加齢性腎障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応評価
2022年4月29日
加齢性腎機能障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現を定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を提示する。
このqRT-PCR法は、加齢性腎障害などの状態のマウスの血清中のマイクロRNA発現プロファイリングに関連する質問に対処することができます。この技術は、時間を節約し、技術的なエラーを防ぐ簡単なプロセスによって、高精度かつ高感度でマイクロRNA発現の検出を可能にします。はじめに、ピンセットと外科用ハサミを使用して腹部の皮膚を切開します。
腹膜の筋肉を膀胱から肋骨の左下端まで切ります。ピンセットを使用して腹膜を持ち上げ、外科用ハサミで上端を横方向に切開します。肋骨の下端に沿って切開を続けます。
PBSで湿らせた綿棒2本を使用して、下大静脈を特定します。1ミリリットルの注射器に取り付けられた30Gの針を下大静脈に挿入し、注射器を引きます。溶血を避けるためにゆっくりと針を引き抜きます。
血液をヘパリンを含む1ミリリットルのスピッツチューブに移し、反転させて混合します。スピッツチューブを室温で3000倍Gで10分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。
200マイクロリットルの血清サンプルを取り、1, 000マイクロリットルのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加えます。混合物を5秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートする。200マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを15回反転させて混合する。
サンプルを室温で3分間インキュベートし、続いて遠心分離します。ペレットを乱すことなく、上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。450マイクロリットルの100%エタノールを加え、チューブを5秒間ボルテックスします。
次に、700マイクロリットルのサンプルをメンブレンアンカースピンカラムにロードし、遠心分離します。フロースルーを廃棄し、キットに含まれている700マイクロリットルの洗浄バッファー1を追加します。再度遠心分離し、フロースルーを廃棄する。
500マイクロリットルの洗浄バッファー2で洗浄を繰り返し、微量の塩分を除去します。500マイクロリットルの80%エタノールを加え、遠心分離機で、収集チューブからのフロースルーを廃棄します。スピンカラムを再度遠心分離し、カラムを新しい1.5ミリリットルの収集チューブに移します。
次に、14マイクロリットルのRNaseフリー水を加え、室温で5分間インキュベートします。カラムを室温で15000倍Gで1分間再度スピンさせる。マスターミックス溶液を調製し、8ウェルストリップチューブにウェルあたり8マイクロリットルを追加します。
抽出したトータルRNAを各チューブに12マイクロリットル加え、室温で2000倍Gで15秒間チューブを遠心分離する。チューブをサーマルサイクラーに入れ、インキュベーションを開始してcDNAを合成します。インキュベーション後、cDNAを新しいマイクロ遠心チューブに移します。
cDNAを蒸留水で10倍に希釈します。その後ボルテックス、室温で2000倍Gで5秒間遠心分離を行った。マイクロ遠心チューブ内で、テキストプロトコルに記載されているようにマスターミックス溶液を調製し、溶液をボルテックスします。
96ウェルプレートの各ウェルに22.5マイクロリットルのアリコートを加え、続いて2.5マイクロリットルのcDNAを加えます。粘着フィルムを使用してプレートを密封し、プレートを1000回G.で30秒間遠心分離します プレートをリアルタイムPCRシステムに入れます。実験の名前を指定して設定を変更します。
次に、実験タイプとして96ウェル0.2ミリリットル、定量方法として比較CT、システム実行モードとして標準、およびターゲット配列を検出するための試薬としてSYBR Green試薬を選択します。各ウェルのサンプルとターゲット miRNA の名前を指定します。重複サンプルを割り当て、参照サンプルと内在性コントロールを選択し、パッシブリファレンスとして使用する色素にはなしを選択します。
試薬のクロスコンタミネーションを排除するには、陰性の逆転写酵素とmiRNA発現の非テンプレートコントロールを設定します。次に、反応量を20マイクロリットルに設定し、PCRサイクル条件を摂氏95度で15分間設定し、次に摂氏94度で15秒間40サイクル変性し、摂氏55度で30秒間アニーリングし、摂氏70度で30秒間伸長します。プロセスが完了したら、分析をクリックしてqRT-PCRデータを分析します。
プログラムによって自動的に選択された閾値線が各ウェルに適していることを確認します。各サンプルで分析された内在性コントロールおよび標的miRNAの閾値サイクル値を確認します。増幅曲線と閾値線の交点によってCT値を決定する。
加齢腎障害モデルのmiRNA qRT-PCRデータは、SAMR1対照マウスと比較して、SAMP1実験マウスではmiRNA-7219-5pの腎臓レベルが有意に増加し、miRNA-7218-5pの腎臓レベルが低下したことを示しました。miRNA-223-3pの発現レベルは、いずれの株においても変化しなかった。miRNA-7219-5pおよびmiRNA-7218-5pの両方の血清レベルはSAMP1マウスで有意に増加したが、miRNA-223-3pのレベルは変化しなかった。
下大静脈に針を挿入し、血管を貫通せずに血液を抽出する必要があります。この方法は、幅広い病的状態に対するマウス血清中のマイクロRNA発現プロファイリングにおける重要な質問に答えるために使用できます。
概要
本研究では、加齢に伴う腎機能障害を有するマウスの腎臓および血清におけるmicroRNA発現を評価するための定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）法を提示します。この手法により、microRNA発現を高精度かつ高感度に検出することが可能となり、この分野の研究を促進します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- マイクロRNA研究
背景
- マイクロRNAは遺伝子調節において重要な役割を果たしています。
- 加齢に伴う腎機能障害は、マイクロRNAの発現に影響を与えます。
- マイクロRNAプロファイルを理解することで、腎疾患に関する知見を得ることができます。
- qRT-PCRは、RNA発現を分析するために広く用いられている手法です。
研究目的
- 腎機能障害を有するマウスにおけるmicroRNA発現を評価すること。
- 血清および腎臓サンプルに対する信頼性の高いqRT-PCR法を確立すること。
- 加齢に伴う腎機能の変化に関連する特定のmicroRNAを同定すること。
使用した方法
- マウスからの血清および腎臓サンプルの採取。
- フェノール/グアニジンベースの溶解試薬を用いた全RNAの抽出。
- cDNA合成およびそれに続くqRT-PCRによるmicroRNAの定量。
- qRT-PCRデータの解析による標的microRNAの発現レベルの決定。
主な結果
- SAMP1マウスでは、腎臓におけるmiRNA-7219-5pレベルが有意に増加した。
- SAMP1マウスでは、腎臓におけるmiRNA-7218-5pレベルが減少した。
- 血清中のmiRNA-7219-5pおよびmiRNA-7218-5pレベルは大幅に増加した。
- miRNA-223-3pレベルは、両系統において変化しなかった。
結論
- qRT-PCR法を用いることで、腎機能障害におけるmicroRNAの発現プロファイルを効果的に解析できる。
- 特定のmicroRNAは、加齢に伴う腎臓の変化に関連している。
- 本手法は、さまざまな病理学的状態の調査に適用可能である。
よくある質問
産業上の重要性
腎臓および血清における正確なmicroRNA発現プロファイリングにより、加齢に伴う腎機能障害メカニズムの早期検出が可能となり、前臨床モデルにおけるターゲットバリデーションを支援します。このqRT-PCR法は、定量的で再現性の高いデータを提供し、バイオマーカー探索パイプラインにおける予測の信頼性を向上させます。本手法は、トランスレーショナル腎臓研究におけるmiRNA解析の標準化という重要な課題を解決するものです。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値：腎臓および血清におけるmiRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pの発現変化を定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値：マウスの生物学的試料からmiRNAを抽出および評価するための信頼性の高い方法を提供し、技術的なばらつきを低減する。
- 戦略的価値：加齢に伴う機能低下モデルにおけるmiRNAの調節不全パターンを明らかにすることで、腎臓ターゲットの生物学的リスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： qRT-PCRから定量的なCT値を算出し、異なるサンプル間でのmiRNA発現の標準化された測定を可能にする。
- 運用的価値： 血清および腎臓からのmiRNA抽出、cDNA合成、および増幅のための再現性のあるワークフローを確立する。
- 戦略的価値： 腎疾患モデルにおけるmiRNA介在性パスウェイを標的としたスクリーニングキャンペーンに向けたアッセイの準備を促進する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値： 腎臓と血清のmiRNAレベルの関係を明確にし、組織から生物学的流体へのバイオマーカーのトランスレーションを裏付ける。
- 実用的価値： 腎機能障害の前臨床モデルにおけるmiRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pの経時的なモニタリングを可能にする。
- 戦略的価値： 加齢に伴う腎臓の変化に関する機序的な洞察を提供することで、リスク調整後の進展決定を支援する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、標的仮説の検証から前臨床検証に至るディスカバリー・コンティニュアム（発見の連続体）に適合するものであり、特に腎線維化や老化に関連するパスウェイに有用です。
- 探索生物学： 対照群と機能不全マウス系統の間でmiRNA発現の有意な変化を検出することにより、仮説検証を支援します。
- スクリーニング： 再現性のある定量的出力（CT値）を提供し、実験条件間でのmiRNAレベルの比較を可能にします。
- 分析： 内因性コントロールを用いた比較CT法により発現データを標準化し、サンプル間での信頼性の高い比較を保証します。
- トランスレーショナルリサーチ： 腎臓のmiRNA変化を検出可能な血清変化と結びつけ、非侵襲的なバイオマーカーの開発を支援します。
- エンタープライズでの再利用： 複数の腎疾患モデルで再利用可能な、miRNA定量の標準化されたプロトコルを確立します。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値：miRNA発現変化の精密かつ高感度な検出により、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値：RNA抽出およびqRT-PCRの工程を明確に定義することで、研究室間の再現性と標準化を強化する。
- 戦略的価値：miRNAが駆動する腎臓経路に関するメカニズム的なリスク低減データを提供し、go/no-go判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響：前臨床モデルにおける一貫したmiRNAの調節不全に基づき、リスクに基づいたターゲットの優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- RNAの取り扱い、逆転写、およびqRT-PCR装置の操作に関する専門知識が必要です。
- フェノール/グアニジン溶解試薬、スピンカラム、およびSYBR Green検出が可能なリアルタイムPCRシステムへのアクセスに依存します。
- 比較CT解析を行うため、チーム間で内在性コントロールおよび参照サンプルの標準化を行う必要があります。
- 異なるマウス系統やサンプル量にプロトコルを適用する場合、適応上の検討事項が含まれます。
- 溶血を避けるための慎重な採血や、抽出時の適切なインキュベーション時間など、実務上の制限事項があります。
