Name: アリザリンレッド染色を使用してゼブラフィッシュ幼虫の化学的に誘発された骨量減少を検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 学ぶアリザリンレッド染色法でゼブラフィッシュ幼虫の化学的骨毒性を検出する手法です。酢酸鉛曝露による骨量変化を可視化し、骨粗鬆症モデルや環境毒性物質の影響評価に応用可能です。

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この研究は、中国国家自然科学財団(81872646; 81811540034; 81573173)および江蘇省高等教育機関の優先学術プログラム開発(PAPD)の支援を受けました。

ここで概説されているすべての動物の手順は、東呉大学の倫理委員会の動物管理研究所によってレビューおよび承認されています。
1.魚の飼育と胚の収集14
<ol><li>毎日3回魚に餌をやる。ゼブラフィッシュが28.5 ± 0.5°Cに維持され、14:10時間の明暗サイクルがあることを確認します。</li>
	<li>夕方には、産卵タンクの隔離ボードでオスとメスの成魚を2:1のオスとメスの比率で分離します。</li>
	<li>翌朝、午前9:00に隔離ボードを取り外し、2時間後に胚を採取します。</li>
	<li>実験前に28.5°Cに維持した生化学的インキュベーターに胚を置きます。</li>
</ol>2.化学物質への暴露
<ol><li>マザーストックを調製します:酢酸鉛三水和物(5 g)を量り、攪拌しながら超純水(50 mL)に溶解します。 注意: PbAcは有毒です。適切な防塵マスク、防護服、手袋を着用してください。ドラフトの下で実験を行います。</li>
	<li>ゼブラフィッシュの胚を選択し、きれいな6ウェルプレートにランダムに分配します(3 mLのゼブラフィッシュ繁殖水中のウェルあたり30個の胚;その組成については 表1 を参照してください)。受精後2〜120時間(hpf)で胚をPbAc(0、5、10、20 mg / L)で処理します。 注:PbAcの濃度は、用量範囲測定実験に従って選択されました。結果は、ゼブラフィッシュ胚の酢酸鉛のLC50が120 hpfで41.044 mg / Lであることを示しました。したがって、最高濃度はLC50 の半分に設定し、一連の溶液を2倍希釈して調製した。</li>
	<li>受精後5日から1日2回幼虫に餌をやる(dpf)。ゼブラフィッシュの胚を28.5 ± 0.5°Cに維持し、14:10時間の明暗サイクルで維持します。</li>
	<li>鉛フリー培地(ゼブラフィッシュ飼育水)を24時間ごとに9dpfまでリフレッシュします。 注:実験が完了すると、すべての鉛含有溶液が指定された液体タンクに注がれ、実験管理センターによって処理されました。</li>
</ol>3.アリザリン赤染色
注意: 染色プロセス全体を通して、適切な防塵マスク、保護服、および手袋を着用してください。全ての溶液の組成を 表1に示す。
<ol><li>特定の染色ステップ 注:染色プロセスは、室温で24ウェルプレートで実施しました。各溶液を添加した後、低速に設定した振とう台の上に24ウェルプレートを置きます。<ol><li>各グループから10匹のゼブラフィッシュの幼虫を9 dpfでランダムに取り除き、魚を1 mLの2%パラホルムアルデヒド/ 1xリン酸緩衝生理食塩水に2時間固定します。</li>
		<li>溶液をデカントし、ゼブラフィッシュの幼虫を100 mM Tris-HCl(pH 7.5)/10 mM MgCl2 で10分間洗浄します。</li>
		<li>溶液をデカントし、脱色のために次の溶液で幼虫をそれぞれ5分間インキュベートします:無水エタノール(EtOH)溶液(80%EtOH / 100 mMトリス塩酸塩(pH 7.5)/ 10 mM MgCl2、50%EtOH / 100 mMトリス塩酸l(pH = 7.5)、および25%EtOH / 100mMトリス塩酸l(pH = 7.5)。</li>
		<li>溶液をデカントし、3%H2O2と0.5%KOHからなる溶液で漂白して顔料を除去し、顔料が完全に除去されるまで10分に1回観察する。</li>
		<li>ゼブラフィッシュの幼虫を25%グリセリン/ 0.1%KOHで泡がなくなるまでそれぞれ10分間数回すすぎます。 注意: 気泡を避けることが重要です。さもなければ、ゼブラフィッシュの体の泡は顕微鏡の下で黒い視野として現れるでしょう、そしてそれは観察と定量分析に影響を与えるでしょう。</li>
		<li>1mLの0.01%アリザリンに50分間浸して幼虫を染色する。</li>
		<li>溶液をデカントし、1mLの50%グリセリン/ 0.1%KOHを10分間加えてバックグラウンドをクリアします。その後の観察のために、魚を新鮮な50%グリセリン/ 0.1%KOHに保管します。</li>
	</ol></li>
</ol>4. 画像取得
<ol><li>毎回1匹の幼虫をスライドガラスに移し、幼虫を液滴の中央に保ちます。</li>
	<li>実体顕微鏡で幼虫を観察する。</li>
	<li>カメラの電源を入れ、ソフトウェアを開き( 材料表を参照)、デフォルト設定のままにします。</li>
	<li>AEをクリックし、最適な画像を得るために適切な露光時間(この実験では60ミリ秒)を選択します。</li>
	<li>同じ設定ですべての画像をキャプチャします。後で分析できるように.tif形式で画像を保存します。</li>
</ol>5. 画像解析
注:画像分析用のサンプルグラフのセットの例については、 補足ファイル を参照してください。
<ol><li>ImageJアイコンをダブルクリックし、手順4.5で保存した画像を解析します。<ol><li>ファイルをクリック |[開く ] をクリックして、手順 4.5 で保存した画像を開きます。</li>
		<li>画像をクリック |タイプで [8 ビット] を選択します。</li>
		<li>[編集]をクリックします |反転。</li>
		<li>[ 分析]をクリックします|キャリブレーションし、ポップアップインターフェイスで[ 未キャリブレーションOD ]を選択し、下部インターフェイスの左下にある [グローバルキャリブレーション ]をチェックして、[ OK]をクリックします。</li>
		<li>[ 分析]をクリックします|縮尺を設定する |ポップアップインターフェイスでスケールを削除してクリック し、下の [グローバル ]をチェックして、[ OK]をクリックします。</li>
		<li>[分析]をクリックします|[測定値]を設定し、ポップアップインターフェイスでアイテム領域を選択し、[制限しきい値]を以下のチェックボックスをオンにして(選択した範囲のみを測定します)、[OK]をクリックします。</li>
		<li>画像をクリック |調整|しきい値、ポップアップインターフェイスの中央にあるスライダーをスライドさせて適切なしきい値を選択し(各画像のしきい値を変更)、1つの画像でテストするすべてのターゲットが選択されるようにし、[ 設定]をクリックします。</li>
		<li>[ 分析]をクリックします|測定します。各グループの日付を記録します。</li>
	</ol></li>
	<li>一元配置分散分析とそれに続くテューキーの多重比較検定を使用して差を分析し、有意水準を p <0.001(***)に設定します。</li>
</ol>

<ol><li>Compston, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+registration+of+agents+for+prevention+and+treatment+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%3A+an+update+from+the+Group+for+the+Respect+of+Ethics+and+Excellence+in+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science.</a> Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).</li>
<li>Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+preventing+bone+loss+induced+by+aromatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).</li>
<li>Kataba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+environmentally+relevant+lead+levels+induces+oxidative+stress+and+neurobehavioral+alterations+in+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).</li>
<li>Morin, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+fracture+prevalence+and+in+bone+mineral+density+between+Chinese+and+White+Canadians%3A+the+Canadian+Multicentre+Osteoporosis+Study+%28CaMos%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Osteoporosis%22%5BJournal%5D)">Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos).</a> Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).</li>
<li>Lee, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lead+poisoning+magnifies+bone+detrimental+effects+in+an+ovariectomized+rat+model+of+postmenopausal+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis.</a> Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Theppeang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+bone+mineral+density+and+lead+levels+in+blood%2C+tibia%2C+and+patella+in+urban-dwelling+women%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women.</a> Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+a+Chinese+population+due+to+occupational+exposure+to+lead%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Industrial+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead.</a> American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).</li>
<li>Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+bone+mass+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exercise and bone mass in adults.</a> Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).</li>
<li>Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+structure+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Collagen structure and functional implications.</a> Micron. 32 (3), 251-260 (2001).</li>
<li>Kelly, W. L., Bryden, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+differential+stain+for+cartilage+and+bone+in+whole+mount+preparations+of+mammalian+fetuses+and+small+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates.</a> Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).</li>
<li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high+content%2C+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+a+model+to+assess+chemical+toxicity+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fish as a model to assess chemical toxicity in bone.</a> Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GH%2FIGF+axis+in+arsenite-induced+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos.</a> Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Hammond, C. L., Moro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transgenic+reporters+to+visualize+bone+and+cartilage+signaling+during+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).</li>
<li>Bensimon-Brito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+in+vivo+staining+with+alizarin+red+S--a+valuable+approach+to+analyse+zebrafish+skeletal+mineralization+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

ゼブラフィッシュは骨代謝疾患の研究に適したモデルです。げっ歯類モデルと比較して、ゼブラフィッシュモデルは比較的迅速に確立でき、病気の重症度の測定が容易です。野生型ゼブラフィッシュ幼生では、頭部骨格の石灰化作用は5 dpfで、軸骨格の石灰化は7 dpf15で起こる。したがって、PS、OP、CB、NCなどの頭蓋骨は9dpfでよく発達しています。幼虫を完全に脱染色して漂白した後、軟部組織が除去され、魚体の外観が透明になりました。アリザリンレッド染色試薬を添加して、ゼブラフィッシュのミネラルボーンを赤色で染色および視覚化しました。 
この実験で信頼できる実験的結論を得るためには、画像解析が重要です。姿勢が良く、背景がきれいなゼブラフィッシュの写真を選択して定量分析しました。1枚の画像の染色面積を数値化すると、1匹の魚の赤く染まった石灰化した骨がすべて計算されます。したがって、鉛曝露群と対照群の間の骨量の変化を比較することができます。本研究では、PbAc曝露はゼブラフィッシュの発生毒性を引き起こし、ミネラル骨の染色面積の有意な減少が9dpfで1...

最近の研究では、グルココルチコイド、アロマターゼ阻害剤、および過度のアルコール摂取による骨粗鬆症が一般的であることが確認されています1,2。鉛(Pb)は、植物、土壌、水生環境に見られる有毒金属です3。Pbの人体への悪影響が注目されていますが、骨への不可逆的な影響についてはさらに調査する必要があります。鉛中毒は、発達中の骨格と成人の骨格の両方に多様な病理学的変化を引き起こし、通常の生活活動に影響を及ぼします。研究によると、慢性的なPb曝露と骨損傷4との関連が見出されており、骨構造の障害5,6、骨塩密度の低下、さらには骨粗鬆症のリスクの増加などが含まれます7。
石灰化組織は骨強度8にとって非常に重要であり、骨石灰化マトリックス沈着は骨形成の重要な指標です9。アリザリンレッドはカルシウムイオンとの親和性が高く、アリザリンレッド染色は骨形成を評価するための標準的な手順です10。この方法によれば、石灰化組織は赤く染色されますが、他のすべての組織は透明なままです。次いで、染色された領域は、デジタル画像解析11によって定量化される。
ゼブラフィッシュは、創薬モデルや疾患モデルで広く用いられている重要なモデル生物です。ゼブラフィッシュとヒトの遺伝学的研究は、分子レベルで骨格形態形成の根底にあるメカニズムの類似性を示しています12。さらに、ハイスループットの薬物または生体分子スクリーニングは、マウスモデルよりもゼブラフィッシュの大きなクラッチでより実行可能であり、骨形成促進分子または骨毒性分子の機構的研究を容易にします13。 toto10 の骨格の鑑別染色は、小型脊椎動物および哺乳類胎児の骨格異形成の研究に頻繁に使用されます。アリザリン赤色染色は、ゼブラフィッシュ幼虫における化学物質の骨発生毒性を調べるために実施されました。本明細書では、ゼブラフィッシュ幼虫における酢酸鉛誘発骨欠損を検出するためのプロトコルを記載するために、例として鉛を用いた。

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH=7.5)</td><td>Solarbio,Beijing,China</td><td>21</td><td>4</td></tr><tr><td>% パラホルムアルデヒド固定液</td><td>BBI,上海,中国</td><td>14</td><td>固定組織</td></tr><tr><td>10x PBS バッファー</td><td>BBI,上海,中国</td><td>15</td><td></td></tr><tr><td>35% H2O2</td><td>Yonghua,Jiangsu,China</td><td>8</td><td>顔料</td></tr><tr><td>の除去50 mL 遠心分離管</td><td>AKX、江蘇省、中国</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>95% 無水エタノール</td><td>Enox、江蘇省、中国</td><td>2</td><td>脱染</td></tr><tr><td>アリザリン レッド (純度 99.5%)</td> <td>Solarbio、北京、中国</td><td>1</td><td>染色</td></tr><tr><td>生化学インキュベーター</td><td>Yiheng、上海、中国</td><td>3</td><td>ゼブラフィッシュ胚の飼育</td></tr><tr><td>電子スケール</td><td>ザルトリウス、ドイツ</td><td>5</td><td>固体原料の重量を量</td></tr>る <tr><td>グリセリン (純度 99.5%)</td><td>、BBI、上海、中国</td><td>7</td><td>染色された魚を保存</td></tr><tr><td>ImageJ (ソフトウェア)</td><td>USA</td><td>9</td><td>デジタル分析</td></tr><tr><td>KOH (純度 99.9%)</td><td>Sigma,アメリカ</td><td>10</td><td>漂白液</td></tr><tr><td>酢酸鉛三水和物 (純度 99.5%)</td><td>Aladdin,上海,中国</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (純度99.9%)</td><td>アラジン、上海、中国</td><td>12</td><td>洗浄液</td></tr><tr><td>NIS-Elements F (ソフトウェア)</td><td>ニコン、日本</td><td>13</td><td>観察と写真撮影</td></tr><tr><td>パイプ</td><td>AKX、江蘇省、中国</td><td>18</td><td>胚と溶液プレートの除去</td></tr><tr><td>(24-well)</td><td>アメリカ コーニング、アメリカ</td><td>17</td><td>胚プレート染色用容器</td></tr><tr><td>(6-well)</td><td>アメリカ コーニング</td><td>16</td><td>胚繁殖用容器</td></tr><tr><td>振とう台</td><td></td> 中国 <td>19</td><td>溶液を混合</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン、日本</td><td>20</td> ゼブラフィッシュ<td>の観察と撮影</td></tr><tr><td></td><td>蘇州大学ゼブラフィッシュ実験センター、蘇州、中国</td><td>22</td><td>実験動物</td></tr></tbody></table>

アリザリンレッド染色を使用してゼブラフィッシュ幼虫の化学的に誘発された骨量減少を検出

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

鉛(Pb)曝露による化学的に誘発された骨量減少は、人間と動物の両方の骨格系に一連の悪影響を引き起こす可能性があります。しかし、ゼブラフィッシュの具体的な効果とメカニズムは不明のままです。アリザリンレッドはカルシウムイオンとの親和性が高く、骨を視覚化し、骨格ミネラル量を説明するのに役立ちます。本研究では、アリザリンレッド染色を用いてゼブラフィッシュ幼生の酢酸鉛(PbAc)による骨量減少の検出を目指した。ゼブラフィッシュの胚は、受精後2〜120時間の間に一連のPbAc濃度(0、5、10、20 mg / L)で処理されました。受精後9日目の幼虫に対してホールマウント骨格染色を行い、ImageJソフトウェアを用いて総染色面積を定量した。その結果、石灰化組織は赤色に染色され、PbAc曝露群では染色面積が有意に減少し、骨の石灰化が用量依存的に変化することが示されました。この論文は、PbAc誘発骨欠損の骨格変化を調査するための染色プロトコルを提示します。この方法は、他の化学物質によって誘発される骨量減少の検出のためにゼブラフィッシュ幼虫においても使用することができる。

アリザリン赤色染色は、ゼブラフィッシュ幼虫の骨石灰化の変化を測定するための高感度で特異的な方法です。本研究では、PbAcがゼブラフィッシュ幼生に、死亡、奇形、心拍数の低下、体長短縮などの悪影響があることを観察しました。さらに、ゼブラフィッシュ幼生のミネラル骨格領域を評価し、PbAc誘発性骨量減少を調べた。9 dpf(図1A)では、副蝶形骨(PS)、オペクル(OP)、角鰓(CB)、脊索(NC)など、頭骨格の多くの骨が石灰化しているため、赤色に染色されます。対照的に、耳石(OT)(非骨構造)は赤ではなく茶色がかった黒に見えます。デジタル分析は、各画像における総染色面積を定量化するために実施された。対照群と比較して、10および20 mg/L PbAcで処理された酢酸鉛群は、染色領域で有意な減少(p &lt; 0.001)を示しました(図1B)。骨石灰化の変化は用量依存性を示した。
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ここでは、アリザリンレッド染色を使用して、酢酸鉛曝露がゼブラフィッシュ幼虫の骨量変化を引き起こすことを示しました。この染色法は、他の有害毒物によって誘発されるゼブラフィッシュ幼虫の喪失における骨量減少の調査に適合させることができる。

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

この方法は、ゼブラフィッシュの化学物質によって誘発される骨毒性を検出するのに役立ちます。アリザリンレッド 固定組織の染色は、いくつかの標本の比較を容易にすることができる骨格変化の永久記録を生成します。この技術は、骨粗鬆症の特徴の1つが骨量の減少であるため、ゼブラフィッシュモデルで骨粗鬆症を研究するのに役立つ可能性があります。受精後9日目に各グループから10匹のゼブラフィッシュ幼虫をランダムに取り除き、1ミリリットルの2%パラホルムアルデヒドと1X PBSに2時間固定します。溶液をデカントし、pH7.5または10ミリモルの塩化マグネシウムで100ミリモルのトリスHCLを使用してゼブラフィッシュの幼虫を洗浄します。脱染色のために、溶液をデカントし、原稿に記載されているように一連の溶液中で幼虫を5分間インキュベートする。最終インキュベーション後、溶液をデカントし、3%過酸化水素と0.5%水酸化カリウムからなる溶液で漂白することによって色素を除去する。色素が完全に除去されるまで、10分に1回観察してください。ゼブラフィッシュの幼虫を25%グリセリン、0.1%水酸化カリウムで泡がなくなるまでそれぞれ10分間数回すすぎます。1ミリリットルの0.01%アリザリンに浸して幼虫を染色する。溶液をデカントし、1ミリリットルの50%グリセリンまたは0.1%水酸化カリウムを加えてバックグラウンドをクリアします。その後の観察のために、魚を新鮮な50%グリセリンまたは0.1%水酸化カリウムに保管します。一度に1匹ずつ幼虫をスライドガラスに移し、幼虫を液滴の中央に保ちます。実体顕微鏡で幼虫を観察する。カメラの電源を入れます。ソフトウェアを開き、デフォルト設定のままにします。AEをクリックし、適切な露光時間を選択して最適な画像を取得します。同じ設定ですべての画像をキャプチャします。後で分析できるように、画像をドットtiff形式で保存します。画像をダブルクリックしますJアイコン。保存された画像を分析するには、ファイルをクリックしてから開き、次に画像をクリックし、8ビットを入力して選択します。編集をクリックし、反転します。分析をクリックし、キャリブレーションします。ポップアップ インターフェイスで [未キャリブレーション OD] を選択します。下部インターフェイスの左下にあるグローバルキャリブレーションを確認し、[OK]をクリックします。分析をクリックし、スケールを設定してから、スケールを削除します。以下のグローバルを確認し、[OK]をクリックします。[分析]をクリックし、測定値を設定します。ポップアップ インターフェイスでアイテム領域を選択します。以下のしきい値の制限を確認して、選択した範囲のみを測定し、[OK]をクリックします。画像をクリックし、調整してからしきい値を表示し、ポップアップインターフェイスの中央にあるスライダーをスライドさせます。1 つのイメージでテストするすべてのターゲットが選択されるように、適切なしきい値を選択します。そして、[設定]をクリックします。分析をクリックしてから、測定し、日付を保存します。アリザリンレッド染色は、ゼブラフィッシュ幼虫の骨石灰化の変化を測定するための高感度で特異的な方法です。受精後9日目に、傍蝶形骨、手術、角鰓、脊索などの頭骨格の多くの骨が石灰化しているため、赤く染まります。対照的に、耳石のような非骨の構造は茶色の黒に見えます。総染色面積を定量化するために実施されたデジタル分析は、酢酸鉛処理群の1リットル当たり10および20ミリグラムについて染色面積の有意な減少を示した。骨石灰化の変化は用量依存性を示した。より良い染色効果と観察のためには、ゼブラフィッシュ幼虫の元の色素を取り除き、漂白後に泡を取り除くことが重要です。

using-alizarin-red-staining-to-detect-chemically-induced-bone-loss

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

アリザリンレッド染色:培養骨芽細胞による石灰化を可視化する技術

このビデオでは、アニオン性色素であるAlizarin Red...

In vitro石灰化アッセイ:Alizarin Red S染色および抽出による骨移植代替物上の骨芽細胞カルシウム沈着物を定量するための比色法

神経学的および非神経疾患の多くのゼブラフィッシュモデルは成魚ではなく、胚/幼虫で研究されているため、我々は大人のゼブラフィッシュの疾患モデルに適用することができ、定量的側線再生アッセイを開発しました。アッセイは、1）感丘および2）個々の有毛細胞レベルでの解像度を含んだ。...

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エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

小さな実験用魚は、人間の骨障害の根底にあるメカニズムに関する骨研究や、骨調節薬のスクリーニングのための人気のあるモデルとなっています。本報告では、骨粗鬆症病変を有するメダカ幼虫の骨細胞に対するアレンドロネートの効果を評価するためのプロトコールについて述べる。...

薬物治療と<em&gt;インビボ</em&gt;メダカ骨粗鬆症モデルにおける骨芽細胞破骨細胞の相互作用のイメージング

このプロトコルの目的は、選択的な育成によってゼブラフィッシュにおける致命的な骨格変異表現型の浸透度を変更することです。致命的な突然変異体が大人に成長することはできません彼ら自身を繁殖、このプロトコルが追跡とテストの子孫によって複数の生成を通して浸透度を選択するための方法を記述するため。...

テストの子孫によるゼブラフィッシュ致死の骨格変異の浸透度をシフト

骨組織の再生にプレドニゾロンの効果を研究する大人のゼブラフィッシュ傷害モデル

このプロトコルは生体 内の 再生の間にゼブラフィッシュのelasmoidスケールの収穫そして視覚化を記述する。さらに、これらの鱗屑の収穫後最大7日間の 生体外...

ゼブラフィッシュの鱗の再生 TOTO および Ex Vivo の鱗の培養

このプロトコールは、簡単な in vitro...

ゼブラフィッシュのカイガラムシの細胞動態を研究するためのin vitro培養技術

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生で実施される 2 光子レーザー アブレーション...

ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨芽細胞の2光子レーザー媒介アブレーション

ここで説明するプロトコルは、生後5日のゼブラフィッシュ幼虫の頭蓋顔面軟骨を染色および解剖するための簡単で従いやすい手順を示しています。さまざまな発達条件下でのこれらの構造の解剖学的構造、形状、サイズを研究するために使用できます。...

アルシアンブルー染色時のゼブラフィッシュ頭蓋顔面組織の解剖

学ぶアリザリンレッド染色法でゼブラフィッシュ幼虫の化学的骨毒性を検出する手法です。酢酸鉛曝露による骨量変化を可視化し、骨粗鬆症モデルや環境毒性物質の影響評価に応用可能です。

アリザリンレッド染色を使用してゼブラフィッシュ幼虫の化学的に誘発された骨量減少を検出

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