ゼブラフィッシュ幼虫の脊髄再生を研究するための制御された半自動レーザー誘発傷害
2021年11月22日
本プロトコールは、幼虫処理のための自動化されたマイクロ流体プラットフォームと組み合わせたレーザー病変システムを用いて、ゼブラフィッシュ幼虫において組織特異的かつ再現性の高い傷害を誘発する方法を記載する。
ここで提案する技術は、経験の浅いオペレータであっても、隣接する組織への損傷を軽減し、再現性を向上させることによって、手動病変プロトコルの限界を克服することを可能にする。この技術により、回転するガラス毛細血管と標的UVレーザーを組み合わせることで、周囲の組織を損傷することなく病変を誘導する場所を正確に選択することができます。VAST機器の操作には多くのステップが関係しているので、すべてが正しく行われるように、すべてのステップをチェックすることをお勧めします。
麻酔薬を含む培地を使用して幼虫を麻酔することから始めて、次いでそれらを1ウェルあたり300マイクロリットルの培地を含む96ウェルプレートに移す。アブレーション用のレーザーを含むすべてのシステムコンポーネントの電源を入れます。次に、自動ゼブラフィッシュイメージングまたはVASTソフトウェアを起動し、最初のウィンドウで[プレート]を選択し、[完了]ボタンをクリックします。
毛細血管が空で清潔であるかどうかを尋ねる小さな窓がポップアップ表示されます。毛細血管の画像に内部に気泡がないか確認してください。内部に気泡がない場合は、ポップアップウィンドウの[はい]をクリックします。
次に LP サンプラーウィンドウで、[ファイル] メニューに移動し、[スクリプトを開く] オプションを選択します。実行する実験に対応するスクリプトを含むファイルを選択します。次に、VAST ソフトウェアのメイン ウィンドウで、[ファイル] に移動し、[実験を開く] を選択します。
計画した実験に対応する実験ファイルを選択します。ImageJ/Fijiソフトウェアを起動し、[ファイル]メニューに移動し、[新しいスクリプト]を選択してスクリプトウィンドウを開きます。次に、[ファイル]メニューに移動し、[開く]を選択してレーザー病変スクリプトをロードします。
次に、Python IDE を起動するには、[ファイル] メニューに移動し、[ファイルを開く] を選択して、レーザーを管理するスクリプトを読み込みます。次に、[実行]メニューをクリックし、[デバッグなしで実行]を選択してスクリプトを実行します。レーザー・アッテネータの初期化中に、何らかのノイズとともに端末パネルに一連のメッセージが表示されることを確認します。
VAST ソフトウェアのメイン ウィンドウで、矢印ボタンをクリックしてステージを移動し、顕微鏡の対物レンズに対してキャピラリーを中央に配置します。接眼レンズを覗き込み、顕微鏡の透過光を使って毛細血管の上部に焦点を合わせます。LPサンプラーの左プレートホルダー上に幼虫を含む96ウェルプレートを置く。
次に、サンプラーの右側のプレートホルダーに回収用の別のプレートを置きます。プレートの A1 ウェルがホルダーの左前隅にあることを確認します。VAST ソフトウェアの LP サンプラー ウィンドウで、[プレート テンプレート] ボタンをクリックし、幼虫を含むすべてのウェルを選択します。
[OK]ボタンをクリックして検証し、ウィンドウを閉じます。次に、LPサンプラーウィンドウの[プレートの実行]ボタンをクリックして、幼虫のロードを開始します。次に、顕微鏡ソフトウェアに移動し、[ライブ]ボタンをクリックして幼虫を画像化します。
脊髄中央管が見えるまで顕微鏡のフォーカスノブをオンにします。蛍光のスナップショットを撮り、画像をフォルダに保存します。ImageJで画像を開き、必要に応じてコントラストを調整します。
関心領域線ツールをクリックし、脊髄を中心とする短い線を描きます。顕微鏡を100%反射ミラーの位置に切り替えます。ImageJ スクリプトをロードし、繰り返しを 2、サンプルを 1、幅を 40 ミクロン、減衰を 89 に設定します。
すべてのパラメータを設定したら、[OK]ボタンをクリックします。レーザーショットシーケンスが終了したら、イメージングソフトウェアで蛍光イメージングに切り替え、フォーカスを調整します。新しいスナップショットを作成して保存します。
この新しい画像をImageJで開き、脊髄自体よりも大きな新しい線を描きます。顕微鏡を100%反射ミラーの位置に切り替えます。ImageJ スクリプトウィンドウに移動し、「繰り返し」を 2、サンプルを 1、幅を 40 ミクロン、減衰を 89 に設定します。
すべてのパラメータを設定したら、[OK]ボタンをクリックします。レーザーショットシーケンスが終了したら、蛍光をイメージングして焦点を合わせることで、切断品質を確認します。病変部位に細胞または軸索が無傷のまま残っていないことを確認します。
メインの VAST ソフトウェア ウィンドウに移動し、[収集] ボタンをクリックして、病変した幼虫を空の 96 ウェル プレートに集めます。次に、チェックボックストレイライトをクリックして、VASTシステムライトを再びオンにします。できるだけ早く96ウェルプレートから幼虫を取り出し、幼虫が病変後を回復するために新鮮な魚の水を入れたきれいなペトリ皿に移す。
ペトリ皿を摂氏28度のインキュベーターに入れます。アセチル化チューブリン免疫染色およびカルシウムイメージングは、レーザー病変が脊髄組織の連続性を完全に破壊することを示している。無傷の脊髄がこの画像に示されている。
病変の尾側と吻側との間の軸索の完全な破壊は、脊髄の完全な切断を確認する。不完全な断面の例を以下に示します。NBTG cAMP 6-S幼虫上のトランスセクト脊髄をこの画像に示す。
長方形は、病変の吻側および尾側における蛍光強度を定量化するために使用されるROIを示す。グラフィカル画像は、吻側および尾側分析ROIにおける経時的な蛍光強度変化を表す。レーザー病変の3時間後、24時間後、および48時間後のNBT:dsRed幼虫の最大強度投影蛍光画像をここに示す。
損傷後24時間後、創傷は閉じ始め、48時間後に脊髄の初期構造の部分的な回復をもたらした。部分的な機能的再接続は、カルシウムイメージングを用いて傷害後48時間後に確認された。尾部領域と吻側領域におけるスパイクの振幅の比は、損傷後3、24、および48時間の間に増加を示した。
マクロファージリクルートメントは、NBT:dsRedmpeg1 GFP幼虫レーザー病変を用いてレーザー病変後に観察された。手動病変とレーザー病変の間で標識細胞数に差は認められなかった。病変していない魚は、両方の病変条件下で病変した魚よりも少ない二重標識細胞を示した。
レーザー病変は、手動病変よりも少ない筋肉および皮膚損傷を誘発する。病変が完全であるかどうかを確認することが重要です。無傷の細胞または構造は病変領域に見えず、薄暗い背景のみに見えるはずである。
脊髄再生を研究するために、免疫組織化学やカルシウムイメージングなど、多くの方法を使用しています。重要なことに、組織が手動で病変した動物とは対照的に、解剖に耐えることができるので、電気生理学を行うこともできます。この新しい技術により、損傷後の脊髄の構造的および機能的な組織を定量的に研究し、再現性および制御された病変を可能にすることができます。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルでは、レーザー病変システムを用いてゼブラフィッシュ幼魚に組織特異的な損傷を誘導する方法について解説します。本手法により、再現性が向上し、周囲の組織へのダメージを最小限に抑えることが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 再生医療
背景
- 手動による病変作成プロトコルは、意図しない損傷を引き起こす可能性があります。
- 精密な病変作成には、改良された技術が必要です。
- 自動化システムにより、再現性を向上させることができます。
- ゼブラフィッシュは、組織損傷を研究するための有用なモデルです。
研究目的
- ゼブラフィッシュ幼魚において、精密な組織損傷を誘発する方法を開発すること。
- 病変の再現性を向上させること。
- 隣接組織への副次的な損傷を軽減すること。
使用した手法
- ゼブラフィッシュ稚魚の麻酔。
- ハンドリングのためのマイクロ流体プラットフォームの使用。
- 回転ガラスキャピラリーと標的UVレーザーの利用。
- 自動イメージングのためのVASTソフトウェアの操作。
主な結果
- この手法により、病変部位を正確に配置することが可能です。
- 経験の浅いユーザーであっても、再現性が向上します。
- 周囲組織への損傷を最小限に抑えることができます。
- このプロトコルは効率的かつ体系的です。
結論
- この技術は、ゼブラフィッシュ研究における重要な進歩となるものです。
- 組織の修復および再生に関する研究を促進することが可能です。
- 今後の応用により、他のモデル生物への展開が期待されます。
よくある質問
産業上の重要性
ゼブラフィッシュ幼魚における制御されたレーザー誘発脊髄損傷により、CNS（中枢神経系）再生研究に向けた、再現性の高い組織特異的な病変作成が可能になります。この精密な手法により、混入変数が低減され、再生メカニズムの強固かつ定量的な解析が支持され、神経再生パイプラインにおける初期発見およびターゲットバリデーションに直接的な影響を与えます。本手法の再現性と拡張性は、研究間での比較可能性および企業レベルのデータ統合を容易にします。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 脊髄損傷の影響を単離することで、再生経路の精密な解析が可能になります。
- オフターゲット組織への損傷を低減し、機能的なターゲット検証とメカニズムにおけるリスク低減を支援します。
- オペレーター間での再現性の高い病変作成を容易にし、初期段階の研究における予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流の表現型スクリーニングおよび定量アッセイの開発に向けた、標準化された損傷モデルを提供します。
- 自動撮像および病変プロトコルを用いた、ハイスループットで再現性の高いワークフローをサポートします。
- 制御された損傷条件下で、候補化合物または遺伝学的介入の信頼性の高い評価を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患に関連するCNS損傷モデルと整合しており、トランスレーショナルなバイオマーカーの発見を支援します。
- 電気生理学やカルシウムイメージングなどの高度な解析のために、組織の完全性を維持します。
- 一貫性のある定量可能なエンドポイントを可能にすることで、発見から前臨床検証までの連続性を向上させます。
パイプラインおよびワークフローの統合
このレーザー病変プロトコルは、中枢神経系（CNS）再生研究のための再現可能で定量的な損傷モデルを提供することにより、基礎研究から前臨床段階への連続的なプロセスに組み込まれます。
- 探索生物学：制御された組織特異的な損傷を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：化合物または遺伝子スクリーニングに適した、再現性のあるアッセイ準備済みモデルを提供します。
- 分析：堅牢な統計的比較のために、定量的な蛍光および機能的なリードアウトを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：標準化された損傷パラダイムを通じて、バイオマーカーの整合性と前臨床段階の連続性を促進します。
- 組織的な再利用：研究チームや研究間で適応可能な、スケーラブルでオペレーターに依存しないプロトコルを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 中枢神経系（CNS）再生研究における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用的価値： 損傷モデルの標準化、再現性、および拡張性を向上させます。
- 戦略的価値： 実験的なばらつきを最小限に抑えることで、go/no-go判断の質と資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整に基づいた神経再生プログラムの優先順位付けと推進を可能にします。
実施上の考慮事項
- ゼブラフィッシュの取り扱い、レーザー操作、および画像解析の専門知識が必要です。
- 自動画像解析プラットフォーム、標的UVレーザーシステム、および解析ソフトウェアへのアクセスが必要です。
- 病変パラメータおよび画像撮影プロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- さまざまな中枢神経系（CNS）損傷モデルに適応可能ですが、装置の互換性に依存します。
- データの整合性を確保するためには、病変の完全性と組織特異性の検証が極めて重要です。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Sample Preparation and the VAST Software Set Up
2:05
Set Up ImageJ/Fiji for Laser Lesions and the Python IDE
2:53
Performing Laser Lesions on the VAST System
6:29
Results: Laser Lesions as an Alternative Tool to Manual Lesions for Studies on Spinal Cord Regeneration
8:50
Conclusion
