクルに入れて処分してください。すべての再利用可能な機器を滅菌または除染し、各サンプリングの間にUVにさらします。Pars petrosaは、調査された他の23の解剖学的サンプリング場所よりも高い内因性DNAを生成しました。このプロトコルで提示された7つの追加の解剖学的サンプリング場所は、次に高い収量を生み出しました。代替の場所は、標準的な集団遺伝学分析に十分なDNA収量を一貫して生成しました。すべての解剖学的サンプリング場所に由来するライブラリの複製率は低く、複雑さが高いことを示しています。歯と胸椎は十分な分子回復を示しました。骨サンプリングの最も困難な側面の1つは、ドリルの保持方法、掘削場所、掘削を停止するタイミングなどの穴あけプロセスです。

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Research

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