Name: ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぼう、ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄に対する半自動レーザー誘発傷害法を。回転ガラス毛細管とUVレーザーを組み合わせたこの手法は、周囲組織への損傷を最小限に抑え、再現性を向上させます。組織修復と再生の研究に活用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究はBBSRC(BB/S0001778/1)の支援を受けた。CRは、プリンセスロイヤルテノバススコットランド医学研究奨学金プログラムによって資金提供されています。David Greenald(CRH、エジンバラ大学)とKaty Reid(CDBS、エジンバラ大学)に、トランスジェニック魚の親切な贈り物に感謝します( 補足ファイルを参照)。Daniel Soong(CRH、エジンバラ大学)が3iスピニングディスクコンフォカルに親切にアクセスしてくれたことに感謝します。

すべての動物実験は、英国内務省の承認を得て、その規制に従って、プロジェクトライセンスPP8160052の下で実施されました。このプロジェクトは、エジンバラ大学機関動物管理および使用委員会によって承認されました。実験的解析のために、両性の生後5日までのゼブラフィッシュ幼虫は、以下の利用可能なトランスジェニック系統のうち、以下のトランスジェニック系統について使用した:Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)、Tg(Xla.Tubb:DsRed)、Tg(betaactin:utrophin-mCherry)、Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)、およびTg(mnx1:gfp)(トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の生成に関する 補足ファイル1 を参照)。自動ゼブラフィッシュ幼虫処理プラットフォームを用いたプロトコルの概略を 図1に示す。この作業で使用されたすべてのカスタムソフトウェア、スクリプト、および詳細な実験プロトコルは、https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ で入手できます。
1. サンプル調製
<ol><li>受精後5時間で、正しい発生段階の胚を分類する21。死んだ卵や、発達が遅れている胚や発達しすぎの胚を捨てる。</li>
	<li>受精後3日目(dpf)に、90mmのシャーレに50mLの魚類施設水に2mLの0.4%アミノ安息香酸-エチルメチルエステルを加えて幼虫を麻酔する。フェニルチオ尿素(PTU)で飼育された動物( 材料表を参照)を使用して、皮膚色素沈着が問題である場合、このプロトコルに記載されている3dpf幼虫の脊髄損傷には当てはまりません。 注:この比較的高い麻酔濃度は、レーザー衝撃後の幼虫の動きを防止するために使用される。</li>
	<li>蛍光レポーター発現について胚をスクリーニングする(補足ファイル1)。 注:脊髄(または他の目的の構造)の蛍光レポーターは、傷害の効率を評価するためにしばしば必要とされる。tg(Xla.Tubb:DsRed)の使用は、脊髄を識別するのに役立ちます。</li>
	<li>選択した幼虫を96ウェルプレートに移し、VASTシステム( 材料表を参照)で使用するために、ウェルあたり300μLの魚施設水を使用します。90mmペトリ皿の麻酔薬を含む培地を直接使用する。1つの井戸につき1匹の幼虫しか持たないようにしてください。病変した幼虫を収集するために、余分な空の96ウェルプレートを1枚準備する。 注:別のレーザー病変システムを使用する場合は、適切な観察チャンバー内の1%低融点(LMP)アガロースゲルに幼虫をマウントします。</li>
</ol>2. 顕微鏡の準備
<ol><li>アブレーション用のレーザーを含むすべてのシステムコンポーネント(VAST、顕微鏡、レーザー、PC)の電源を入れます。</li>
	<li>ハードウェアが完全に初期化されたら、顕微鏡ソフトウェア、ImageJ/Fiji、Python統合開発環境(IDE)、およびこのプラットフォームを使用している場合は自動ゼブラフィッシュイメージング(VASTシステム)ソフトウェアを起動します( 資料表を参照)。</li>
	<li>以下の手順に従って VAST ソフトウェアをセットアップします。<ol>
<li>VAST ソフトウェアが起動したら、最初のウィンドウで [ プレート ] を選択し、[ 完了 ] ボタンをクリックします (図 2A)。別の小さな窓がポップアップし、毛細血管が空で清潔かどうかを尋ねます。キャピラリーの画像を見て、内部に気泡がないか確認します。そうでない場合は、[ はい]をクリックします。バブルがある場合は、[ いいえ ]をクリックし、手順2.3.2-2.3.3に従います(図2B)。</li>
		<li>[ラージパーティクル(LP)サンプラー]ウィンドウで、[ プライム ]をクリックして気泡を除去します(図2C)。</li>
		<li>メインのソフトウェアウィンドウ(キャピラリー画像を含む)に移動し、画像を右クリックします。ポップアップメニュー の[空の毛細血管画像を記録 ]を選択します(図2B)。</li>
		<li>LP サンプラー ウィンドウで、[ファイル] メニューに移動し、[スクリプトを開く] オプションを選択します。実行する実験に対応するスクリプトを含むファイルを選択します。</li>
		<li>VAST ソフトウェアのメイン ウィンドウで、[ ファイル ] に移動し、[ 実験を開く] を選択します。計画した実験に対応する実験ファイルを選択します。 メモ: [自動アンロード] ボックスと [廃棄バルク出力] ボックスがチェックされていないことを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イメージング用の顕微鏡ソフトウェアを設定します。<ol>
<li>顕微鏡イメージングソフトウェア( 材料表を参照)を起動して、ハードウェアを初期化します。システムによっては、この処理に数分かかる場合があります。</li>
		<li>取得設定に移動し、幼虫に発現する蛍光色素分子をイメージングするための顕微鏡をセットアップします。10x NA 0.5水浸漬対物レンズを使用して、焦点体積が光軸に沿って十分に細長く、脊髄または標的組織の全深さを病変させるようにする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>レーザー病変用にImageJ/Fijiを設定します。<ol>
<li>[ファイル] メニューに移動し、[新規/スクリプト] を選択してスクリプト ウィンドウを開きます。</li>
		<li>新規ウィンドウで、[ファイル] メニューに移動し、[開く] を選択してレーザー病変スクリプト (Manual_MP_Operation.ijm) を読み込みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Python IDE をセットアップします。<ol>
<li>Python IDE を起動します。</li>
		<li>[ファイル]メニューに移動し、[ファイルを開く]を選択して、レーザー(Watch_for_ROIs_py3.py)を管理するスクリプトをロードします。</li>
		<li>[実行] メニューに移動し、[デバッグなしで実行] を選択してスクリプトを実行します。レーザアッテネータの初期化中に、TERMINALパネルに一連のメッセージがノイズとともに表示されることを確認します(図2D)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. VASTシステムでのレーザー病変の検査
<ol><li>VASTソフトウェアのメインウィンドウの矢印ボタンをクリックしてステージを移動して、顕微鏡対物レンズに対してキャピラリーを中央に配置します(図2B)。</li>
	<li>接眼レンズを透視し、顕微鏡の透過光を使用して毛細血管の上部に焦点を合わせます。 警告: 毛細血管は非常に壊れやすく、目標に触れると破損する恐れがあります。顕微鏡のつまみをゆっくりと動かして、ピントを合わせたり外したりします。</li>
	<li>96ウェルプレートをVASTシステムのLPサンプラーのプレートホルダーに置きます。幼虫を含むプレートを左側のホルダーに置き、収集用のプレートを右側に配置します。プレートの向きが正しいことを確認します。A1 ウェルはホルダーの左前隅にある必要があります。</li>
	<li>VAST ソフトウェアの LP サンプラー ウィンドウで、[ プレート テンプレート] ボタンをクリックし、幼虫を含むすべてのウェルを選択します。[ OK] ボタンをクリックして検証し、ウィンドウを閉じます(図2C)。</li>
	<li>LPサンプラーウィンドウで、 ランプレート ボタンをクリックして幼虫のロードを開始します。 注:しばらくすると、幼虫は毛細血管の位置(実験定義ファイルで事前定義)に見えるようになり、脊髄を傷つけることができます。VASTトレイライトは、数回回転すると消灯し、横側が顕微鏡の対物レンズに面した幼虫を設定します。</li>
	<li>顕微鏡ソフトウェアに移動し、 ライブ ボタンをクリックして幼虫を画像化します。</li>
	<li>脊髄中央管が見えるまで顕微鏡のフォーカスノブを回します。 注:最初に透過光を使用して焦点を合わせ、次に蛍光で精製する方が簡単です。</li>
	<li>蛍光のスナップショットを撮り、画像を専用のフォルダに保存します。</li>
	<li>ImageJ で画像を開き、必要に応じてコントラストを調整します ( ImageJ の [画像/調整/明るさ/コントラスト...] メニューを使用)。</li>
	<li>関心領域(ROI)線ツールをクリックし、脊髄を中心とする短い線(20μm)を描きます(図3A)。</li>
	<li>顕微鏡を100%反射ミラーの位置に切り替えます。</li>
	<li>ImageJスクリプトをロードし、[ 実行 ]ボタンをクリックします。次のパラメーターを使用します: 繰り返し - 2;サンプル - 1;幅 - 40ミクロン。減衰 - 89(フルレーザー出力)(図3C)。</li>
	<li>レーザーショットシーケンスが終了したら、イメージングソフトウェアで蛍光イメージングに切り替え、必要に応じてフォーカスを調整します。 注:レーザー露光中の尾部のずれにより、焦点のずれがしばしば観察されます。</li>
	<li>新しいスナップショットを作成して保存します。</li>
	<li>この新しい画像をImageJで開き、脊髄自体よりも大きく(約80μm)、脊索の上部にある脊髄の腹側の下から始まり、背側に向かって脊髄と皮膚の間の空間で終わる新しい線を描きます(図3B)。</li>
	<li>顕微鏡を100%反射ミラーの位置に切り替えます。</li>
	<li>ImageJスクリプトウィンドウに移動し、[ 実行 ]ボタンをクリックします。次のパラメーターを使用します: 繰り返し - 2;サンプル - 1;幅 - 40ミクロン。減衰 - 89(フルレーザー出力)。</li>
	<li>(より長い)レーザーショットシーケンスが終了したら、蛍光をイメージングして焦点を合わせることによって、切断品質を検証します。病変部位に細胞または軸索が無傷で残っていないことを確認します(病変部位は暗く、かすかで均質な蛍光領域として表示されます(図3D、下部パネル)。</li>
	<li>病変した幼虫を空の96ウェルプレート(元のウェルと同じウェル座標)に集めるには、メインのVASTソフトウェアウィンドウに移動して [収集] ボタンをクリックします。</li>
	<li>ウィンドウの左下にある [トレイ ライト] チェック ボックスをクリックして、VAST システム ライト を再びオンにします。</li>
	<li>負傷する新しい幼虫ごとにステップ3.3-3.17を繰り返します。</li>
</ol>4. 病変後の取り扱いと追加実験
<ol><li>できるだけ早く96ウェルプレートから幼虫を取り出し、幼虫が病変後を回復するための新鮮な魚施設の水を入れたきれいなペトリ皿に移す。ペトリ皿を28°Cのインキュベーターに入れる。 注:損傷は、しばしば病変後最初の1時間で伝播し続ける。したがって、病変の実際の程度は、約1時間の遅延後に蛍光イメージングによって評価されるべきである。</li>
</ol>5. トラブルシューティング
<ol><li>VASTシステムのチューブやキャピラリーに気泡がある場合は、LPサンプラーウィンドウの プライム ボタンをクリックして取り除きます。</li>
	<li>失敗した病変(予想される残留および均質なバックグラウンドとは別に、病変部位の残りの蛍光から評価される)を考慮すると、これは以下に述べるいくつかの理由に起因する可能性がある。<ol>
<li>低レーザー出力: このような場合は、より高い値で試してください。 注: VAST システムには色素レーザーが装備されています。これは、レーザー光生成に使用される色素溶液の濃度が時間とともに変化し、レーザー出力の低下につながる可能性があることを意味します。通常、新しいソリューションに置き換えると、問題が解決されます22。</li>
		<li>不十分なキャリブレーション:このような場合は、ステップ5.2.2.1-5.2.2.4に従ってレーザーシステムのキャリブレーションとパワーを確認します。正しく較正されない場合、レーザーは所望の位置に向けられず、したがって、隣接する組織において病変が失敗または望ましくない損傷をもたらす。<ol>
<li>キャピラリーチャンバーの上にミラースライドを置きます。コーティングされた側に焦点を合わせます(目標に面している必要があります)。スライドの前の既定値を使用して、フォーカスをより簡単にします。</li>
			<li>キャリブレーションスクリプトを使用してレーザーアブレーションのパターンを適用します。</li>
			<li>パターンの品質を評価します。斑点や線は鮮明に見え、ぼやけてはいけません。</li>
			<li>出力が増大したランプを使用して、レーザー出力が前のセッションと比較して変化したかどうかを評価します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>病変中の幼虫の動き:幼虫は麻酔に対して異なる反応を示す。したがって、レーザー病変は、プロセス中に尾の動きを誘発し、したがって、正常な切断を妨げる可能性がある。これが起こったら、周囲の組織への損傷を避けながら、レーザー病変ステップをさらに繰り返して完了させます。</li>
		<li>焦点が悪い: これが発生した場合は、最良の結果を得るために中央運河の中央に焦点を合わせます。</li>
		<li>ROIの描画、位置、サイズ: ROIの位置とサイズは、トランセクションを成功させるために重要です。ROIは脊髄よりも大きく、脊髄の中心を中心とすべきである。これを解決するには、脊髄の腹側からROIを引き出し始め、背側に向かって上昇して解剖を成功させます。これは、アブレーション処置中のレーザーショットのシーケンスによって引き起こされる尾の動きによる可能性が高い。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+Neurology+and+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li>
<li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li>
<li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li>
<li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li>
<li>Schlüßler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li>
<li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li>
<li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li>
<li>National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021).</li>
<li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li>
<li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li>
<li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li>
<li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualised+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li>
<li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li>
<li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li>
<li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li>
<li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li>
<li>Ellström, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li>
<li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li>
<li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>AndOr Micropoint Manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021).</li>
<li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260(2017).</li>
<li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1%CE%B2+and+Tnf-%CE%B1+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowell%2C+D+%22Statistical+methods+for+psychology%22">Statistical methods for psychology</a>. , Duxbury. 324-325 (2002).</li>
<li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li>
<li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+voltage-gated+Na%2B+and+K%2B+currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li>
<li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+long-term%2C+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
<li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

ゼブラフィッシュの再生中に作用するプロセスのより深い理解が緊急に必要とされています。この動物モデルは、生物医学研究、特に脊髄損傷に多くの利点をもたらします1。ほとんどの研究は、十分に訓練されたオペレータを必要とし、多組織損傷を誘発する手動病変を含む。レーザー病変プロトコルがここに提示され、病変特性を制御し、周囲の組織への損傷を低減することを可能にする。さらに、この手法は、比較的訓練を受けていない実験者がうまく使用できるほど簡単です。
プロトコルの重要なステップは、レーザのキャリブレーションとROIの定義です。実際には、較正は非常に安定しており(数ヶ月間でさえ)、ROIの適切なサイズと位置が決定されると、この技術の使用は簡単です。プロトコルは、特定の機器で病変を実行する方法を説明しましたが、レーザー病変の利点のほとんどは、回転ディスク顕微鏡などのさまざまなシステムで利用できます。
このプロトコルの主な制限は、脊髄の蛍光レポーターを使用する必要性と、病変を行うのに必要な時間(〜5分/...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63259">Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae</a>. The title was&#160;updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63259">Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae</a>. The Title was&#160;updated.

Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

哺乳類とは対照的に、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は怪我をした後、中枢神経系(CNS)を修復することができます1。脊髄再生のモデルとしてのゼブラフィッシュ幼虫の使用は比較的最近のことである。修復の根底にある細胞および分子のメカニズムを調査することは有益であることが証明されています2。これは、操作の容易さ、短い実験サイクル(毎週新しい幼虫)、組織の光透過性、および幼虫のサイズが小さく、 in vivo 蛍光顕微鏡に理想的であるためである。
脊髄再生の場合、幼虫を使用する2つの追加の利点は、回復の速度、成人の数週間と比較して数日、および手動技術を使用して傷害を誘発することの容易さである。これは、最近の調査を含む多くの研究3,4,5で首尾よく使用されています6,7。全体として、これは有意義なデータ生成の増加、実験プロトコルの高い適応性、および実験コストの削減につながります。受精後5日未満の幼虫の使用はまた、動物研究における3Rの原則に従う動物の使用を減少させる8。
ゼブラフィッシュの幼虫の脊髄損傷後、炎症反応、細胞増殖、神経新生、生存または新たに生成された細胞の移動、機能軸索の再構築、神経プロセス回路および脊椎組織のグローバルリモデリングなど、多くの生物学的プロセスが起こる6,7,9,10.うまくオーケストレーションされるために、これらのプロセスは、様々な細胞型、細胞外マトリックス成分、および生化学的シグナル11、12の間の細かく調節された相互作用を伴う。脊髄のような複雑な組織のこの重要な再編成の詳細を解明するには、正確で制御された実験的アプローチの使用と開発が必要です。
ゼブラフィッシュの脊髄再生を研究するために使用される主要な実験パラダイムは、切除、刺し傷、または凍結傷害によって組織損傷を誘発するために外科的手段を使用することです3,13。これらのアプローチには、マイクロサージャリースキルの特定のトレーニングを必要とするという欠点があり、これは新しいオペレータにとって時間がかかり、短期プロジェクトでの使用を妨げる可能性があります。さらに、それらは通常、周囲の組織に損傷を誘発し、再生に影響を与える可能性がある。
別のアプローチは、化学的に、または遺伝子操作によって細胞損傷を 誘発することです15。後者は、高度に標的を絞ったダメージを与えます。しかしながら、このような技術は、実験を行う前に新しいトランスジェニック魚を生成するために長い準備作業を必要とし、ユニークな細胞型が標的とされるたびに更新される。
したがって、再生における様々な研究に適した標的化が多目的な病変を可能にする方法の必要性がある。解決策は、レーザーを使用して、関心のある組織に局所的な損傷を誘発することである16、17、18、19、20。実際、レーザー誘発組織損傷の使用は、多くの利点を有する脊髄病変を生成するための堅牢なアプローチを提示する。このようなレーザー操作モジュールを搭載した顕微鏡は、細胞アブレーションが発生するカスタマイズされた形状領域を指定することができ、時間的制御のさらなる利点があります。したがって、病変の大きさおよび位置は、あらゆる質問に対処するために適合させることができる。
ほとんどのレーザー病変系に欠けている特徴は、一連の幼虫に対して再現性の高い方法で傷害を誘発する可能性である。ここでは、自動化された幼虫処理のために設計されたマイクロ流体プラットフォームに基づいて、ゼブラフィッシュ幼虫に半自動化された正確で制御された病変を誘導するために、UVレーザーを使用してオリジナルのプロトコルが説明されています21。さらに、ここで提示されたシステムでは、幼虫はガラス毛細血管に挿入され、これはその吻側尾軸の周りに動物の自由回転を可能にする。ユーザーは、幼虫のどちらの側をレーザーに提示するかを選択しながら、蛍光イメージングがレーザービームを正確に標的にし、病変後の損傷を評価することを可能にすることができる。
ここで説明するプロトコルは、半自動ゼブラフィッシュ幼虫イメージングシステムと、UVレーザーを搭載したスピニングディスク(以下、VASTシステムと呼ぶ)と組み合わせて使用されます。しかしながら、プロトコルの要点および技術の主張の大部分は、2光子レーザー走査顕微鏡、UVレーザーを備えたスピニングディスク顕微鏡(FRAPモジュール)、または光操作のためのレーザーモジュールを備えたビデオ顕微鏡を含む、細胞アブレーションが可能なレーザーを搭載したあらゆるシステムに対して有効である。VASTシステムと従来のサンプル処理の主な違いの1つは、後者の場合、96ウェルプレートに積み込む代わりに、ガラスカバースリップ/ガラス底ペトリ皿に低融点アガロースに幼虫を取り付ける必要があることです。
この方法によって提供される利点は、再生プロセス中の細胞および分子メカニズムに関する革新的な研究の機会を開く。さらに、高いデータ品質により、学際的な文脈での定量的調査が可能になります。

<table><tbody><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ソフトウェア Zen Blue 2.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>オープンソース</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visual Studio Code</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope and accessories</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApoTome microscope</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) ディッピングレンズ</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュアル AxioCam 506 m CCDカメラ</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡 LSM880</td><td>カールツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスクモジュール CSU-X1</td><td>横河</td><td></td><td></td></tr>電機正<tr><td>立顕微鏡Axio Examiner D1</td><td>カールツァイ</td><td></td>ス<td></td></tr><tr><td>UVレーザー</td><td>マイクロポイント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VAST バイオイメージャー</td><td>ユニオン バイオメトリック<</td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Labware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>90 mm シャー</td><td>レ サーモフィッシャー</td><td>101R20</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3841</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-It EdU イメージングキット</td><td>Invitrogen</td><td>C10637</td><td></td></tr><tr><td>アミノ安息香酸エチルメチルエステル (MS222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>フェニルチオ尿素 (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロバ アンチチキン Alexa Fluor 488</td><td>Jackson</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>ロバの反マウスCy3</td>ジャ<td>クソン</td><td>715-165-150</td><td></td></tr><tr><td>マウスの反GFP</td><td>Abcam</td><td>AB13970</td><td></td></tr><tr><td>マウスの反チューブリンアセチル化抗体</td><td>Σ</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>transgenicのゼブラフィッシュ系統</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(ベータアクチン:utrophin-mCherry)</td><td></td><td>N/A</td><td>デビッドGreenhaldによって確立され、エディンバラ大学</td></tr><tr><td>Tg(mnx1:gfp)</td><td></td><td>N/A</td><td>[Flanagan-Steet et al. 2005]</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td><td></td><td>N/A</td><td>[Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td><td></td><td>N/A</td><td>Katy Reid, University of Edinburgh</td></tr><tr><td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td><td></td><td>N/A</td> David <td>Greenhald, University of Edinburgh によって設立されました</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

ゼブラフィッシュの幼虫は、受精後わずか数日後に高い再生能力を有する完全に機能する中枢神経系(CNS)を有する。これにより、この動物モデルは脊髄損傷および再生の研究に非常に有用である。このような病変を誘導するための標準的なプロトコルは、体幹の背部を手動で通過させることである。しかしながら、この技術は広範な訓練を必要とし、追加の組織に損傷を与える。レーザー誘発病変がこれらの制限を回避するためのプロトコルが開発され、訓練を受けていないオペレータであっても、多くの動物上および異なるセッション間での脊髄切除の高い再現性と完全性を可能にした。さらに、組織損傷は、主に脊髄自体に限定され、異なる組織、例えば皮膚、筋肉、およびCNSを損傷することによる交絡効果を減少させる。さらに、脊髄の半血病変が可能である。レーザー損傷後の組織の完全性の保存を改善することで、電気生理学などの追加の分析に必要なさらなる解剖が容易になります。したがって、この方法は、手動では達成できない傷害程度の正確な制御を提供する。これにより、将来、この強力なモデルで新しい実験パラダイムが可能になります。

脊髄切除の検証 プロトコールが完全な脊髄切除を可能にするかどうかを評価するために、構造的および機能的調査が実施された。
まず、病変部位における蛍光の消失がレーザー照射による蛍光ではなく神経組織損傷によるものであることを確認するために、アセチル化チューブリンに対する抗体を用いた免疫染色( 材料表 及び 補足資料1参照)を行った。病変の尾側と吻側との間の軸索の完全な破壊が観察され、脊髄の完全な切断が確認された(図4B)。脊髄切除が成功した場合、病変部位全体に残りのニューロン突起が残ってはなりません(失敗した病変の例については 図4C を参照)。この技術を用いて、脊髄レーザー病変の成功率は75%(16匹の動物において4つの不完全な切除)と推定された。
レーザー病変後の機能喪失をカルシウムイメージングを用いて調...

本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

ここで提案する技術は、経験の浅いオペレータであっても、隣接する組織への損傷を軽減し、再現性を向上させることによって、手動病変プロトコルの限界を克服することを可能にする。この技術により、回転するガラス毛細血管と標的UVレーザーを組み合わせることで、周囲の組織を損傷することなく病変を誘導する場所を正確に選択することができます。VAST機器の操作には多くのステップが関係しているので、すべてが正しく行われるように、すべてのステップをチェックすることをお勧めします。麻酔薬を含む培地を使用して幼虫を麻酔することから始めて、次いでそれらを1ウェルあたり300マイクロリットルの培地を含む96ウェルプレートに移す。アブレーション用のレーザーを含むすべてのシステムコンポーネントの電源を入れます。次に、自動ゼブラフィッシュイメージングまたはVASTソフトウェアを起動し、最初のウィンドウで[プレート]を選択し、[完了]ボタンをクリックします。毛細血管が空で清潔であるかどうかを尋ねる小さな窓がポップアップ表示されます。毛細血管の画像に内部に気泡がないか確認してください。内部に気泡がない場合は、ポップアップウィンドウの[はい]をクリックします。次に LP サンプラーウィンドウで、[ファイル] メニューに移動し、[スクリプトを開く] オプションを選択します。実行する実験に対応するスクリプトを含むファイルを選択します。次に、VAST ソフトウェアのメイン ウィンドウで、[ファイル] に移動し、[実験を開く] を選択します。計画した実験に対応する実験ファイルを選択します。ImageJ/Fijiソフトウェアを起動し、[ファイル]メニューに移動し、[新しいスクリプト]を選択してスクリプトウィンドウを開きます。次に、[ファイル]メニューに移動し、[開く]を選択してレーザー病変スクリプトをロードします。次に、Python IDE を起動するには、[ファイル] メニューに移動し、[ファイルを開く] を選択して、レーザーを管理するスクリプトを読み込みます。次に、[実行]メニューをクリックし、[デバッグなしで実行]を選択してスクリプトを実行します。レーザー・アッテネータの初期化中に、何らかのノイズとともに端末パネルに一連のメッセージが表示されることを確認します。VAST ソフトウェアのメイン ウィンドウで、矢印ボタンをクリックしてステージを移動し、顕微鏡の対物レンズに対してキャピラリーを中央に配置します。接眼レンズを覗き込み、顕微鏡の透過光を使って毛細血管の上部に焦点を合わせます。LPサンプラーの左プレートホルダー上に幼虫を含む96ウェルプレートを置く。次に、サンプラーの右側のプレートホルダーに回収用の別のプレートを置きます。プレートの A1 ウェルがホルダーの左前隅にあることを確認します。VAST ソフトウェアの LP サンプラー ウィンドウで、[プレート テンプレート] ボタンをクリックし、幼虫を含むすべてのウェルを選択します。[OK]ボタンをクリックして検証し、ウィンドウを閉じます。次に、LPサンプラーウィンドウの[プレートの実行]ボタンをクリックして、幼虫のロードを開始します。次に、顕微鏡ソフトウェアに移動し、[ライブ]ボタンをクリックして幼虫を画像化します。脊髄中央管が見えるまで顕微鏡のフォーカスノブをオンにします。蛍光のスナップショットを撮り、画像をフォルダに保存します。ImageJで画像を開き、必要に応じてコントラストを調整します。関心領域線ツールをクリックし、脊髄を中心とする短い線を描きます。顕微鏡を100%反射ミラーの位置に切り替えます。ImageJ スクリプトをロードし、繰り返しを 2、サンプルを 1、幅を 40 ミクロン、減衰を 89 に設定します。すべてのパラメータを設定したら、[OK]ボタンをクリックします。レーザーショットシーケンスが終了したら、イメージングソフトウェアで蛍光イメージングに切り替え、フォーカスを調整します。新しいスナップショットを作成して保存します。この新しい画像をImageJで開き、脊髄自体よりも大きな新しい線を描きます。顕微鏡を100%反射ミラーの位置に切り替えます。ImageJ スクリプトウィンドウに移動し、「繰り返し」を 2、サンプルを 1、幅を 40 ミクロン、減衰を 89 に設定します。すべてのパラメータを設定したら、[OK]ボタンをクリックします。レーザーショットシーケンスが終了したら、蛍光をイメージングして焦点を合わせることで、切断品質を確認します。病変部位に細胞または軸索が無傷のまま残っていないことを確認します。メインの VAST ソフトウェア ウィンドウに移動し、[収集] ボタンをクリックして、病変した幼虫を空の 96 ウェル プレートに集めます。次に、チェックボックストレイライトをクリックして、VASTシステムライトを再びオンにします。できるだけ早く96ウェルプレートから幼虫を取り出し、幼虫が病変後を回復するために新鮮な魚の水を入れたきれいなペトリ皿に移す。ペトリ皿を摂氏28度のインキュベーターに入れます。アセチル化チューブリン免疫染色およびカルシウムイメージングは、レーザー病変が脊髄組織の連続性を完全に破壊することを示している。無傷の脊髄がこの画像に示されている。病変の尾側と吻側との間の軸索の完全な破壊は、脊髄の完全な切断を確認する。不完全な断面の例を以下に示します。NBTG cAMP 6-S幼虫上のトランスセクト脊髄をこの画像に示す。長方形は、病変の吻側および尾側における蛍光強度を定量化するために使用されるROIを示す。グラフィカル画像は、吻側および尾側分析ROIにおける経時的な蛍光強度変化を表す。レーザー病変の3時間後、24時間後、および48時間後のNBT:dsRed幼虫の最大強度投影蛍光画像をここに示す。損傷後24時間後、創傷は閉じ始め、48時間後に脊髄の初期構造の部分的な回復をもたらした。部分的な機能的再接続は、カルシウムイメージングを用いて傷害後48時間後に確認された。尾部領域と吻側領域におけるスパイクの振幅の比は、損傷後3、24、および48時間の間に増加を示した。マクロファージリクルートメントは、NBT:dsRedmpeg1 GFP幼虫レーザー病変を用いてレーザー病変後に観察された。手動病変とレーザー病変の間で標識細胞数に差は認められなかった。病変していない魚は、両方の病変条件下で病変した魚よりも少ない二重標識細胞を示した。レーザー病変は、手動病変よりも少ない筋肉および皮膚損傷を誘発する。病変が完全であるかどうかを確認することが重要です。無傷の細胞または構造は病変領域に見えず、薄暗い背景のみに見えるはずである。脊髄再生を研究するために、免疫組織化学やカルシウムイメージングなど、多くの方法を使用しています。重要なことに、組織が手動で病変した動物とは対照的に、解剖に耐えることができるので、電気生理学を行うこともできます。この新しい技術により、損傷後の脊髄の構造的および機能的な組織を定量的に研究し、再現性および制御された病変を可能にすることができます。

controlled-semi-automated-laser-induced-injuries-for-studying-spinal

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ここでは、長期的イメージング、二光子イメージングと組織損傷のテクニック、およびタイムラプス共焦点イメージングのためのゼブラフィッシュ胚を装着するための方法を説明します。...

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

ここで紹介する方法は、高エネルギーのレーザーパルスと時間でこれらの損傷とその回復のその後の分析でライブゼブラフィッシュ胚の正確な傷害を含む。我々はまた、遺伝的に単一標識又は骨格筋細胞のグループが中に、レーザー光誘起損傷後に追跡することができる方法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害

このビデオは、レーザー損傷を使用して成魚の網膜変性を誘発する手順を示しています。レーザーは網膜の光受容体細胞を標的とし、細胞死と変性プロセスを引き起こします。この損傷により、ミュラーグリア(MG)細胞が活性化され、網膜再生を助ける幹細胞前駆細胞への脱分化が起こります。...

局所レーザー損傷を用いたゼブラフィッシュの網膜変性および再生のモデル化

出典: Volpe, B. A., 他 ゼブラフィッシュ神経マスト細胞における共焦点顕微鏡ベースのレーザーアブレーションおよび再生アッセイ. J. Vis. Exp. (2020)...

共焦点顕微鏡法を用いたゼブラフィッシュにおけるレーザーアブレーションニューロマスト間細胞の回収率のモニタリング

末梢神経系（PNS）は、損傷後の大幅な修理が可能ですが、少しは、この現象を支配する細胞および分子メカニズムについてはほとんど知られていない。ライブ、トランスジェニックゼブラフィッシュと再現神経切断アッセイを使用して、我々は、神経変性と再生の間ダイナミックグリア細胞の挙動を学ぶことができます。...

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

脊髄切断後、大人のゼブラフィッシュは、6週間後損傷によって機能回復を持っている。幼虫の透明性と迅速な復旧を活用するために、我々は、幼虫の脊髄を離断するための方法を提示する。切断後、我々は、3日後に傷害によって2日後の傷害、およびC-曲がり動きで始まる感覚の回復を観察します。...

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

ゼブラフィッシュの成体の神経新生と再生の細胞的および分子的メカニズムを明らかにするために、ゼブラフィッシュの成体終脳に機械的損傷を引き起こす侵襲的手術と、その後の免疫組織化学またはin...

ゼブラフィッシュ成体終脳の刺し傷傷害：脊椎動物の脳神経発生·再生を調査する方法

個々の細胞に指向性ストレスや死を引き起こすための標的操作は、達成するのが比較的困難でした。ここでは、細胞培養および生きた動物の個々の細胞を選択的にストレスを与えて死滅させるための単一細胞分解能アブレーションアプローチについて、標準的な共焦点UVレーザーに基づいて説明します。...

従来のUVレーザー共焦点顕微鏡を用いて細胞ストレスと死のトリガ

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の網膜変性・再生のメカニズムを勉強する人気動物モデルです。このプロトコルでは、ローカライズされた外傷の内側の網膜に最小の被害で網膜の外側を中断することを誘導する方法について説明します。その後、我々 は生体内で網膜の形態と網膜再生を通してミュラー...

ゼブラフィッシュの再生モデルと網膜変性のレーザー誘起のミュラー グリア細胞の活性化

レーザーアブレーションは、生物系の再生を研究するための広く応用できる技術です。提示されたプロトコルは、ゼブラフィッシュ横線で神経間細胞を再生するレーザーアブレーションとその後のタイムラプスイメージングのための標準的なレーザー走査共焦点顕微鏡の使用を記述する。...

ゼブラフィッシュインターニューロマスト細胞における共焦点顕微鏡ベースレーザーアブレーションと再生アッセイ

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生で実施される 2 光子レーザー アブレーション...

ゼブラフィッシュ幼生の発育中の骨芽細胞の2光子レーザー媒介アブレーション

学ぼう、ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄に対する半自動レーザー誘発傷害法を。回転ガラス毛細管とUVレーザーを組み合わせたこの手法は、周囲組織への損傷を最小限に抑え、再現性を向上させます。組織修復と再生の研究に活用できます。

ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害

さらに動画を探す