Name: マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶマウス心筋梗塞および虚血再灌流障害の誘発法。前下行枝冠動脈の精密結紮により、梗塞サイズを制御し、手術時間を短縮して生存率を向上させる再現性の高い心血管研究モデルです。

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この研究は、中国国家自然科学基金会(82070317、81700390はJibin Lin、8210021880はBingjie Lv、82000428はBoyuan Wang)と中国国家重点研究開発プログラム(2017YFA0208000 Shaolin He)の支援を受けた。

動物実験は、華中科技大学(中国・武漢)の動物飼育利用委員会によって承認されています。
注:雄のC57BL / 6Jマウス(8-10週)をモデルとして使用します。マウスは餌と水を自由に入手でき、特定の病原体のない条件で飼育されます。部屋は制御された温度(22°C±2°C)と湿度(45%〜65%)に保たれています。マウスは、同済医科大学(中国、武漢)の動物飼育施設で、この機関が設定したガイドラインに従って、12時間の明暗環境にさらされます。滅菌されたマイクロサージェリー器具と手術用品を使用してください。手術中は手術用手袋とマスクが必要です。実験ワークフローを 図1Aに示します。
1.術前の準備
<ol><li>外科手術中は、予熱した加熱パッド(37°C)を備えた長方形の手術台(OT)を使用します(図1B)。処置を開始する前に、紫外線と70%アルコールでボードを消毒してください。</li>
	<li>必要な麻酔薬の投与量を計算するために、すべてのマウスの体重を正確に測定します。次に、腹腔内注射により、ケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)でマウスに麻酔をかけます。つま先をつまんだりまばたき反射したりするための離脱反射がないことにより、適切な麻酔深度を確保します。.</li>
	<li>目の過熱を避けるために、頭の下にガーゼを敷いて、マウスをOTに仰臥位で置きます。眼科用軟膏を目に塗って、乾燥を防ぎます。</li>
	<li>左胸の毛皮を電気カミソリで剃ります。剃った胸部に毛皮除去クリームを使用し、滅菌綿棒で~1分間均一にマッサージします。余分な抜けた毛皮をガーゼで拭きます。</li>
	<li>ポビドンヨードを使用し、続いて70%アルコールを使用して領域を清掃します。胸部をガーゼで覆います。</li>
	<li>上切歯の下に4-0縫合糸を使用し、アンカーポイント(鼻の上のOTの端に近い)に固定して、口をわずかに開いたままにし、カニューレ挿入を容易にします。</li>
	<li>テールを引っ張って体をまっすぐに保ち、テープを使用してテールをOTに固定します。4本の手足を固定し、他のアンカーポイントで締めます。重要なのは、前肢を伸ばしすぎないことです。そうしないと、呼吸障害が発生する可能性があります。.</li>
	<li>湾曲した鉗子と鉗子を使用して顎を開き、舌を持ち上げます。イルミネーターを使用して、喉と声門をはっきりと視覚化します。</li>
	<li>22Gのカニューレを、鈍く切り詰めた針で、喉の奥~1cmの口から気管にそっと挿入します。片手で舌を持ち、鈍い鉗子で少し上に動かし、同時にもう一方の手でチューブを気管にそっと挿入します。チューブを食道に挿入しないように注意してください。</li>
	<li>針をそっと外します。人工呼吸器に接続する前に、チューブを水中に入れて気泡が発生しないように挿管を確認します。</li>
	<li>気管内チューブを120 / minに設定し、一回換気量を250μLに調整した人工呼吸器に接続します。 注意: 人工呼吸器の設定は体重によって調整されます(一般に、体重が大きいほど一回換気量が多くなります)。</li>
	<li>両側対称の胸部拡張をチェックして、挿管を確認します。次に、チューブが脱落しないように、接続部をテープでOTに固定します。</li>
	<li>前足に心電図電極を置き、心電図レコーダーに接続します。手順全体を通して心臓電気生理学を監視します。</li>
</ol>2.開胸術
<ol><li>胸部のガーゼを取り除きます。3回のスクラブサイクルを使用して、切開領域の70%アルコールで再度消毒します。次に、手術部位の汚染を減らすために、手術野に穴を開けた滅菌手術用ドレープでマウスを覆います。</li>
	<li>滅菌メスで左鎖骨中線に沿って斜めの皮膚切開(0.8〜1.0 cm)を行います。</li>
	<li>皮下組織の鈍的解剖を行い、その下の肋骨を露出させます。血管、肋骨、肺を傷つけないように注意してください。滅菌綿アプリケーターを使用して出血を止めます。</li>
	<li>3番目の肋間腔に約6〜8mmの切開を特定して行います。次に、沿岸間腔で組織の鈍解剖を行い、胸腔を開きます。胸部内動脈を傷つけないように注意してください。</li>
	<li>鉗子を使用して肋間腔にまたがります。滅菌済みの自家製リトラクター(図1C)を胸郭に挿入し、引き戻して切開部を幅~6mmに広げます。リトラクターを輪ゴムでOTに取り付けます。</li>
	<li>周囲の組織を慎重に取り除き、心臓を完全に露出させます。心臓を傷つけることなく、湾曲した鉗子で心膜を静かに引き抜きます。今、心臓のはっきりとした視界が利用可能です。</li>
</ol>3. LADライゲーション
注:LADは、頂点近くから左心室を通って垂直に走る細い赤い線として表示されます。LADは真っ赤な色をしているので、静脈と間違えないように注意してください。通常、結紮部位は左耳介から1~2mm下にあります。この結紮位置は、左心室の虚血の約40%〜50%を生成します。高い位置は、より広範囲の梗塞ゾーンを作成します。より遠位の部位は、より小さな梗塞ゾーンを作成します。
<ol><li>解剖顕微鏡を使用し、LADの可視化に焦点を絞った適切な光を当てます。選択したライゲーション位置の下の部位を軽く押して、LADを一時的に拡大します(毎回≤5秒)。この方法でLADを再確認します。</li>
	<li>テーパー針(3/8、2.5 x 5)を使用して8-0を通過させます解剖顕微鏡下でLADの下に絹の結紮糸。針の深さに注意してください:左心室に入るには深すぎず、LADの損傷を避けるために浅すぎないようにします。</li>
	<li>結紮糸をゆるい二重結びで結びます。ループの直径は約2〜3mmです。</li>
	<li>2〜3mmのPE-10チューブを動脈に平行なループに配置します。</li>
	<li>結紮ループが動脈とチューブの周りに来るまで、ゆっくりと締めます。次に、ループをスリップノットで固定します。過度の締め付け圧力で心筋壁を傷つけないように注意してください。 注:偽手術群ではライゲーションは行われません。</li>
	<li>LADの血流の停止を確認する:結紮後のLVの前壁の淡い色を観察します。さらに、数心拍以内の有意なST上昇も閉塞16を示しています。永久結紮が必要な場合(MIなど)、PE-10チューブを取り外し、LADを結び目で直接結びます。以下の手順4.3で説明したように、残りの手順を再開します。</li>
	<li>切開部からリトラクターを取り外します。次に、ブルドッグクランプで傷口を一時的に閉じます。虚血の持続時間は実験計画によるものです。マウスが人工呼吸器に接続され続けていることを確認します。</li>
</ol>4.再灌流
<ol><li>虚血の期間が終わったら、ブルドッグクランプを取り外し、リトラクターを再度挿入して切開を開き、心臓(特に結紮部位)を露出させます。</li>
	<li>スリップノットをほどき、PE-10チューブを取り外します。このステップで血流が回復したことを確認するために、20秒以内にピンクレッドに戻る色の変化を観察します。同時に、心電図を注意深く見てください:ST上昇の潜在的な溶解も再灌流を示唆しています。</li>
	<li>8-0のままその後のEvans-BlueおよびTTC染色のためのin situ 結紮。それ以外の場合は、このステップで縫合糸を取り除きます。</li>
	<li>リトラクターを取り外し、3番目と4番目の肋骨を4-0のナイロン縫合糸で縫合して切開部を閉じます。肺を傷つけないように注意してください。縫合糸の結び目を作りながら胸部を軽く押して、胸腔に閉じ込められている可能性のある空気を押し出します。</li>
	<li>連続縫合糸で筋肉層を閉じます。4-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。連続縫合糸と断続縫合糸は許容されます。</li>
</ol>5.術後のケア
<ol><li>麻酔からの回復の兆候、例えば尾やひげの動きがないかマウスを注意深く観察します。その後、マウスは通常、約150bpmの呼吸数で通常の呼吸パターンを再開します。チューブをゆっくりと取り外して、マウスを抜管します。</li>
	<li>マウスをさらに3〜5分間監視して、呼吸困難がないことを確認します。.</li>
	<li>マウスが呼吸を開始した後、100 μLのブプレノルフィン(0.1 mg / mL、s.c.)を投与します。.次の24時間、4〜6時間ごとに追加の用量を提供します。.追加の鎮痛剤としてイブプロフェンを0.2 mg / mL溶液として、手術の2日前と手術後≤7日間、飲料水に投与します。.</li>
	<li>マウスは麻酔後に低体温症になりやすいため、断熱ブランケットを使用してマウスを暖かく保ち、死亡リスクを減らします。</li>
</ol>6. 施術後のバリデーション
<ol><li>トロポニンT検査<ol><li>眼窩後神経叢から血液サンプルを採取し、遠心分離(3,000 × g、10分、室温)によって血清を分離します。</li>
		<li>血清20 μLを生理食塩水で100 μLに希釈し、トロポニン-T試験を行います。サンプルの残りは-80°Cで保管してください。</li>
		<li>製造元の指示に従って、市販のキットを使用してトロポニンT(cTnT)を検出します。</li>
	</ol></li>
	<li>心臓超音波検査 注:心臓超音波は、実験計画17,18に従って、手術前後のさまざまな段階での心機能および壁運動異常を評価するために使用されます。心室壁の厚さ、心室容積、心室腔の直径、駆出率、短軸短縮率などのさまざまなパラメータが測定されます。<ol><li>腹腔内注射により、ケタミン(80 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)でマウスに麻酔をかけます。</li>
		<li>電気カミソリで胸を剃る。毛皮除去クリームを使用し、均一にマッサージします。余分な抜けた毛皮をガーゼで拭きます。</li>
		<li>マウスをOTの上に置き、4本の手足を粘着テープで固定します。</li>
		<li>超音波プローブ(30 MHz)を胸骨に対して~30°の心臓の前部に置きます。この図のプローブは、心臓の長軸に位置合わせされています。超音波を Bモードに設定します。左心室、左心房、僧帽弁、上行大動脈がはっきりと識別できます。ビデオキャプチャを使用して、後続の分析用のデータを取得します。</li>
		<li>トランスデューサーを時計回りに90°回転させることで、乳頭筋の高さで胸骨傍短軸図を取得し、左右の心室をはっきりと検出します。次に、 B モードと Mモード を使用して、心機能と形態測定を評価します。</li>
		<li>超音波画像で対応する位置を指定して、左心室拡張末期直径 (Dd)、収縮末末直径 (Ds)、および心室中隔厚さを計算します。 注:機械は手動で左心室拡張末期容積(LVEDV)と収縮末期容積(LVESV)を計算します。また、FS = (Dd-Ds)/Dd × 100% および EF= (LVEDV-LVESV)/LVEDV × 100% の式を使用して、フラクショナル短縮 (FS) と駆出率 (EF) の値を計算します。5つの連続した心周期を選択し、それらの平均値を取得します。</li>
	</ol></li>
	<li>心筋梗塞の大きさの測定 注:Evans-Blue/TTC染色は、組織の生存率を評価できるため、梗塞のサイズを測定するために使用されます19。瘢痕が縮小するため、再灌流から72時間以内に染色することをお勧めします。このステップは、腹腔内注射により200 mg / kgのペントバルビタールナトリウムで動物を安楽死させた後に実行されます。<ol><li>ステップ2.2〜2.5の前の手順に従って、心臓を再度露出させます。次に、ステップ4.3で述べた縫合糸によって検証された最初の部位で、所望の再灌流期間の終わりにLADを再結紮します。</li>
		<li>大動脈をカニューレ挿入し、0.3 mLの1%エバンスブルー溶液で心臓を灌流します。非虚血領域の心筋は青色に染色されています。灌流後、ハサミで大動脈を切って心臓を速やかに取り出します。</li>
		<li>次に、心臓をKCl溶液(30 mM)で洗浄して、心臓の鼓動を止めます。周囲の脂肪組織を除去した後、-20°Cで≥4時間保存してください。</li>
		<li>鋭利なメスを使って、心臓を横方向に厚さ1mmの5枚に切ります。スライスを秤量し、2% TTCで37°Cで40分間インキュベートします。 注:インキュベーション後、梗塞領域は白色で画定されますが、非梗塞領域の生存組織は赤色のままです。</li>
		<li>スライスを4%ホルムアルデヒドで一晩固定します。 注意: このアクションにより、梗塞領域と非梗塞領域のコントラストが強調されます。また、スライスが縮小されます。</li>
		<li>スライスをデジタルカメラで撮影します。次に、グラフィックソフトウェアを使用して、リスク領域(AAR)、梗塞領域、および非虚血領域を計算します。 注:Evans-Blue / TTC二重染色後、青い領域は「正常」領域です。残りの領域(白と赤を含む)は「虚血リスク」領域であり、白い領域は心筋梗塞領域(IA)、赤い領域は虚血性(梗塞ではない)領域です。ハートスライスのサイズの不一致を考慮して、結果は重量に合わせて調整されます。 割り当てる： A1-A5 梗塞ゾーンの面積/心臓スライスの面積。 B1-B5 非梗塞ゾーンの面積/心臓スライスの面積。 W1-W5はハートスライスの重量です。 そうしたら： 心筋梗塞の総重量:W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5; 非梗塞性心筋の総重量:W1 × B1 + W2 × B2 + W3 × B3 + W4 × B4+ W5 × B5; AAR の総重量 = (W1 + W2 +W3 + W4 + W5) - (W1 × A1 + W2 × A2 + W3 × A3 + W4 × A4 + W5 × A5) 最終的に： 心筋虚血の面積は、左心室のAARの割合として計算されます。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63257/63257eq01v2.jpg"> 心筋梗塞の面積は、AARにおけるIAの割合として計算されます。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63257/63257eq02v2.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Sicard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Right+coronary+artery+ligation+in+mice%3A+A+novel+method+to+investigate+right+ventricular+dysfunction+and+biventricular+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Right coronary artery ligation in mice: A novel method to investigate right ventricular dysfunction and biventricular interaction.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 316 (3), 684-692 (2019).</li>
<li>Chen, J., Ceholski, D. K., Liang, L., Fish, K., Hajjar, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+in+coronary+artery+anatomy+affects+consistency+of+cardiac+damage+after+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Variability in coronary artery anatomy affects consistency of cardiac damage after myocardial infarction in mice.</a> American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 313 (2), 275-282 (2017).</li>
<li>Kato, R., Foex, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+protection+by+anesthetic+agents+against+ischemia-reperfusion+injury%3A+An+update+for+anesthesiologists%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Myocardial protection by anesthetic agents against ischemia-reperfusion injury: An update for anesthesiologists.</a> Canadian Journal of Anaesthesia. 49 (8), 777-791 (2002).</li>
</ol>

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

近年、臨床および科学研究におけるMIおよびMIRIのモデルの作成が急速に発展しています20,21。しかし、作用機序やMI/MIRIの改善方法など、解決しなければならない問題がまだいくつか残っています。ここでは、MIおよびMIRIのマウスモデルを確立するための修正プロトコルについて説明する。いくつかの重要なポイントを慎重に検討する必要があります。
1つ目のポイントは気管内挿管です。一部の手順6,9では、子宮頸部皮膚の切開、組織の分離、続いて胸骨舌筋の露出による気管の観察が含まれます。このようにして、研究者は気管へのチューブ挿入を視覚化できます。これは、呼吸困難のリスクを減らすための良いステップです。現在の方法では、研究者はイルミネーターの下で呼吸による声門の開閉をはっきりと視覚化し、チューブを気管に簡単に挿入することができます。したがって、子宮頸部切開...

急性心筋梗塞(AMI)は、世界的に一般的な心血管疾患であり、死亡率が高い1。技術の進歩により、AMI患者は早期かつ効果的な血行再建術を利用できるようになりました。一部の患者では、これらの治療の後、心筋虚血再灌流障害(MIRI)が発生する可能性があります2。したがって、行動のメカニズムとMI / MIRIを改善する方法を理解することは非常に重要です。マウスは、低コストで育種期間が短く、遺伝子改変が容易であることから、モデルとして広く用いられています3。学者は、動物4,5,6,7,8,9のMIRIとMIIをモデル化するためのさまざまな方法を開発しました。この戦略は研究を促進しますが、採用されている基準と方法が異なるため、研究チーム間で結果の解釈が複雑になります。
マウスでは、心筋梗塞はイソプロテレノール10、凍結傷害11,12、または焼灼13によって誘導されている。心筋梗塞はイソプロテレノールによって容易に誘発できますが、病態生理学的プロセスは臨床心筋梗塞とは異なります。 凍結傷害誘発性心筋梗塞は一貫性が悪く、左前下行冠動脈(LAD)の周囲に過度の心筋損傷を誘発し、不整脈を誘発しやすい可能性があります。焼灼誘発性心筋梗塞は、心筋梗塞の自然なプロセスとはかなり異なり、灼熱部位の炎症反応はより激しいです。さらに、外科的アプローチには技術的な問題があります。さらに、バルーンブロッキングまたは塞栓術または介入技術による血栓症法を使用して、ミニブタのMIモデルを開発しているラボ14がいくつかあります。これらの方法はすべて冠動脈閉塞を直接引き起こす可能性がありますが、冠動脈造影装置が必要であり、何よりもマウス冠動脈が細すぎるため、これらの手術は実用的ではありません。MIRIの場合、異なるモデル間の違いは、マスク/マイクロマニピュレーションを使用するかどうかなど、非常に控えめでした5,6。
ここでは、以前に発表された方法4,5,6,7,8,9,15から採用された、MIおよびMIRIモデルを誘導できる簡単で信頼性の高い方法が説明されています。この方法は、結紮によるLADの直接遮断により、病態生理学的プロセスをシミュレートできます。さらに、結紮を緩和することで、このモデルは再灌流損傷をシミュレートすることもできます。このプロトコルでは、解剖顕微鏡がLADの視覚化に使用されます。そうすれば、研究者はLADを容易に特定することができます。その後、LADの正確な結紮は、再現性のある予測可能な閉塞と心室虚血につながります。また、顕微鏡で観察したLADの色変化に加え、虚血や再灌流の確認にも心電図(ECG)の変化を用いることができます。この戦略により、手術期間が短縮され、外科的合併症のリスクが低くなり、必要な実験用マウスの数が少なくなります。トロポニン-T検査、心臓超音波検査、および塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)染色の方法についても説明します。全体として、このプロトコルはMI/MIRメカニズムの研究や創薬に有用です。

<table><tbody><tr><td>0.9%塩化ナトリウム溶液</td><td>ケルン工業グループ、中国</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>4%パラホルムアルデヒド固定溶液</td><td>Servicebio、中国</td><td>G1101-4-0</td><td></td></tr><tr><td>シルク縫合</td>糸<td>上海浦東金環医療製品、中国</td><td>C412-8-0</td><td></td></tr><tr><td>縫合</td>糸<td>上海浦東金環医療製品、中国</td><td>H801-Buprenorphine</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IsoReag、中国</td><td>IR-11190</td><td>-</td></tr><tr><td>カメラ</td><td>キヤノン、日本</td><td>EOS 80D</td><td>-</td></tr><tr><td>脱毛クリーム</td><td>Veet、フランス</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Elecsys Troponin T hs STAT</td><td>Roche、ドイツ</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Electrochemical luminescence immunoanalyzer</td><td>Roche、ドイツ</td><td>Elecsys 2010-Evans</td><td></td></tr> <tr><td>blue</td><td>Sigma、アメリカ</td><td>E2129</td><td>-</td></tr><tr><td>アイハサミ</td><td>上海医療機器、中国</td><td>JC2303</td><td>-</td></tr><tr><td>止血鉗子</td><td>上海医療機器、中国</td><td>J31020</td><td>-</td></tr><tr><td>高周波生体内イメージングシステム</td><td>Visualsonics、カナダ</td><td>Vevo2100</td><td>-</td></tr><tr><td>イブプロフェン</td><td>PerFeMiKer、中国</td><td>CLS-12921</td><td>-</td></tr><tr><td>静脈内カテーテル</td><td>Introcan、ドイツ</td><td>4254090B</td><td>-</td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>シグマ-アルドリッチ、アメリカ</td><td>&nbsp;K2753</td> <td>-</td></tr> <tr><td>医療用アルコール</td><td>恵昌 、中国</td><td></td> <td>-</td></tr> <tr><td>マイクロニードルホルダー</td><td>上海医療機器、中国</td><td>WA2040</td> <td>-</td></tr> <tr><td>顕微鏡せん断上海</td><td>医療機器、中国</td><td>WA1040</td> <td>-</td></tr> <tr><td>顕微手術鉗子</td><td>上海医療機器、中国</td><td>WA3020</td> <td>-</td></tr> <tr><td>マウス心電計</td><td>テックマン、中国</td><td>BL-420F</td><td>-</td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>上海医療機器、中国</td><td>JC3202</td><td>-</td></tr><tr><td>操作床</td><td>チコ、中国</td><td>ZK-HJPT-PE-10</td><td></td></tr><tr><td>チューブ</td><td>華美、中国</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>ペントバルビター</td><td>ルメルク、アメリカ</td><td>1030001</td><td></td></tr><tr><td>-げっ歯類人工呼吸器</td><td>上海アルコットバイオテクノロジー、中国</td><td>ALC-V8S-P</td><td>-</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Aomei工業、中国</td><td>SZM0745-STL3-T3</td><td>-</td></tr><tr><td>外科用サーモスタット加熱パッド</td><td>Globalebio、中国</td><td>GE0-20W-Triphenyltetrazolium</td><td></td></tr> <tr><td>chloride</td><td>Servicebio、中国</td><td>G1017</td><td>-</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>Huamaike生化学およびライフサイエンス研究製品、中国</td><td>323004</td><td>-</td></tr></tbody></table>

マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

急性心筋梗塞は、死亡率の高い一般的な心血管疾患です。心筋再灌流障害は、心臓リフローの有益な効果を打ち消し、二次的な心筋障害を誘発する可能性があります。心筋梗塞と心筋虚血再灌流傷害のシンプルで再現性のあるモデルは、研究者にとって優れたツールです。ここでは、マイクロマニピュレーションによる左前下行冠動脈(LAD)の精密結紮により、心筋梗塞(MI)モデルとMIRIを作成するカスタマイズ可能な方法について説明します。LADの正確で再現性のある結紮位置決めは、心臓損傷に対して一貫した結果を得るのに役立ちます。ST セグメントの変更は、モデルの精度を特定するのに役立ちます。心筋トロポニンT(cTnT)の血清レベルを使用して心筋損傷を評価し、心臓超音波を使用して心筋収縮機能を評価し、エバンスブルー/トリフェニルテトラゾリウムクロリド染色を使用して梗塞のサイズを測定します。一般に、このプロトコルは処置の持続期間を短縮し、制御可能な梗塞のサイズを保障し、そしてマウスの生存を改善する。

実験ワークフローを 図1Aに示します。研究者は、研究開始時に実験計画に従って時間ノードをスケジュールできます。LADライゲーションの期間は、研究目的によって異なります。MIの場合、研究は再灌流ステップを無視できます。心臓超音波検査は非侵襲的であるため、研究のさまざまな段階で利用できますが、Evans-Blue/TTC染色はマウスを犠牲にした場合にのみ実行できます。線維化や心室リモデリングに着目した研究では、観察時間がはるかに長くなります。
気管内挿管、皮膚切開、開胸術、LAD同定、LAD結紮から再灌流までの実験プロセスの一部に関する典型的な画像を 図2Aに示します。心筋虚血と再灌流を検証するために、結紮後のST上昇とスリップノットを解いたときのST上昇の溶解を示す代表的な心電図画像を 図2Bに示します。
すべてのマウスから血液サンプルを採取した後、梗...

ここでは、マイクロマニピュレーションによる左前下行冠動脈の精密結紮により、マウスの心筋梗塞または心筋虚血再灌流障害を誘発できる簡便で再現性のある方法について述べる。

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

この研究では、マイクロマニピュレーションによる左前下行冠動脈の精密結紮により、Miro で心筋機能モデルを作成するカスタマイズ可能な方法について説明します。このプロトコルは、処置期間を短縮し、制御可能な梗塞サイズを確保し、マウスの生存率を向上させます。外科的処置中、摂氏37度に事前に温められた加熱パッドを備えた長方形のOTを使用してください。手順の前に、紫外線と70%アルコールでボードを消毒します。まず、目が過熱しないように、頭の下にガーゼを敷いて仰臥位でOTにマウスを置きます。眼科用軟膏を目に塗って、乾燥を防ぎます。胸部に毛皮除去クリームを使用し、滅菌綿棒で1分間均一にマッサージします。余分な毛をガーゼで拭きます。ポビドンヨウ素とそれに続く70%アルコールを使用してその領域をきれいにし、胸部をガーゼで覆います。上切歯の下に4-O縫合糸を使用し、アンカーポイントに固定して、口をわずかに開いたままにし、カニューレ挿入を容易にします。テールを引っ張って体をまっすぐに保ち、テープを使用してOTに固定します。4本の手足をテープで固定し、アンカーポイントで締めます。呼吸障害を避けるために、前肢を伸ばしすぎないでください。鉗子を使用して顎を開き、舌を持ち上げます。次に、イルミネーターを使用して喉と声門を視覚化します。鈍い切り下げ針が付いた22ゲージのカニューレを口から喉の約1センチ下の気管にそっと挿入します。片手で舌を持ち、鈍い鉗子で少し上に動かします。同時にもう一方の手を使って、チューブを気管にそっと挿入します。チューブを食道に挿入しないように注意してください。針を慎重に取り外します。人工呼吸器に接続する前に、チューブを水中に入れて気泡が形成されるかどうかで挿管を確認してください。気管内チューブを毎分120に設定し、一回換気量を250マイクロリットルに調整した人工呼吸器に接続します。両側対称の胸部拡張をチェックして、挿管を確認します。次に、OTへの接続をテープで固定して、脱落を防ぎます。前足に心電図電極を置き、心電図レコーダーに接続します。手順全体を通して心臓電気生理学を監視します。胸部のガーゼを取り除きます。70%アルコールで3回のスクラブサイクルを使用して切開部を消毒します。手術部位の汚染を減らすために、手術野に穴を開けた滅菌手術用ドレープでマウスを覆います。メスで斜めの皮膚を切開した後、皮下組織の鈍い解剖を行って肋骨を露出させます。血管、肋骨、肺を傷つけないように注意してください。滅菌綿アプリケーターを使用して出血を止めます。3番目の肋間腔を特定し、約6〜8ミリメートルの切開を行います。次に、肋間腔の組織の鈍い解剖を行うことにより、胸腔を開きます。胸部内動脈を傷つけないように注意してください。鉗子を使用して肋間腔を広げます。滅菌済みの自家製リトラクターを胸郭に挿入し、引き戻して切開部を幅約6ミリメートルに広げます。リトラクターを輪ゴムでOTに取り付けます。周囲の組織を慎重に取り除き、心臓を完全に露出させます。心臓を傷つけることなく、湾曲した鉗子で心膜を静かに引き抜きます。解剖顕微鏡を使用し、LADの可視化に焦点を絞った適切な光を当てます。選択した結紮位置の下の部位を軽く押してLADを一時的に拡大し、LADを再確認します。解剖顕微鏡の下で、先細りの針を使用して8-0を通過させますLADの下の絹の合字。針が左心室に入るのに十分な深さではなく、LADの損傷を避けるために浅すぎないことを確認してください。結紮糸をゆるい二重の結び目で結びます。2〜3ミリメートルのPE-10チューブを動脈に平行なループに入れます。結紮ループが動脈とチューブの周りに来るまで、ゆっくりと締めます。次に、ループをスリップノットで固定します。過度の締め付け圧力で心筋壁を傷つけないように注意してください。結紮後の左心室前壁の蒼白な着色は、LADの血流の停止を確認します。永久結紮が必要な場合は、テキスト原稿に記載されているとおりに進めてください。切開部からリトラクターを取り外します。次に、ブルドッグクランプで傷口を一時的に閉じます。マウスが人工呼吸器に接続され続けていることを確認します。虚血の期間が終わったら、ブルドッグクランプを取り外し、リトラクターを挿入して切開を開き、心臓と結紮部位を露出させます。スリップノットをほどき、PE-10チューブを取り外します。淡い色からピンクレッドへの変化は、血流の回復を確認します。同時に、再灌流を検出するには、ECGを観察してST上昇の溶解の可能性を確認します。8-0のままその後のエバンスブルーおよびTTC染色を行う場合は、その場で結紮します。それ以外の場合は、このステップで縫合糸を取り除きます。リトラクターを取り外し、3番目と4番目の肋骨を4-Oシルク縫合糸で縫合して切開部を閉じます。肺を傷つけないように注意してください。縫合糸の結び目を作りながら胸をそっと押して、胸腔に閉じ込められている可能性のある空気を押し出します。連続した4-Oシルク縫合糸で筋肉層を閉じます。実験プロセスの標準画像は、気管内挿管、皮膚切開、開胸術、LADの同定、結紮から再灌流まで取得されました。代表的な心電図画像は、結紮後に有意なST上昇を伴う心筋虚血および再灌流を検証した。そして、スリップノットを解いた後のSTエレベーションの溶解。開胸術の前に、気道を開いたままにしておくことが非常に重要であり、最も重要なことは、LADがしっかりと結紮され、損傷を受けないようにすることです。この手順の後には、心機能を評価するための心エコー検査と、心筋損傷を評価するためのTTCが続きます。

induction-myocardial-infarction-myocardial-ischemia-reperfusion

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

外科手術による外傷、炎症反応を誘導する。サイトカイン、内因性リガンドは、虚血再灌流後に心筋梗塞サイズを調節することが知られています。我々は、開胸の影響を最小限に抑えるためにぶら下がって重みを使用してマウスの虚血再灌流の変更されたクローズド·胸のモデルを提示します。...

心筋虚血再灌流障害のマウスクローズド胸モデル

我々は、再現性を高めるために左前下行枝（LAD）に結紮の位置決めにおいてより明確にするために可能にするマウスモデルにおける心筋梗塞（MI）をシミュレートするための実験的虚血/再灌流（I / R）傷害を誘導するための外科的方法を紹介マウスでのMIの実験の。...

左前下の動脈の結紮を通して心筋虚血再灌流傷害のマウスモデル

最小限の侵襲操作によるマウスの心筋梗塞の再現性の高いモデルが記述されています。モデル化が容易に行えるため、高い再現性と生存率を実現しています。したがって、記載されているモデルは、3Rの原則(Replacement(置換)、Refinement(改良)、Reduction(リペアメント)、Refinement(リファインメント)、Reduction(リダクション)の要求に応じて、必要な動物の数を減らします。...

マウスにおける心筋梗塞を誘発する低侵襲手術手順

私たちは、シリコーンコーティング縫合糸を使用して、中大脳動脈の閉塞によって誘発される脳卒中のマウスモデルを記述します。このプロトコルは、永久的な閉塞または一時的な虚血を誘発し、続いて再灌流を誘発するために適用することができます。...

梗塞エリアの中央動脈閉塞技術と可視化を使用したマウスにおける虚血性脳卒中および虚血 - 再灌流の誘導

マウスの心筋虚血/再灌流手術中、閉塞結紮の正しい配置は、通常、心筋蒼白の目に見える観察によって確認されます。本明細書では、観察された心筋蒼白を補うために、虚血および再灌流を心電図で確認する方法が、雄のC57Bl/6マウスにおいて実証される。...

表面パッド心電図を使用したマウスにおける心筋虚血および再灌流障害の確認

本明細書では、マウスにおける左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを達成する方法を示す外科的処置について説明する。このモデルは、心筋梗塞の病態生理学とそれに付着した生物学的プロセスを調べるために高い関連性がある。...

左前皮下冠動脈の永久的なライゲーションを用いたマウス心筋梗塞モデル

この記事では、マウスの心筋凍結傷害後の心臓リモデリングを研究するモデルを示す。...

マウスの心筋梗塞を研究する凍結傷害モデル

適切な麻酔下で、マウスの心臓を肋間腔から外在化し、ほとんどの検査室で容易に入手できる材料を使用して左前下行動脈(LAD)を結紮することにより、心筋梗塞の誘発に成功しました。...

マウスにおける心筋梗塞の誘導のための改良簡便法

ここに提示されるのは、マウスの左冠状動脈の永久結紮のための外科的処置である。このモデルは、心筋梗塞後の病態生理学および関連する炎症反応を調査するために使用できます。...

左冠動脈結紮術:心筋梗塞の外科用マウスモデル

ここでは、C57BL/6Jマウスの経頭蓋電気凝固術による遠位中大脳動脈閉塞(dMCAO)モデルを確立し、その後の神経学的行動と組織病理学的特徴を評価するためのプロトコルを提示します。...

遠位中動脈閉塞法を用いたマウスにおける急性虚血性脳卒中の誘発

このプロトコルは、前房カニューレ挿入と眼圧上昇を介して網膜虚血を誘発することにより、マウスの眼の網膜虚血再灌流損傷をモデル化し、続いて眼圧の正常化により再灌流を開始します。...

マウス眼モデルにおける網膜虚血-再灌流障害の誘導

学ぶマウス心筋梗塞および虚血再灌流障害の誘発法。前下行枝冠動脈の精密結紮により、梗塞サイズを制御し、手術時間を短縮して生存率を向上させる再現性の高い心血管研究モデルです。

マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発

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