Name: 初代マウス肺内皮細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 学ぼう、新生マウス肺から高純度内皮細胞を単離・培養する方法。磁気ビーズと抗体を用いた選択法でCD31陽性細胞を収率よく取得し、二次免疫ビーズ選択で純度を向上させます。この技術は血管生物学研究や治療標的発見に活用できます。

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この作業は、NIH T32GM008440 (JH/EW) および NIH R01AI058106 (JH) によってサポートされました。我々は、UCSFパルナッソスフローサイトメトリーコア(RRID:SCR_018206)が、NIH P30 DK063720およびNIH S10機器グラントS10 1S10OD021822-01によって部分的にサポートされていることを認める。

すべての動物の手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校の施設内動物管理および使用委員会によって承認されました。雄のC57BL / 6新生児マウスの子犬(5〜7日齢)が研究に使用されました。プロトコル全体は7〜10日かかります(図1)。
1. 内皮細胞培地の調製
<ol><li>基礎培地の準備:4,500 mg / Lのグルコースと4 mMのL-グルタミン(DMEM)を含むダルベッコの改変イーグル培地に、20%(v / v)熱不活化ウシ胎児血清、100 U / 100 μg / mLのペニシリン/ストレプトマイシン、および25 mMのHEPESを添加します( 材料の表を参照)。22μMフィルター付き滅菌フィルター。基礎培地は4°Cで保存し、調製後1ヶ月以内に使用してください。</li>
	<li>完全な培地を調製する:100 μg/mLのヘパリン、100 μg/mLの内皮細胞増殖サプリメント、1x非必須アミノ酸、および1 mMピルビン酸ナトリウムを添加した基礎培地( 材料の表を参照)。22μMフィルター付き滅菌フィルター。4°Cで保存し、調製後1ヶ月以内に使用してください。</li>
</ol>2.抗ラット磁気ビーズのプレコーティング13
<ol><li>50 mLのビーズ洗浄バッファーを作る:0.1%(w / v)ウシ血清アルブミン(BSA)を添加したリン酸緩衝溶液(PBS)。22 μMフィルターで滅菌し、4°Cで保存し、調製後1か月以内に使用します。</li>
	<li>磁気ビーズを数秒間ボルテックスしてビーズを再懸濁し、50 μLのビーズ(2 x 107 ビーズ)を2本の1.5 mLマイクロ遠心チューブ(CD-31用とCD-102用)にピペットで入れます( 材料の表を参照)。1 mLのビーズ洗浄バッファーを加え、よく混ぜます。 注:上記のすべてのボリュームは、3〜4匹の新生児マウスの子犬(5〜7日齢)から内皮細胞を単離するために使用されました。CD-31およびCD-102は、磁気イムノビーズの選択に使用される内皮細胞表面マーカーです。</li>
	<li>チューブを磁気分離器の上に置き、ガラスパスツールピペットで上清を除去します。毎回1 mLのビーズ洗浄バッファーで洗浄を3回繰り返します。</li>
	<li>ビーズを元のビーズ容量50 μLにビーズ洗浄バッファーで再懸濁します。次に、ビーズ50 μLごとに5 μL(2.5 μg)の抗体(CD-31/CD-102)を追加します。</li>
	<li>ビーズ懸濁液をエンドオーバーエンドローテーター上で穏やかに回転させて、4°Cで一晩、または室温で3時間インキュベートします。洗浄を4回繰り返します。</li>
	<li>イムノビーズを元の容量50 μLにビーズ洗浄バッファーで再懸濁し、4°Cで保存して1〜2週間以内に使用します。</li>
</ol>3.肺細胞の単離とメッキ
<ol><li>分離日にタイプ1コラゲナーゼ溶液を調製する:25 mgのタイプ1コラゲナーゼを25 mLのHBSSに加えます( 材料の表を参照)。穏やかな回転と22 μMフィルターを使用した滅菌フィルターで37°Cで1時間インキュベートします。溶液を37°Cで保温します。</li>
	<li>安楽死の10分前に、5〜7日齢のマウスの子犬にヘパリン(25 μL /マウス、1,000 U / mL)を筋肉内に注射して、内皮細胞の活性化と血栓形成を最小限に抑えます14,15。</li>
	<li>2020年の安楽死に関するAVMAガイドラインに従って、鋭利なハサミを使用して断頭してマウスの子犬を安楽死させます。次に、マウスを腹側を上にして解剖板に固定します。</li>
	<li>枝肉に70%エタノールをスプレーし、次に最初に横隔膜を切断し、次に胸部の側壁全体に沿って上向きに切断することによって胸腔を露出させる。胸郭を反射すると、心臓と肺が露出します。 注:新生児マウスのサイズが小さいため、このステップには小さい鉗子とはさみを使用し、肺からの血液除去が不十分になるため、心臓や肺を突き刺さないようにしてください。</li>
	<li>25 Gの針を10 mLの注射器に取り付け、5 mLの冷たいDMEMを心臓の右心室に注入して、肺から血液を取り除きます。肺が白くなります。</li>
	<li>対応する気管支の遠位葉を切断することにより、一度に1つの葉を胸腔から肺を取り除きます。</li>
	<li>すべての肺葉を、20 mLの氷冷基礎培地で事前に充填された50 mLのコニカルチューブにプールします(ステップ1.1から)。</li>
	<li>他のマウスの子犬で手順3.2〜3.7を繰り返し、すべての肺葉を同じ50mLの円錐形チューブにプールします。</li>
	<li>チューブを手で10〜15秒間静かに攪拌して、肺の表面に視覚的に認識された余分な赤血球を洗い流します。 注:肺内または肺周辺からすべての血液を除去する必要はありません。ただし、これにより純度が向上します。それ以上の組織の取り扱いは、滅菌フードで行う必要があります。</li>
	<li>細胞ストレーナーを使用して培地から肺を取り除き、組織を滅菌済みの使い捨て直径100 mmの組織培養皿に移し、滅菌ハサミでミンチします。</li>
	<li>ミンチ組織を、25 mLの予温したコラゲナーゼ溶液を入れた50 mLのコニカルチューブに移します(ステップ3.1)。回転ミキサーで37°Cで45分間穏やかに攪拌します。 注意: 60分間でも過剰消化すると、収量が低下する可能性があります。</li>
	<li>20 mLシリンジを15 Gの鈍いカニューレに取り付け( 材料の表を参照)、懸濁液を10〜15回粉砕して、組織を細胞懸濁液に分解します。元気になりますが、過度に泡立てないでください。 注:肺の目に見える部分はなくなり、代わりに、この手順が完了するとサスペンションが曇ります。</li>
	<li>懸濁液を70 μmのセルストレーナーを通してろ過し、新しい50 mLコニカルチューブに入れます。さらに、消化に使用したコニカルチューブとセルストレーナーを追加の15 mLの基礎培地ですすいでください。</li>
	<li>細胞懸濁液を400 x g で4°Cで8分間遠心分離します。</li>
	<li>ガラスパスツールピペットで上清を除去し、ペレットを2 mLの完全培地に再懸濁します。T-75フラスコに移し、加湿した5%CO2 インキュベーターで37°Cで8 mLの完全培地培養液を加えます。</li>
	<li>翌日、カルシウムとマグネシウムを含まない10 mLのハンクスバランスソルト溶液(HBSS / CMF)でフラスコを2回洗浄し( 材料の表を参照)、10 mLの完全培地を追加します。 注:2〜3日後、培養液は90〜95%コンフルエントになり、一次イムノビーズ分離の準備が整います。</li>
</ol>4. 内皮細胞の一次イムノビーズ単離と培養
<ol><li>付着した内皮細胞を10 mL HBSS/CMFで2回洗浄します。2 mLのトリプシンフリー細胞剥離溶液( 材料の表を参照)を加え、37°Cで~5分間インキュベートします。すべての細胞がフラスコから持ち上げられていることを確認します。 注:トリプシンは細胞表面接着マーカーCD-31を破壊する可能性があるため、トリプシンの代わりにトリプシンフリーの剥離溶液を使用する必要があります。</li>
	<li>8 mLの基礎培地を加えて細胞剥離液を中和し、内容物を15 mLのコニカルチューブに移します。室温で400 x g で4分間スピンダウンします。</li>
	<li>ガラスパスツールピペットを使用して上清を除去し、細胞を2 mLの基礎培地に再懸濁します。2 mL 細胞懸濁液を 5 mL 丸底ポリスチレンチューブに移します (材料表を参照)。</li>
	<li>ボルテックス抗CD-31コーティングビーズを数秒間使用してビーズを再懸濁し、細胞懸濁液2 mLごとに30 μLのビーズを追加します。蓋をしっかり閉めます。</li>
	<li>エンドオーバーエンドローテーターで室温で10分間チューブをインキュベートします。次に、チューブを磁気分離器の上に置き、2分間放置します。</li>
	<li>ガラス製パスツールピペットを穏やかに使用して、上清を吸引する。チューブを磁石から取り外し、3 mLの基礎培地をチューブに加えてビーズセルペレットを再懸濁し、数回上下にピペットで動かします。</li>
	<li>磁気分離器のチューブを2分間交換してから、ガラスパスツールピペットを使用して上清を注意深く吸引します。</li>
	<li>上清が透明になるまで、洗浄(ステップ4.6〜4.7)を少なくとも4回繰り返します。</li>
	<li>最終洗浄後、ビーズ細胞ペレットを3 mLの完全増殖培地に再懸濁し、T-75フラスコに移します。7mLの完全増殖培地を添加し、加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>翌日、HBSS/CMFで細胞を洗浄し、10 mLの新鮮な完全培地を加えます。培地を10 mLの新鮮な完全培地と交換し、90〜95%コンフルエントになるまで2〜3日ごとに交換します。 注:細胞が~90-95%コンフルエントになると(~3-4日かかります)、培養液は二次イムノビーズ単離の準備が整います。</li>
</ol>5. 内皮細胞の二次イムノビーズ単離・培養
<ol><li>付着した内皮細胞を10 mLのHBSS/CMFで2回洗浄します。2 mLのトリプシンフリー細胞剥離溶液を加え、37°Cで~5分間インキュベートします。すべての細胞がフラスコから持ち上げられていることを確認します。</li>
	<li>8 mLの基礎培地を加えて細胞剥離液を中和し、15 mLのコニカルチューブに移します。室温で400 x g で4分間スピンダウンします。</li>
	<li>ガラスパスツールピペットを使用して上清を除去し、細胞を2 mLの基礎培地に再懸濁します。2 mL 細胞懸濁液を 5 mL 丸底ポリスチレンチューブに移します。</li>
	<li>ボルテックス抗CD-102コーティングビーズを数秒間使用してビーズを再懸濁し、細胞懸濁液2 mLごとに30 μLのビーズを追加します。蓋をしっかり閉めます。</li>
	<li>エンドオーバーエンドローテーター上で室温でチューブを10分間インキュベートします。チューブを磁気分離器に置き、2分間放置します。次いで、ガラス製パスツールピペットを用いて上清を穏やかに吸引する。</li>
	<li>チューブを磁石から取り外し、3 mLの基礎培地をチューブに加えてビーズセルペレットを再懸濁し、数回上下にピペットで動かします。</li>
	<li>磁気分離器のチューブを2分間交換してから、ガラスパスツールピペットを使用して上清を注意深く吸引します。</li>
	<li>上清が透明になるまで洗浄(ステップ5.6〜5.7)を4回以上繰り返します。</li>
	<li>最終洗浄後、ビーズ細胞ペレットを3 mLの完全増殖培地に再懸濁し、T-75フラスコに移します。7 mLの完全増殖培地を加え、加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>翌日、HBSS/CMFで細胞を洗浄し、10 mLの新鮮な完全培地を加えます。培地を10 mLの新鮮な完全培地と交換し、90〜95%コンフルエントになるまで2〜3日ごとに交換します。内皮細胞が完全にコンフルエントになると、実験の準備が整います。細胞は、老化が起こる可能性があり、他の細胞タイプが引き継ぐ可能性があるため、継代6を超えて使用しないでください。</li>
</ol>6. フローサイトメトリーによる内皮細胞表面マーカーの確認
<ol><li>トリプシンフリーの細胞剥離溶液を使用して細胞を剥離した後、細胞ペレットを1 x 10 5細胞/mLに再懸濁し、100 μLの細胞懸濁液を1、2、および3とラベル付けした3本の1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。</li>
	<li>1 mLの1x PBSで細胞を洗浄します。500 x g で4°Cで2分間遠心分離します。 洗浄バッファーを取り出し、2回繰り返します。</li>
	<li>細胞ペレットを100 μLの1x PBSに再懸濁します。チューブ1に、1 μLのコンジュゲート抗マウスCD-31(PECAM-1)抗体(例:フィコエリスリン(PE)抗マウスCD-31抗体)と1 μLのコンジュゲート抗マウスCD-102(ICAM-2)(例:フルオレセインイソチオシアネート(FITC)抗マウスCD102抗体)を加えます( 材料の表を参照)。チューブ2に、適切なアイソタイプコントロールを追加します。チューブ番号3は染色されません。</li>
	<li>チューブを氷の上と暗所で30〜45分間インキュベートします。</li>
	<li>各チューブに1 mLのPBSを加え、穏やかにボルテックスし、500 x g で4°Cで2分間遠心分離します。 洗浄を取り除き、3回繰り返します。最終ペレットを500 μLのPBSに再懸濁します。</li>
	<li>分析するまで、チューブをアルミホイルで覆って4°Cに保ちます。分析は3〜4時間以内に完了する必要があります。</li>
	<li>サイトメーターを使用してフローデータを取得します。染色されていないサンプルをネガティブコントロールとして使用し、細胞の自家蛍光に応じてレーザー電圧を適切に設定します。前方散乱プロットと側方散乱プロットを使用して全細胞集団をゲートします。 注:ダブレットを除外した後、CD31 + CD102 +ダブルポジティブ細胞は内皮細胞として定義されます。</li>
</ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

このシンプルなプロトコルは、マウス肺からの高純度内皮細胞に適しています。開始から終了までの合計時間は7〜10日ですが、ハンズオン時間は約3〜4時間です。他の方法13、14、15、16と比較して、現在のプロトコルは合理化されており、収率および純度を損なうことなく本質的なステップを維持する。
このプロトコルのいくつかの重要な側面に注目する価値があります。まず、成体マウスではなく新生児の子犬を使用することが重要です。私たちの経験では、成体マウスの内皮細胞は新生児の子犬の細胞ほど簡単には増殖せず、線維芽細胞や間葉系幹細胞と一致する紡錘状の形態を持つ細胞に簡単に襲われます15,16。この違いの考えられる説明の1つは、肺の発達が新生児マウスの肺胞段階にあり、内皮細胞のより急速な増殖を特徴とすることである20。21歳の加齢に伴い、ある程度の老化があるかもしれません。酵素消化時間も正確である必要があり、消化不足は低収率の単一細胞懸濁液につながる可能性があるためです。対照的に、過剰消化はかなりの量の細胞死につながる可能性があります。我々は、コラゲナーゼ消化のための最適時間は45分であると決定した。これに続いて、鈍いカニューレで機械的解離します。酵素消化中に気管内コラゲナーゼを点滴することも報告されています14,15;ただし、これには時間がかかり、現在の作業中に消化が不完全になる可能性があります。最後に、いくつかのプロトコルは、酵素消化の直後にイムノビーズ単離に直接進む13,16。イムノビーズの選択を行う前に、解離した肺の細胞を培地で1〜2日培養すると、生存可能で高純度の内皮細胞の収量が大幅に向上することがわかりました。これは、単離された細胞を組織培養培地に入れる速度に関連している可能性があり、マウスから取り出した後の初期段階での細胞死の減少、初期播種密度の増加、および最初のイムノビーズ単離前の内皮細胞が接着および増殖する時間につながります。
マウス内皮細胞の調製および解析の限界は以下の通りである。各マウスは、数パッセージ内で使用しなければならない限られた数の細胞のみを提供します。この問題は、いくつかのマウスからの肺消化をプールすることによって克服することができます。残念ながら、将来の使用のために細胞を凍結保存および解凍する取り組みは成功していません。これらの制限にもかかわらず、マウス内皮細胞にはいくつかの利点があります。特に、ヒトリンパ管内皮細胞を使用できない状況(遺伝子ノックアウトなど)、ヒト細胞で結果を裏付けるために補完的な研究が必要な場合、または異なるヒトドナーからの内皮細胞の応答の不均一性が実験間の再現性を問題にする場合に役立ちます6.遺伝的に同一のマウスからの均質な内皮細胞集団は、安定したバックグラウンド条件下での実験と特定の遺伝子および経路の研究との間の再現性を可能にします。
マウス内皮細胞は、さまざまな疾患プロセスにおける内皮の活性化と機能障害に関する洞察を提供するために、複数のアプリケーションに使用することができます。例えば、内皮細胞は敗血症において不可欠な役割を果たし、局所性および全身性炎症の活性化、組織内の白血球輸送および活性化の促進、凝固の調節、および内皮透過性の調節における役割を通じて、有益な応答と病理学的応答の両方に貢献します2,22,23。.このシンプルなプロトコルは、これらの内皮プロセスのそれぞれのアッセイに使用できる、生存可能で機能的な内皮細胞を提供します。

微小血管内皮細胞の機能不全は、脳卒中、心血管疾患、糖尿病、急性肺損傷、敗血症、および非感染性損傷などの複数のヒト疾患で発生するため、血管内皮の研究への関心が最近高まっています1,2,3,4,5。これらの病因を定義し、保護および調節不全の内皮細胞応答における特定の遺伝子の役割を理解するには、マウスから高純度微小血管内皮細胞を単離および培養するための信頼性の高い方法が必要です。多くの研究では、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)やヒト肺微小血管内皮細胞(HMVEC)などのヒトリンパ管内皮細胞を利用していますが、マウス内皮細胞を使用して内皮機能と機能障害を研究する理由は複数あります。第一に、異なるヒトドナーからの内皮細胞の応答にはかなりの不均一性があり、これは個々の実験間の結果のばらつきをもたらす6、7、8。第二に、初代ヒト細胞株における遺伝子標的のサイレンシングは、タンパク質発現レベル9,10の変動にもつながり得る。対照的に、マウス内皮細胞の応答には最小限の不均一性があります11、遺伝的背景が研究グループ間で同じであると仮定します。さらに、多数のマウス内皮細胞は、数匹の新生児マウス由来の肺をプールすることによって調製することができる。これらの要因により、実験間でより一貫性のある再現性のある結果が得られます。最後に、ノックアウトマウスまたはトランスジェニックマウスの利用可能性は、目的のタンパク質を欠く細胞型の単離も提供する。
公開された方法12、13、14、15、16を使用してマウス肺内皮細胞の健全で純粋な集団を単離することに関するかなりの課題は、高品質のマウス肺微小血管内皮細胞を単離するためのより信頼性が高く簡単な方法の開発につながりました。現在のプロトコルの利点には、容易に入手可能な新生児マウスの使用、畜産および住居費の制限が含まれる。さらに、私たちの経験では、新生児マウスからの内皮細胞の生存率は、成体マウスから調製された内皮細胞よりも大幅に高いです。新生児マウスは肺組織が小さいため、成体マウスからの採取に推奨されるコラゲナーゼの気管点滴注入を使用するのではなく、切除した肺をコラゲナーゼに消化することによって内皮細胞を採取することができます16。これにより、マウスを安楽死させてから内皮細胞を細胞培養培地やインキュベーターに入れるまでの時間が短縮され、内皮反応の純度や収量、再現性に影響を与えることはありません。最後に、純粋な細胞集団をフローサイトメトリーなしで単離したため、内皮細胞に損傷を与えたり、収量を低下させたりする可能性があります14、15、17。
現在の修正されたプロトコルは、一貫して7〜10日で高純度で生存可能な内皮細胞をもたらし、 インビトロ 実験にすぐに使用できます。ノックアウト動物から直接細胞を単離することで、実験前の細胞の操作も最小限に抑えられます。これらの方法は、内皮機能におけるさまざまなタンパク質の役割を調査し、複数の疾患の内皮ベースの治療標的を発見するために使用できます。

<table><tbody><tr><td>50 mL コニカル</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Accutase Cell Detachment Solution</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8"</td><td>Becton Disckinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BioRender.com</td><td>BioRender</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt Cannula 15 G x 1-1/2"</td><td>Covidien</td><td>8881202314</td><td></td></tr><tr><td>CD-102 ラット抗マウス (3C4 (MIC2/4))</td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>CD-31 ラット抗マウス (MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ, Type 1</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS004194</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 高グルコース</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Sheep 抗ラット IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>内皮細胞増殖支援</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>Falcon細胞ストレーナー(70 & micro;m)</td><td>コーニングライフサイエンス</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、熱不活性化</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 使い捨てホウケイ酸ガラス パスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>FITC ラット抗マウス CD102 (3C4)</td><td>BD Biosciences</td><td>557444</td><td></td></tr><tr><td>FITC ラット IgG2a,&nbsp;&カッパ;アイソタイプコントロール (R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553929</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no Calcium, no Magnesium, no phenol red</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injections (1,000 Units/mL)</td><td>Medline</td><td>0409-2720-02</td><td></td></tr><tr><td>豚腸粘膜由来ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat Anti-mouse CD31 (MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a,&nbsp; &kappa;&nbsp;アイソタイプコントロール R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン (10,000 U/mL, 10,000 &micro;g/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IFN-&γ;</td><td>Peprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス IL-1&β;</td><td>Peprotech</td><td>211-11B</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス TNF-&alpha;</td><td>Peprotech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>丸底ポリスチレン試験管</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Semken Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick Release-GP 滅菌真空ろ過システム、250 mL</td><td>ミリポア</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP 滅菌遠心分離機チューブトップフィルターユニット</td><td>Milipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジ (10 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>滅菌シリンジ (20 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>T-75 細胞培養フラスコ、ベントキャップ付き、CellBIND処理</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3290</td><td></td></tr></tbody></table>

初代マウス肺内皮細胞の単離

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

内皮細胞は、血管緊張、免疫、凝固、および透過性の調節において重要な役割を果たします。内皮機能障害は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、敗血症、急性肺損傷などの病状で発生します。マウスから純粋な内皮細胞を単離するための信頼性が高く再現性のある方法は、これらの状態および他の状態の病因における内皮細胞の役割を調べるために必要です。このプロトコールにおいて、肺微小血管内皮細胞は、5〜7日齢の新生児マウスの子犬から調製した。肺を採取し、細かく刻み、コラゲナーゼIで酵素消化し、放出された細胞を一晩培養します。次に、磁気ビーズに結合させた抗PECAM1(CD-31)IgGを使用して内皮細胞を選択し、細胞を再びコンフルエントになるまで培養します。次に、内皮細胞の純度を高めるために磁気ビーズに結合した抗ICAM2(CD-102)IgGを使用して二次細胞の選択が行われ、細胞が再びコンフルエントになるまで培養されます。細胞を実験に使用できるようになるまで、プロセス全体に約7〜10日かかります。このシンプルなプロトコルにより、高純度(純度>92%)の内皮細胞が得られ、内皮サイトカインとケモカインの産生、白血球と内皮の相互作用、内皮凝固経路、内皮透過性に焦点を当てた研究など、 in vitro 研究にすぐに使用できます。多くのノックアウトおよびトランスジェニックマウス系統が利用可能であるため、この手順は、損傷、感染、および炎症に対する健康で病理学的な反応における内皮細胞によって発現される特定の遺伝子の機能を理解するのにも役立ちます。

このシンプルなプロトコルにより、マウス微小血管内皮細胞を7〜10日間にわたって分離、培養、および特性評価することができます(図1)。簡単に言えば、肺はメッキ前に切除され、酵素的に消化されます。プレーティング直後、内皮細胞や他の細胞が細胞培養培地に浮遊します。翌日までに、内皮細胞と汚染細胞がプレートに接着し、破片と浮遊細胞を除去するために激しい洗浄技術が必要です。細胞がコンフルエントに達すると、最初のイムノビーズの選択が行われます。その後、CD-31陽性細胞は石畳状に増殖し始めます(図2)。石畳の形態を持たない細胞や過剰増殖しない細胞は夾雑物であり、内皮細胞ではありません13、14、15、16。
次いで、第2のイムノビーズ選択は、他のプロトコルと同様に、内皮細胞の純度を高めるために抗CD−102コーティングビーズを用いて行われる13、16。2回目のイムノビーズ選択後にコンフルエントに成長した細胞は、実験に使用できます。蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して、細胞集団がCD-31およびCD-102陽性であることを確認しました(図3)。
これらの内皮細胞は、内皮炎症経路や内皮バリア機能の研究など、多くの用途に使用できます。例えば、マウスサイトミックス(IFNg、TNFa、およびIL1b、それぞれ10 ng / mL)で処理すると、内皮細胞によるIL-6産生が誘導されることが観察されました (図4A)。次に、電気セル-基板インピーダンスセンシング(ECIS)18 を使用して、マウス肺内皮細胞単層を横切る電流の流れに対する経内皮抵抗(TER)を測定しました。サイトミックスで処理した細胞はTERの低下をもたらし (図4B)、 これは内皮透過性の増加と一致していることが観察されました。これらの実施例は、このプロトコルを使用して調製された内皮細胞が様々な内皮プロセスを研究できる方法を示す。これにより、利用可能なノックアウトマウスやトランスジェニックマウスの数が増え続けていることを考えると、研究者は内皮細胞で関心のある遺伝子をより簡単に研究することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig01.jpg"> 図1:マウス肺内皮細胞の単離の概略図。 5〜7日齢の新生児の子犬の肺を採取して細かく刻みます。細切した組織をコラゲナーゼIで酵素消化し、細胞懸濁液を播種し、2〜3日間培養する。その後、細胞はCD-31コーティングビーズで一次イムノビーズ単離され、さらに3〜4日間培養されます。さらに2〜3日間培養する前に、CD−102コーティングビーズによる2回目のイムノビーズ単離。これで、細胞は機能実験の準備が整いました。画像は、WebベースのイラストツールであるBiorenderによって作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig02.jpg"> 図2:マウス肺内皮細胞の形態。 培養マウス肺内皮細胞は石畳の形態を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig03v2.jpg"> 図3:フローサイトメトリーによる内皮細胞の解析 。 (A)すべてのイベントは、前方散乱(FSC)と側方散乱(SSC)のドットプロットで視覚化されます。(B)マウス肺内皮細胞が内皮特異的細胞表面抗原CD-31およびCD-102の両方に対して陽性であることの散布図確認。(C)アイソタイプサンプルとCD-31/CD-102特異的抗体で染色したサンプルのヒストグラム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig03largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig04.jpg"> 図4:サイトミックスは、マウス肺内皮細胞IL-6産生および内皮細胞透過性を誘導する。 C57BL/6マウス由来のマウス肺微小血管内皮細胞をサイトミックス(IFNg、TNFa、およびIL1b、それぞれ10 ng/mL)で処理した。(A)次に、15時間で培養上清中のIL-6レベルを定量しました(**p&lt;0.01、n = 4ウェル/条件)。(B)電気セル-基板インピーダンスセンシングを使用して、経内皮抵抗(TER)を15時間以上繰り返し測定しました。データは、指定されたサイトミックスを添加する直前の耐性に正規化され、二元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くTukey事後検定19 (**p&lt;0.01、n = 4ウェル/条件)によって分析されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この記事では、新生児マウスから初代肺内皮細胞を単離し、培養しました。

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

このプロトコルは、複数の用途を持つ可能性のあるマウスから高純度の内皮細胞を単離および培養するための信頼性が高く再現性のある方法を実証しています。この技術は、内皮細胞の収量と純度を維持するより簡単な方法です。手順を実演するのは、私の研究室のスタッフ研究員であるニーナ・グエンです。まず、磁気ビーズを数秒間ボルテックスします。50マイクロリットルのビーズをCD31およびCD102用の2本の1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。1ミリリットルのビーズ洗浄バッファーを加え、よく混ぜます。チューブを磁気分離器の上に置き、ガラスパスツールピペットで上清を除去します。ビーズを50マイクロリットルのビーズ洗浄バッファーに再懸濁します。次に、ビーズ50マイクロリットルごとに5マイクロリットルまたは2.5マイクログラムのCD31またはCD102抗体を追加します。ビーズ懸濁液を、端部ローテーター上で穏やかに回転させて、摂氏4度で一晩、または室温で3時間インキュベートします。イムノビーズを4回洗浄した後、イムノビーズを50マイクロリットルのビーズ洗浄バッファーに再懸濁します。分離当日、25ミリリットルのHBSSを25ミリグラムの1型コラゲナーゼに加え、穏やかに回転させながらインキュベートします。次に、22マイクロメートルのフィルターを使用してろ過します。生後5〜7日のマウスの子犬を安楽死させた後、枝肉に70%エタノールをスプレーします。次に、胸部の側壁全体に沿って横隔膜を上向きに切り、胸腔を露出させます。肺が白くなるまで、5ミリリットルの冷たいDMEMを心臓の右心室に注射します。次に、対応する気管支の遠位葉を1つずつ切断して、肺を取り除きます。20ミリリットルの氷冷基礎培地があらかじめ充填された50ミリリットルの円錐形のチューブで肺葉を引っ張ります。チューブを手で10〜15秒間静かに攪拌して、余分な赤血球を洗い流します。セルストレーナーで培地から肺を取り除き、滅菌ハサミでミンチします。ミンチ組織を、25ミリリットルの予熱したコラゲナーゼ溶液と共に50ミリリットルの円錐管に移します。回転ミキサーで静かに攪拌します。20ミリリットルの注射器を15ゲージの鈍いカニューレに取り付け、細胞懸濁液に10〜15回泡立てずに懸濁液を激しく粉砕します。懸濁液を70マイクロメートルのセルストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に濾過する。次に、消化に使用した円錐形のチューブとセルストレーナーを15ミリリットルの基礎培地ですすいでください。細胞懸濁液を摂氏4度で400倍Gで8分間遠心分離する。ペレットを2ミリリットルの完全培地に再懸濁します。8ミリリットルの完全培地を加えてインキュベートします。翌日、カルシウムとマグネシウムを含まない10ミリリットルのHBSSでフラスコを2回洗浄し、10ミリリットルの完全培地を加えます。細胞が90〜95%コンフルエントになると、一次イムノビーズ単離の準備が整います。付着した内皮細胞をカルシウムとマグネシウムを含まない10ミリリットルのHBSSで2回洗浄します。2ミリリットルのトリプシンフリー細胞剥離溶液を加え、それをインキュベートして、フラスコからすべての細胞を確実に持ち上げます。8ミリリットルの基礎培地を追加します。次に、細胞を室温で4分間400倍Gでスピンダウンし、2ミリリットルの基礎培地に再懸濁します。ボルテックス抗CD31コーティングビーズを数秒間、ビーズを再懸濁させた。細胞懸濁液2ミリリットルごとに30マイクロリットルのビーズを加え、蓋をしっかり閉めます。チューブをエンドオーバーエンドローテーターで室温で10分間インキュベートします。次に、チューブを磁気分離器に2分間置きます。上澄み液を吸引し、磁石からチューブを取り外します。3ミリリットルの基礎培地をチューブに加え、数回上下にピペッティングして、ビーズ細胞ペレットを再懸濁します。磁気分離器のチューブを2分間交換します。その後、ガラス製パスツールピペットを用いて上清を注意深く吸引する。最終洗浄後、上清が透明になったら、ビーズ細胞ペレットを3ミリリットルの完全増殖培地に再懸濁し、T75フラスコに移します。7ミリリットルの完全増殖培地を加えてインキュベートします。翌日、カルシウムとマグネシウムを含まないHBSSで細胞を再洗浄します。次に、10ミリリットルの完全培地を追加します。細胞が90〜95%コンフルエントになると、二次イムノビーズ単離の準備が整います。最初のイムノビーズの選択は、石畳の形成で成長するCD31陽性細胞を識別します。抗CD102コーティングビーズを用いた2回目のイムノビーズ選択は、内皮細胞の純度を高め、蛍光活性化セルソーティングを使用して、細胞集団がCD31陽性およびCD102陽性であることを確認する。内皮炎症経路と内皮バリア機能を研究するために、マウスCytomixによる処理を使用して、P値が0.01未満の内皮細胞による有意なIL-6産生を誘導しました。さらに、経内皮抵抗は減少し、内皮透過性の増加を示した。単離された内皮細胞は、内皮細胞刺激またはバリア機能アッセイにおいて、内皮機能障害に対する内皮ベースの治療標的を発見するために使用することができる。

isolation-of-primary-mouse-lung-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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