Name: 加齢性腎障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学ぶ qRT-PCR法による加齢性腎障害マウスの腎臓および血清中マイクロRNA発現評価。高感度かつ正確な検出技術で、miRNA-7219-5pやmiRNA-7218-5pの変動を解析し、腎疾患の病態理解に貢献します。

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<ol><li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+regulatory+role+of+lncRNA-miRNA-mRNA+axis+in+cardiovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).</li>
<li>Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA-106b-5p+in+human+cancers%3A+diverse+functions+and+promising+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+and+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211(2020).</li>
<li>Lu, T. X., Rothenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">MicroRNA.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).</li>
<li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+breast+cancer%3A+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+and+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).</li>
<li>Bjorkman, S., Taylor, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+endometriosis%3A+biological+function+and+emerging+biomarker+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates.</a> Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).</li>
<li>Zhou, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+and+circRNA+expression+patterns+in+mouse+brain+during+toxoplasmosis+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development.</a> BMC Genomics. 21 (1), 46(2020).</li>
<li>Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulated+miRNA-26a-5p+induces+the+apoptosis+of+endothelial+cells+in+coronary+heart+disease+by+inhibiting+PI3K%2FAKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Review+for+Medical+and+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).</li>
<li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li>
<li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic%2C+drug-induced%2C+and+inflammatory+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li>
<li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research. 237, 31-52 (2021).</li>
<li>Latorre Luque, J. Relevance of the epigenetic regulation exercised by hepatic microRNAs in the fatty liver arena: from the bedside to the bench. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://hdl.handle.net/10803/671499">http://hdl.handle.net/10803/671499</a> (2019).</li>
<li>Mastropasqua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+microRNA+levels+in+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Serum microRNA levels in diabetes mellitus.</a> Diagnostics (Basel). 11 (2), 284(2021).</li>
<li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+detection+in+prostate+tumors+by+quantitative+real-time+PCR+%28qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874(2012).</li>
<li>Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+analysis+of+microRNA+using+a+specific+extension+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence.</a> Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).</li>
<li>Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+changes+With+the+aging+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Chronic+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">Structural and functional changes With the aging kidney.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).</li>
<li>Weinstein, J. R., Anderson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+kidney%3A+physiological+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Chronic+Kidney+Disease%22%5BJournal%5D)">The aging kidney: physiological changes.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).</li>
<li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MIQE+guidelines%3A+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+array-based+gene+expression+profiles+by+real-time+%28kinetic%29+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).</li>
<li>Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+quantitative+RT-PCR+array+in+miRNA+expression+profiling+and+comparison+with+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis.</a> BMC Genomics. 10, 407(2009).</li>
<li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate.</a> BMC Genomics. 6, 59(2005).</li>
<li>Petriella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+profiling+in+serum+and+tissue+samples+to+assess+noninvasive+biomarkers+for+NSCLC+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biology%22%5BJournal%5D)">miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome.</a> Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).</li>
<li>Skrzypa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA-146a-5p+is+upregulated+in+serum+and+cartilage+samples+of+patients+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Polski+Przeglad+Chirurgiczny%22%5BJournal%5D)">miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis.</a> Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).</li>
<li>Farzanehpour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+and+tissue+miRNAs%3A+potential+biomarkers+for+the+diagnosis+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer.</a> Journal of Virology Journal. 16 (1), 116(2019).</li>
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著者は、利益相反がないことを宣言します。

標的miRNAの発現レベルは、qRT−PCRを用いた上述のプロトコルによって首尾よく決定された。抽出されたmiRNAの評価は、意味のあるqRT-PCRデータを得るための重要なステップです。qRT-PCRを実行する前にmiRNAの適切な品質を確認するには、分光光度法を使用して、260 nmの吸光度と280 nmの吸光度の比を決定する必要があります。qRT-PCRが予想される長さと融解温度の単一のPCR増幅を提供しない場合、またはモノモーダル融解曲線を提供する場合、DNA汚染が発生する可能性があり、および/または反応プレートの各ウェルにプライマーダイマーが存在する可能性があります。
MiRNA発現レベルは、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、リボヌクレアーゼ保護アッセイなど、qRT-PCR以外のいくつかの方法で評価できます。ただし、qRT-PCR法は、ノーザンブロッティングおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイに必要なサンプル量よりも少ないサンプル量を必要とする、高感度、正確、単純、かつ再現性のある手順です19。マイクロアレイは数万個のmiRNAの発現を同時に測定できるため、候補となるmiRNAマーカーの同定に使用できます。マイクロアレイデータはまた、qRT−PCR20によって得られたデータと高い全体的な相関を示す。しかし、異なる研究で得られたマイクロアレイデータを比較するための最適な方法論に関してはコンセンサスに達していません21。
血清miRNAの評価には以下のような特徴があります。まず、血清の採取が容易であり、血清miRNAは凍結融解、温度、酸に対して安定であるため、miRNAは優れたバイオマーカーになり得ます。第二に、種間のmiRNAの高い相同性があり、動物実験の結果はヒトに容易に外挿されます。第三に、血清miRNAは治療薬としての可能性を示しています3。いくつかの研究はまた、臓器におけるmiRNAの発現レベルが血清中のmiRNAと相関していることを実証している22,23,24。本試験において、miRNA-223-3pは、腎臓レベルがSAMR1マウスとSAMP1マウスとの間に有意差を示さなかったが、血清中にも系統間有意差を示さなかった。対照的に、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pは、腎臓レベルがSAMR1マウスとSAMP1マウスの間で有意差を示したが、血清中にかなりの系統間差異を示した。
このプロトコルには、次の制限があります。第一に、その有用性は肝臓や肺などの他の臓器で検証されておらず、第二に、ラット、イヌ、ブタなどの他の実験動物ではテストされていません。いくつかの研究グループは、qRT-PCRによるmiRNAの精製と検出にこのプロトコルを使用し、このプロトコルが組織および血清からの高品質のRNAの精製を可能にすることを報告しました13,14,22,23,24。この方法は、miRNA13、14、22、23、24の発現を検出するための高い精度および感度を有することが実証されている。本研究の結果は、このプロトコルがマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現を首尾よく検出できることを示しています。したがって、このプロトコルを使用して、さまざまな病状を持つマウスの血清および腎臓miRNA発現プロファイルを決定することができます。プロトコルがシンプルなため、多数のサンプルを同時に処理できます。腎臓の様々な病的状態における多くのmiRNAの発現の分析は、したがって、本明細書に記載のプロトコールを使用することができる。
覚えておくべきプロトコルの特定の側面があります。室温で起こる精製されたmiRNAの分解を避けるために、miRNAは氷上に保たれなければなりません。腎臓サンプルは、溶解試薬に完全に溶解するまで均質化する必要があります。マウス腎臓には、溶解試薬に不溶性の結合組織が大量に含まれているため、さらなる均質化にはカラムシュレッダーが必要です。さらに、適切な内因性コントロールmiRNA(サンプル間で安定した発現を有する)は、qRT-PCR実験のセットアップ全体を通して検証する必要があります。これは、このプロトコルの実行中のさまざまな物質の干渉が内因性コントロールmiRNAの発現レベルを変化させ、結果を損なう可能性があるためです。結論として、この論文は、加齢性腎機能障害を有するマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現の検出、精製、および評価のためのqRT-PCRプロトコルについて述べる。

生理機能と疾患(炎症、線維症、代謝障害、がんなど)の両方で重要な役割を果たす様々なmRNAの発現は、mRNA1の分解を引き起こして転写を阻害する短いノンコーディングRNAであるmiRNAによって制御されていることが知られています。したがって、特定のmiRNAがさまざまな疾患の新しい候補バイオマーカーおよび/または治療標的として役立つ可能性があります2,3,4,5。さまざまなマウスの臓器や組織(脳6、心臓7、肺8、肝臓9、腎臓10など)におけるmiRNA発現プロファイルに関する研究が行われています。しかし、加齢依存性腎障害を有するマウスの腎臓または血清中のmiRNAを抽出および評価するための標準的または確立された方法はありません。
そこで、加齢依存性腎機能障害を有するマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現を確実に精製および検出するために使用できるプロトコルを確立しました。プロトコルには6つの主要なステップがあります:(1)50週齢のSAMR1オスマウスとSAMP1オスマウスの両方の準備。(2)両系統のマウスの下大静脈から血液試料を抽出し、その後ヘパリンを含むスピッツ管を使用し、続いて遠心分離して、血清試料を得る工程;(3)マウスからの腎臓サンプル抽出-シリコンホモジナイザーを使用して腎臓サンプルを個別にホモジナイズし、サンプルをマイクロ遠心スピンカラム11上の生体高分子細断システムに移します。(4)シリカ膜ベースのスピンカラム12を用いた血清試料からのトータルRNA(miRNA含有)抽出、およびシリカ膜ベースのスピンカラム11を用いた腎臓サンプルからのmiRNAを含む全RNA抽出;(5)逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびオリゴdTプライマーを用いた全RNAからの相補的DNA(cDNA)の合成13,14;(6)最後に、qRT-PCRおよびインターカレーティング色素を用いたmiRNA発現の測定13、14。
この新しいプロトコルは、さまざまな種類の組織でmiRNAを抽出して評価することに成功した研究に基づいていました11,12,13。プロトコルのバイオポリマーシュレッダーシステムは、組織から高品質のトータルRNAを精製できることが実証されました11。インターカレーティング色素を用いたqRT-PCRによるmiRNA発現の評価に使用されるこのプロトコルの側面の精度と感度は確立されており13,14、例えば、抽出された全RNAからの逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびoligo-dTプライマーによるcDNA合成。新しいプロトコルには、シンプルさ、時間の節約、技術的エラーの削減など、いくつかの利点があります。したがって、腎臓および血清miRNAプロファイルの正確で高感度な同定を必要とする調査に使用できます。多くの病理学的状態の研究も新しいプロトコルを利用することができます。
加齢性腎障害のモデルであるSAMP1マウスにおけるmiRNA発現プロファイルは、以下に示すように決定することができる。ヒトでは、加齢性腎障害は腎不全の進行に関連しており、腎間質線維症の領域の増加と糸球体硬化症の進行の両方を特徴としています15,16。加齢性腎障害も慢性腎臓病および末期腎疾患の重要かつ頻繁な特徴である15,16。

<table><tbody><tr>ヘパリン <td>Greiner-bio-one</td> と <td>1.0 mL スピッツ</td> Gleiner-bio-one <td>450534</td><td></td></tr><tr><td>バッファー RPE(グアニジンとエタノールを 1:4 の割合で含む洗浄バッファー #2)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>洗浄バッファー 2</td></tr><tr><td>バッファー RWT (グアニジンとエタノールを 1:2 の割合で含む洗浄バッファー #1)</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>Wash バッファー 1</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 96 ウェル反応プレート (qRT-PCR 用</td>) サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4316813</td><td>96ウェル反応プレート</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学接着フィルム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4311971</td><td>96ウェル反応プレート用接着フィルム</td></tr><tr><td>miRNA-223-3p プライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00003871</td><td>5'-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU G-3'miRNA-423-5p</td></tr> <tr><td>プライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00012005</td><td>5'-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU UU-3'</td></tr><tr><td>miRNA-7218-5p プライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00068067</td><td>5'-UGCAGGGUUAGUGUAGAGGG -</td>3'miRNA-7219-5p</tr> <tr><td>プライマー</td><td>Qiagen</td><td>MS00068081</td><td>5'-UGUGUUAGAGCUCAGGUGUGA GA-3'miRNeasy</td></tr> <tr><td>Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>2.0 mL Collection tube</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma kit</td><td>Qiagen</td><td>217184</td><td>2.0 mL コレクションチューブ入りメンブレン固定スピンカラム</td></tr><tr><td>miScript II RT キット (逆転写バッファー)</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>逆転写酵素キット</td></tr><tr><td>miScript SYBR グリーン PCR キット</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Green 色素ベース PCR キット</td></tr><tr><td>QIA シュレッダー</td><td>2.0 mL コレクションチューブ入り</td><td>Qiagen</td><td>79654</td> バイオポリマースピンカラム</tr><tr><td>QIAzol 溶解試薬 (フェノール/グアニジンベースの溶解)試薬)</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>フェノール/グアニジンベースの溶解試薬</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex リアルタイムPCRシステム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4472380</td><td>リアルタイムPCR装置</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex ソフトウェアバージョン1.2.1.</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4472380</td><td>リアルタイムPCR装置ソフトウェア</td></tr><tr><td>RNaseフリー水</td><td>キアゲン</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>RNU6-2プライマー</td><td>キアゲン</td><td>MS00033740</td><td>機密保持のため非公開</td></tr><tr><td>SAMP1雄マウス</td><td>日本SLC株式会社</td><td>未指定</td><td></td></tr><tr><td>SAMR1雄マウス</td><td>日本SLC株式会社</td> 未<td>指定</td><td></td></tr><tr><td>タカラバイオマッシャー標準</td><td>タカラバイオ</td><td>9790B</td><td>シリコンホモジナイザー</td></tr></tbody></table>

加齢性腎障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロrna発現の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応評価

Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

マイクロRNA(miRNA)は、21〜25塩基からなる小さなノンコーディングRNAです。それらはタンパク質に翻訳されるのではなく、標的メッセンジャーRNA(mRNA)を不安定にし、翻訳を破壊することによって、それらの機能を妨げる働きをします。さまざまなマウスの臓器や組織におけるmiRNA発現プロファイルが調査されていますが、マウスの腎臓および血清miRNAを精製および定量するための標準的な方法はありませんでした。我々は、加齢性腎障害を有するマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現を抽出および評価するための有効かつ信頼性の高い方法を確立しました。 
この方法は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を使用し、プロトコルには6つのステップが必要です:(1)老化加速マウス耐性1(SAMR1)マウスおよび老化加速マウス伏せ(SAMP1)マウスの準備。(2)これらのマウスから血清試料を抽出する工程;(3)各マウスから腎臓試料を抽出する工程;(4)各マウスの腎臓および血清サンプルからトータルRNA(miRNAを含む)を抽出する工程;(5)miRNAからの逆転写を伴う相補的DNA(cDNA)の合成;(6)得られたcDNAを用いてqRT-PCRを行う工程。 
このプロトコルを使用して、対照と比較して、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pの発現が、加齢性腎障害のマウスモデルの腎臓および血清において有意に変化したことを確認した。このプロトコールはまた、加齢性腎障害のマウスモデルの腎臓と血清との関係を明らかにした。このプロトコルは、加齢依存性腎機能障害を有するマウスの腎臓および血清におけるmiRNA発現を決定するために使用することができる。

加齢性腎障害マウスモデルでは、体重40〜45gの50週齢SAMP1雄マウスを使用し、マウスあたり約0.8mLの血液を採取し、ヘパリンを入れた1.0mLスピッツチューブに移し、倒立させ、遠心分離した。各腎臓をPBSですすぎ、解剖し、さらなる分析のために液体窒素に保存しました。50週齢のSAMR1マウスが対照として役立った。この加齢性腎障害モデルを用いて得られたmiRNA qRT-PCRデータに基づいて、SAMP1マウスでは、対照と比較してmiRNA-7219-5pの腎臓レベルが有意に増加し、miRNA-7218-5pの腎臓レベルが大幅に低下していることが観察されました(図1)。miRNA-7219-5pとmiRNA-7218-5pの両方の血清レベルは、対照と比較してSAMP1マウスで有意に増加しました(図2)。miRNA-223-3pの発現レベルは、いずれの系統でも、また腎臓と血清の間でも変化しませんでした(図1および図2)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig01.jpg"> 図1:SAMP1マウスの腎臓における発現差のあるマイクロRNA 。 SAMR1マウス(対照、n = 4)およびSAMP1マウス(n = 4)におけるmiRNA-223-3p、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5pの発現のqRT-PCR分析。データは標準誤差(エラーバー)±平均値です。 T検定は、グループ間の差を分析するために使用されました。p &lt; 0.05は有意と見なされました(*P &lt; 0.05)、N.S.:有意ではありません。略語:マイクロRNA =マイクロRNA;SAMP1 =老化加速マウスが起こりやすい;SAMR1 = 老化加速マウス抵抗性1;qRT-PCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig02.jpg"> 図2:SAMP1マウスの血清中の発現差のあるmiRNA 。 SAMR1マウス(対照、n = 4)およびSAMP1マウス(n = 4)におけるmiRNA-223-3p、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5pの発現のqRT-PCR分析。データはSE(エラーバー)±平均値です。 T検定は、群間の有意差を調べるために用いられた。*p &lt; t検定で0.05。略語:マイクロRNA =マイクロRNA;SAMP1 =老化加速マウスが起こりやすい;SAMR1 = 老化加速マウス抵抗性1;qRT-PCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

加齢性腎機能障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現を定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を提示する。

加齢性腎障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応評価

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

このqRT-PCR法は、加齢性腎障害などの状態のマウスの血清中のマイクロRNA発現プロファイリングに関連する質問に対処することができます。この技術は、時間を節約し、技術的なエラーを防ぐ簡単なプロセスによって、高精度かつ高感度でマイクロRNA発現の検出を可能にします。はじめに、ピンセットと外科用ハサミを使用して腹部の皮膚を切開します。腹膜の筋肉を膀胱から肋骨の左下端まで切ります。ピンセットを使用して腹膜を持ち上げ、外科用ハサミで上端を横方向に切開します。肋骨の下端に沿って切開を続けます。PBSで湿らせた綿棒2本を使用して、下大静脈を特定します。1ミリリットルの注射器に取り付けられた30Gの針を下大静脈に挿入し、注射器を引きます。溶血を避けるためにゆっくりと針を引き抜きます。血液をヘパリンを含む1ミリリットルのスピッツチューブに移し、反転させて混合します。スピッツチューブを室温で3000倍Gで10分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。200マイクロリットルの血清サンプルを取り、1, 000マイクロリットルのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加えます。混合物を5秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートする。200マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを15回反転させて混合する。サンプルを室温で3分間インキュベートし、続いて遠心分離します。ペレットを乱すことなく、上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。450マイクロリットルの100%エタノールを加え、チューブを5秒間ボルテックスします。次に、700マイクロリットルのサンプルをメンブレンアンカースピンカラムにロードし、遠心分離します。フロースルーを廃棄し、キットに含まれている700マイクロリットルの洗浄バッファー1を追加します。再度遠心分離し、フロースルーを廃棄する。500マイクロリットルの洗浄バッファー2で洗浄を繰り返し、微量の塩分を除去します。500マイクロリットルの80%エタノールを加え、遠心分離機で、収集チューブからのフロースルーを廃棄します。スピンカラムを再度遠心分離し、カラムを新しい1.5ミリリットルの収集チューブに移します。次に、14マイクロリットルのRNaseフリー水を加え、室温で5分間インキュベートします。カラムを室温で15000倍Gで1分間再度スピンさせる。マスターミックス溶液を調製し、8ウェルストリップチューブにウェルあたり8マイクロリットルを追加します。抽出したトータルRNAを各チューブに12マイクロリットル加え、室温で2000倍Gで15秒間チューブを遠心分離する。チューブをサーマルサイクラーに入れ、インキュベーションを開始してcDNAを合成します。インキュベーション後、cDNAを新しいマイクロ遠心チューブに移します。cDNAを蒸留水で10倍に希釈します。その後ボルテックス、室温で2000倍Gで5秒間遠心分離を行った。マイクロ遠心チューブ内で、テキストプロトコルに記載されているようにマスターミックス溶液を調製し、溶液をボルテックスします。96ウェルプレートの各ウェルに22.5マイクロリットルのアリコートを加え、続いて2.5マイクロリットルのcDNAを加えます。粘着フィルムを使用してプレートを密封し、プレートを1000回G.で30秒間遠心分離します プレートをリアルタイムPCRシステムに入れます。実験の名前を指定して設定を変更します。次に、実験タイプとして96ウェル0.2ミリリットル、定量方法として比較CT、システム実行モードとして標準、およびターゲット配列を検出するための試薬としてSYBR Green試薬を選択します。各ウェルのサンプルとターゲット miRNA の名前を指定します。重複サンプルを割り当て、参照サンプルと内在性コントロールを選択し、パッシブリファレンスとして使用する色素にはなしを選択します。試薬のクロスコンタミネーションを排除するには、陰性の逆転写酵素とmiRNA発現の非テンプレートコントロールを設定します。次に、反応量を20マイクロリットルに設定し、PCRサイクル条件を摂氏95度で15分間設定し、次に摂氏94度で15秒間40サイクル変性し、摂氏55度で30秒間アニーリングし、摂氏70度で30秒間伸長します。プロセスが完了したら、分析をクリックしてqRT-PCRデータを分析します。プログラムによって自動的に選択された閾値線が各ウェルに適していることを確認します。各サンプルで分析された内在性コントロールおよび標的miRNAの閾値サイクル値を確認します。増幅曲線と閾値線の交点によってCT値を決定する。加齢腎障害モデルのmiRNA qRT-PCRデータは、SAMR1対照マウスと比較して、SAMP1実験マウスではmiRNA-7219-5pの腎臓レベルが有意に増加し、miRNA-7218-5pの腎臓レベルが低下したことを示しました。miRNA-223-3pの発現レベルは、いずれの株においても変化しなかった。miRNA-7219-5pおよびmiRNA-7218-5pの両方の血清レベルはSAMP1マウスで有意に増加したが、miRNA-223-3pのレベルは変化しなかった。下大静脈に針を挿入し、血管を貫通せずに血液を抽出する必要があります。この方法は、幅広い病的状態に対するマウス血清中のマイクロRNA発現プロファイリングにおける重要な質問に答えるために使用できます。

quantitative-real-time-polymerase-chain-reaction-evaluation-microrna

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

この記事では、ホルマリン固定腎臓切片にマイクロRNA発現の比色検出のために最適化されたin situハイブリダイゼーションプロトコルについて説明します。...

マイクロRNA<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

このプロトコルでは、糸球体疾患のマウス ・...

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

この記事では、定量的なリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、急性腎障害マウスモデルの腎臓におけるマイクロRNA発現を検出するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、虚血性腎障害マウスモデルとマイクロRNAサンプルの慎重な抽出に重点を置いています。...

虚血性腎障害マウスモデルの腎臓内microRNAの定量的検出法

一方的な尿管閉塞(UUO)を有するマウスの腎臓におけるマイクロRNA発現を定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を説明する。このプロトコルは、UUOを有するマウスおよび他の病理学的状態の文脈における腎臓マイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。...

一方的な尿管閉塞を有するマウス腎臓におけるマイクロRNA表現の定量リアルタイムPCR評価

マイクロRNAはIgA腎症の病態形成に関与しています。我々は、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるマイクロRNA発現レベルを確実に検出する方法を開発しました。この新しい方法は、IgA腎症におけるmiRNAの関与をチェックすることを容易にします。...

免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出

ここでは、いくつかの腎臓病モデルマウスにおいて、非ウイルスベクターとポリエチレンイミンナノ粒子の尾静脈注射 を介して 、外因性人工的に合成されたmiRNA模倣物を腎臓に送達します。これにより、腎臓における標的miRNAの有意な過剰発現がもたらされ、その結果、いくつかのマウスモデルにおいて腎臓病の進行が抑制された。...

いくつかの腎臓病モデルマウスにおけるポリエチレンイミンナノ粒子を用いた外因性人工合成miRNA模倣体の腎臓への送達

液体クロマトグラフィー/質量分析によってフグ種を遺伝子型決定するための改良されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型法が記載されています。逆相シリカモノリスカラム消化アンプリコンを分離するために使用されます。この方法は、ベース組成物を同定するのに有用であるオリゴヌクレオチドのモノアイソトピック質量を、解明することができます。...

液体クロマトグラフィー/質量分析法による有毒フグの改善されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型ジェノタイピング

この研究は、pMGXプラスミド系を用いて、 大腸菌（Escherichia coli）における単一のプラスミドからの複数の遺伝子のT7媒介性同時発現のための方法を記載する。...

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

ここでは、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、ラット腹膜におけるマイクロRNA発現の検出のためのプロトコールを提示する。この方法は、いくつかの病理学的状態におけるラット腹膜におけるマイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。...

定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出

ここでは、非コーディング DNA...

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

学ぶ qRT-PCR法による加齢性腎障害マウスの腎臓および血清中マイクロRNA発現評価。高感度かつ正確な検出技術で、miRNA-7219-5pやmiRNA-7218-5pの変動を解析し、腎疾患の病態理解に貢献します。

加齢性腎障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応評価

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