Name: アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学ぶアフィニティークロマトグラフィーを用いたMMP-3の細菌発現と精製法。E. coli R2DP株を活用し、Hisタグ精製と透析により活性型タンパク質を高収率で得る。治療薬開発や他のMMP研究への応用が可能です。

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著者らは、フロリダ州ジャクソンビルのメイヨークリニックのEvette Radisky博士とAlexandra Hockla博士が、Hisx6pro-MMP-3cd遺伝子をクローニングするためのテンプレートとしてpET-3a-pro-MMP-3cdプラスミドを提供したこと、および彼らのコメントを、DNAシーケンシングのためにネバダ大学リノ校のネバダゲノミクスセンターのPaul Hartley博士とともに認めたい。著者らはまた、タンパク質発現の一部を支援してくれたCassandra Hergenrader氏にも感謝したい。M.R.-S.NIH-P20 GM103650-COBRE Integrative Neuroscience GrantとUNR R&D mICRO SEED Grant Awardに感謝します。

<ol><li>Portolano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+for+structural+biology+in+HEK+293F+suspension+cells%3A+A+novel+and+accessible+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568(2015).</li>
<li>Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthogonal+protein+purification+facilitated+by+a+small+bispecific+affinity+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370(2012).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+production+of+soluble+proteins+from+insoluble+inclusion+bodies+by+a+two-step-denaturing+and+refolding+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method.</a> PLoS One. 6 (7), 22981(2011).</li>
<li>Hu, X., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+functional+matrix+metalloproteinases+by+zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445(2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+matrix+metalloproteinase+inhibition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloproteinases+and+their+inhibitors%3A+Potential+for+the+development+of+new+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics.</a> Cells. 9 (5), 1313(2020).</li>
<li>Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+matrix+metalloproteinases+and+TIMPs%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs.</a> Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).</li>
<li>Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+the+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+reveals+that+its+N-+and+C-terminal+domains+cooperate+in+matrix+metalloproteinase+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).</li>
<li>Batra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-10+%28MMP-10%29+interaction+with+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+TIMP-1+and+TIMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).</li>
<li>Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSingh%2C+KK+%22Matrix+Metalloproteases%22">Matrix Metalloproteases</a>. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).</li>
<li>Manka, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+triple-helical+collagen+cleavage+by+matrix+metalloproteinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).</li>
<li>Gomis-Ruth, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+inhibition+of+the+human+matrix+metalloproteinase+stromelysin-1+by+TIMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1.</a> Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).</li>
<li>Shirian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converting+a+broad+matrix+metalloproteinase+family+inhibitor+into+a+specific+inhibitor+of+MMP-9+and+MMP-14%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14.</a> FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+histidine-tagged+catalytic+domain+of+MMP-13+in+one+step+using+affinity+column+and+renaturation+of+it+with+histidine+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Liquid+Chromatography+%26+Related+Technologies%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag.</a> Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).</li>
<li>Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+and+general+expression+platform+for+the+production+of+secreted+proteins+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041(2012).</li>
<li>McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+fusion+construct+enables+high-yield+production+of+soluble%2C+active+matrix+metalloproteinase-8+%28MMP-8%29+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli.</a> Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).</li>
<li>Maity, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GST-His+purification%3A+A+two-step+affinity+purification+protocol+yielding+full-length+purified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320(2013).</li>
<li>Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+benefits+of+protein+co-expression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431(2015).</li>
<li>Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HeLa+based+cell+free+expression+systems+for+expression+of+Plasmodium+rhoptry+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772(2015).</li>
<li>Zeytuni, N., Zarivach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+M.+magneticum+strain+AMB-1+magnetosome+associated+protein+MamA%CE%9441%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844(2010).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

可溶性、ヒト、組換えMMPの大規模生産は依然として困難な課題である。哺乳類細胞は高いコストと長い待ち時間で機能的なMMPを発現することができますが、大腸菌は精製とリフォールディングが必要な大量のMMP封入体を急速に産生します11,16。R2DP細胞はMMP封入体の収量を大幅に増加させ、より費用対効果が高く生産的なMMPリフォールディングプロセスを可能にします。しかし、大腸菌にはMMPを折り畳むために必要な翻訳後機構がなく、操作された株は発現レベルが大幅に改善されたことを示していますが、変性剤の除去時に適切に折り畳まれるのは一部の中間体だけです4。その結果、MMPsの時折の降水は、リフォールディングおよび活性化中に依然として予想される。これらの結果は、精製されたHisx6-pro-MMP-3cd収率のかなりの部分が、リフォールディング、活性化、および脱塩後に失われることを示している。
...

ほとんどの複雑な真核生物タンパク質は、発現後に精巧な翻訳後修飾を受け、高度に支援されたタンパク質の折り畳みと補因子が機能的であることを必要とする1。細菌宿主中で大量の可溶性ヒトタンパク質を生産することは、小規模の実験室実験であっても、高いコストと堅牢な発現および精製方法の欠如のために、依然として大きな課題です2,3。MMPsは、分子量の大きいヒトエンドペプチダーゼであり、大腸菌で発現すると通常不溶性封入体として発現される。可溶性ヒトMMPの抽出は、しばしば面倒で時間のかかる可溶化およびリフォールディングプロセスにつながる4。
MMPは、生理学的および病原性プロセスの両方において重要な役割を果たしている。ヒトMMPは、23個の亜鉛エンドペプチダーゼのファミリーであり、構造および基質特異性によって分類され、高度に保存された触媒ドメインにもかかわらず差動的に発現される5,6。MMPsは、不活性なザイモゲンとして分泌され、翻訳後活性化およびそれらの内因性阻害剤を介して調節される、メタロプロテイナーゼ(TIMP)の組織阻害剤7、8、9、10。MMPは当初、ECMの代謝回転における役割が認識されていましたが、発生、形態形成、組織修復、およびリモデリングにも関与しています8。MMPの調節不全は、神経変性疾患、心臓血管疾患、線維性疾患などとともにがんと顕著に関連しています5,7。
堅牢な大規模MMP生産法の開発は、生化学的および細胞ベースのアッセイによるMMPメカニズムの将来の研究の成功を確実にするために不可欠です。Hisx6タグ付きMMPを含む様々なMMPが、MMP活性を変化させることなく、細菌11において以前に発現されてきた12、13、14、15。ただし、これらの方法には、複製が困難な退屈で長い手順が含まれます。
哺乳類細胞は、適切な翻訳後修飾を確保しながら、多くの異なるヒトタンパク質を発現させるためにも使用できます16。哺乳類の発現系は、適切な翻訳後修飾を有する組換えヒトタンパク質を産生するのに理想的な選択であるが、この方法の主な欠点は、初期の低収量、高価な増殖培地および試薬、安定した発現ラインに到達するまでの長いタイムライン、および真菌または細菌などの他の種による汚染のリスクである2,11。.さらに、哺乳動物細胞株におけるMMP産生は、TIMPまたはフィブロネクチン11などの関連する細胞タンパク質から不純物を生じる。哺乳類細胞で観察される遅い細胞増殖とは異なり、細菌発現系は、より単純な培地および増殖要件とともに、短期間で大規模なタンパク質生産を提供する。しかし、細菌発現系には他の関連する細胞タンパク質(すなわちTIMP)がないため、高濃度の活性MMPは自己タンパク質分解による分解を受け、MMP収率が低下する17。
本稿では、MMPs2,3,18の手頃な価格、単純さ、およびより高い収率の生産に成功しているため、大腸菌を発現宿主として用いた組換えHisx6-pro-MMP-3cdの細菌発現、精製、および活性化の詳細な方法を説明する。大腸菌は組換えMMPやその他の複雑なタンパク質に必要なタンパク質折り畳み機構と翻訳後プロセシングを欠いているため、多くの大腸菌株がこれらの制限を克服するように設計されており、大腸菌は組換えヒトMMP-3cdの発現に適した宿主となっています,19,20。.例えば、本研究で用いたR2DP株は、大腸菌でめったに使用されないコドンを含むクロラムフェニコール耐性プラスミドを供給することにより、真核生物の発現を増強する。
このプロトコールに記載されているように、R2DP細胞においてpET-3aベクター(図1)から比較的純粋な封入体を過剰発現させた後、Hisx6-pro-MMP-3触媒ドメイン(MMP-3cd)タンパク質を抽出し、変性させる4。Hisx6-プロ-MMP-3cd3,19をアフィニティータグクロマトグラフィーを用いて精製した。リフォールディングおよび透析時に、プロMMP-3cd(ザイモゲン)を4-アミノフェニル水銀アセテート(APMA)によって活性化し、SDS-PAGE分析を使用して収率およびさらなる精製の必要性を評価する5,21。このプロトコルは、可溶性MMP-3cdの発現、精製、および活性化を例として記載する。しかしながら、同様の発現、および活性化機構を有する他のMMPsおよびヒトプロテアーゼの発現のためのガイドとしても使用され得る(図2)。MMP-3cd以外の他のタンパク質については、このプロトコールを試みる前に、標的タンパク質に最適なバッファー組成と方法を決定することをお勧めします。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig01.jpg"> 図1:pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cdプラスミドのプラスミドマップ。 このpET-3aベクターは、アンピシリン耐性遺伝子を含む。N末端Hisx6タグ配列をプロMMP-3cdを含むpET-3aベースのベクターにクローニングし、BamHIとNdeI制限部位との間のT7プロモーターの制御下でpET-3a-Hisx6-プロMMP-3cd構築物を作製する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63263/63263fig02.jpg"> 図2:プロMMP-3cdの細菌発現、精製、リフォールディング、および活性化 。 1.1:pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cdプラスミドをBL21(DE3)またはR2DP細胞に形質転換した。2:IPTGを用いてPro-MMP-3cdタンパク質発現を誘導した。1.3:化学溶解および超音波処理は、主に不溶性であり、封入体に見られるHisx6-pro-MMP-3cdタンパク質を抽出するために使用されます。尿素は、封入体からタンパク質を変性および可溶化するために使用された。変性Hisx6-pro-MMP-3cdタンパク質をアフィニティークロマトグラフィー精製により精製した。3. 溶出したHisx6-pro-MMP-3cdは、透析中に緩衝液から尿素を徐々に除去することにより、ゆっくりとリフォールディングした。最後に、リフォールディングされたMMP-3cdタンパク質を、N末端プロペプチドドメインを除去することによってAPMAを用いて活性化した。APMAは、後に脱塩によって溶液から除去される。番号は、これらの手順を説明するプロトコルのセクションに対応しています。略語: MMP-3cd = マトリックスメタロプロテイナーゼ-3触媒ドメイン;APMA=4-アミノフェニル水銀アセテート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63263/63263fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 以上m 滅菌フィルター</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>SLGP033RS</td><td>精製前にタンパク質抽出物から一部の汚染物質を除去し、Ni-NTAカラムが目詰まりするのを防ぐために使用されます</td></tr><tr><td>1 L 三角フラスコ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S76106F</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>1 L ガラス瓶</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-414-1D</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>1.5 mL マイクロチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-682-002</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>15 mLコニカルチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>339650</td><td>n/a</td></tr><tr><td>18 G、1インチ斜め針</td><td>アマゾン</td><td>B07S7VBHM2</td><td>透析カセットと組み合わせて使用</td></tr><tr><td>2 mL脱塩カラム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>89890</td><td>活性化後のAPMAを除去</td></tr><tr><td>2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AAA1610422</td><td>n/a</td></tr><tr><td>250 mL コニカルボトルクッション</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-538-53A</td><td>大容量遠心分離時にコニカルボトルを安定</td></tr>させる <tr><td>250 mL コニカルボトル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-538-53</td><td>該当なし</td></tr><tr><td>400 mL 攪拌セル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UFSC40001</td><td>遠心フィルターユニットよりもはるかに大きな体積を再濃縮します。Rosetta2(DE3)pLysS細胞は、遠心フィルターユニットの15 mL制限を超える可能性のある大量のタンパク質を産生します</td></tr><tr><td>4-アミノフェニル酢酸(APMA)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A9563-5G</td> プロペプチド5 mLシリンジ<td>を切断することによりMMP-3を活性化</td></tr>します <tr><td></td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0829167</td>透<td>析カセット</td></tr><tr><td>50 mLコニカルチューブ</td>と組み合わせて使用 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>339650</td><td>多くの精製ステップでの保存に使用</td></tr><tr><td>50 mL再濃縮チューブ</td><td>シグマ・アルドリッチUFC901024D</td><td></td><td>透析後のタンパク質サンプルの再濃縮や汚染物質の除去に使用</td></tr><tr><td>寒天</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1423-500</td><td>オートクレーブされたLB培地を冷却時に固化させる緩衝成分</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1760-25</td><td>pET3aベクターと併用する抗生物質。100&microで使用。g/mL in LB</td></tr> media <tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td>pET3aベクターと一緒に使用する制限酵素</td></tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl2)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>600-30-23</td><td>カルシウムイオンはMMP構造を安定化させる</td></tr><tr><td>セルスプレッダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-189-7544</td><td>形質転換</td></tr><tr><td>後にペトリ皿全体に細胞を広げるために使用できますChloramphenicol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-055-125GM</td><td>pET3a ベクターと併用する抗生物質; 34 &micro;LB培地</td></tr><tr><td>透析バッファー中の</td>g/mL 1 <td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、150 mM NaCl、10 mM CaCl2、1 & micro;M ZnCl2、4 M尿素。</td></tr><tr><td>透析バッファー 2</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 & micro;M ZnCl2、2 M 尿素。</td></tr><tr><td>透析バッファー 3</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 & micro;M ZnCl<サブ>2</サブ>。</td></tr><tr><td>透析クリップ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>68011</td><td>スネークスキン透析チューブと組み合わせて使用</td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88243</td> はるかに<td>大量のサンプルを保持するが、サンプル損失のリスクが高い代替透析法</td></tr><tr><td>消化バッファー</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>pET3aベクターの分解に使用されるバッファー</td></tr><tr><td>使い捨てキュベット</td><td>サーモフィッシャーScientific</td><td>21-200-257</td><td>成長および発現中の細菌培養ODの測定に使用</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D107125G</td> ジ<td>スルフィド結合DNA</td></tr><tr><td>アセンブリミックス</td><td>NEB</td><td>E2621Sを</td><td>リゲートするために使用 Hisx6-pro-MMP-3cd PCR産物および消化されたpET3aベクトル</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>をライゲーションするために使用されます後でタンパク質精製に影響を与える可能性のある好ましくないDNA汚染物質を分解するためのエンドヌクレアーゼ</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A995-4</td><td>n/a</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>J15694-AE</td><td>変性に使用されます。ジスルフィド結合の酸化とその後の形成を防止</td></tr><tr><td>ゲル回収キット</td><td>プロメガ</td><td>A9281</td><td>アガロースゲルからDNAを分離・精製</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>G33-500</td><td>-80°Cで凍結したグリセロールストックの製造に使用。C</td></tr><tr><td>重力フローカラム</td><td>BioRad</td><td>7321010</td><td>組換えHisタグタンパク質のNi-NTA精製に使用</td></tr><tr><td>高変換効率細胞</td><td>NEB</td><td>C2987</td><td>N末端HisタグをpET3a-pro-MMP-3cdコンストラクト</td></tr>HT<tr><td>溶出バッファーn</td><td>/a</td><td>n/a</td><td>にクローニングするための成功の可能性が高い高変換効率細胞20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、50 mM NaCl、6 M尿素、250 mMイミダゾール。pH を 7.4</td></tr><tr><td>HT Equilibration Buffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、50 mM NaCl、6 M 尿素に調整します。pH を 7.4</td></tr><tr><td>HT Regeneration Buffer</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>20 mM MES, 0.1 M NaCl に調整します。pH を 5.0</td></tr><tr><td>HT Wash Buffer</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、50 mM NaCl、6 M 尿素、25 mM イミダゾールに調整します。pHを7.4に調整</td></tr>します <tr><td>塩酸(HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A144C-212</td><td>pH緩衝液に使用</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AAA1022122</td>ヒ<td>スチジン側基を模倣します。hisタグ付き標的タンパク質</td></tr><tr><td>Inclusion Body Buffer</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、1 mM EDTA、100 mM NaCl、5 mM DTT、2% v/v Triton X 100、0.5 M尿素から非特異的結合タンパク質を分離するために使用されます。pHを8.0</td></tr><tr><td>Isopropyl-&szlig;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>に調整しますサー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FERR0392</td><td>pET3aで標的遺伝子発現を誘導する試薬です。0.5 mL 1 Mアリコートを調製し、フィルター滅菌して-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>LB Amp CamR media</td><td>n/</td><td>a n/a</td><td>1 L ボトルまたは1 Lフラスコに注ぎます。1 Lの場合、25 gのLBブロスを追加します。オートクレーブ滅菌します。50°C未満に冷却したら、C、アンピシリンを100&microに追加します。g / mLおよびクロラムフェニコールから34&micro;g/mL</td></tr><tr><td>LB Amp CamR プレート</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>滅菌シャーレに注ぐ。シャーレの蓋が完全に覆われるまで注ぎます。1Lのメディアは40-60プレートを生成します。1 Lの場合:25 g LBブロス、16 g寒天。オートクレーブ滅菌します。50°C未満に冷却したら、C、アンピシリンを100&microに追加します。g / mLおよびクロラムフェニコールから34&micro;g/mL</td></tr><tr><td>LB</td><td>Broth Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>トリプトン、酵母抽出物、塩化ナトリウムとあらかじめ混合</td></tr><tr>溶解<td>バッファー</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA、100 mM NaCl、0.133 g/mL リゾチーム、0.49% v/v Triton X-100。pHを8.0に調整</td></tr>します <tr><td>リゾチーム</td><td>MP バイオメディカル</td><td>195303</td><td>タンパク質抽出に使用されます。細菌の細胞壁を溶解する酵素</td></tr><tr><td>Miniprepキット</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>成功すれば、形質転換体からpET3a-pro-MMP-3cdコンストラクトを抽出します</td></tr><tr><td>NdeI</td><td>NEB</td><td>R0111S</td><td>pET3a</td></tr><tr><td>ベクターNi-NTA樹脂</td>と一緒に使用する制限酵素 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI88221</td><td>組換えhisタグ付きタンパク質の結合に使用されます。この強い相互作用は、MMP凝集を防ぐために、高濃度のイミダゾール</td></tr><tr><td>非イオン性界面活性剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI28316</td><td>貯蔵用洗剤で置換できます。MMP表面上の疎水性残基と水分子との間の相互作用を最小限に抑え、触媒活性を阻害しません。</td></tr><tr><td>PCRミックス</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>A n末端hisタグをpET3a-pro-MMP-3cdベクターに挿入するためのPCR試薬</td></tr><tr><td>pETプラスミド</td><td>Addgene</td><td>n/a</td><td>pET3aベクターは、アンピシリン耐性、標的遺伝子の誘導性発現、およびT7プライマーによるシーケンシングを提供します</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>LB寒天培地R2DP細胞に形質転換体をプレーティングするために使用されます</td></tr><tr><td></td><td>Novagen</td><td>真</td><td>核生物タンパク質の発現が増強されたBL21誘導体714033。大腸菌SOC増殖培地で希少であることが判明したコドンのtRNAを含む</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>B9020S</td><td>形質転換中の急速増殖のための非選択的増殖培地</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP358-1</td><td>バッファーに使用され、タンパク質の安定性を助け</td></tr>ます <tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI89905</td><td>タンパク質抽出に使用される界面活性剤。細胞壁溶解</td></tr><tr><td>バッファー</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0)、50 mM NaCl、10 mM DTT、6 M 尿素を溶解します。pHを8.0</td></tr><tr><td>トリスベース</td>に調整します <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP152-1</td><td>生理学的pH範囲で使用される一般的な緩衝液。温度感受性</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>M1122980101</td><td>細胞溶解に使用される洗剤</td></tr><tr><td>尿素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AAJ75826A7</td><td>タンパク質の二次構造を破壊する最初のカオトロピック剤</td></tr><tr><td>塩化亜鉛 (ZnCl2)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AAA162810E</td><td>MMP構造を安定化します。亜鉛イオンはMMP-3の触媒部位にあります</td></tr></tbody></table>

アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製

Bacterial Expression and Purification of Human Matrix Metalloproteinase-3 using Affinity Chromatography

マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、細胞外マトリックス(ECM)の分解およびリモデリング、ならびにいくつかの成長因子およびサイトカインとの相互作用において中心的な役割を果たすメチンチンプロテアーゼのファミリーに属する。特定のMMPの過剰発現は、癌、神経変性疾患、および心血管疾患などのいくつかの疾患において責任がある。MMPは、MMPの過剰発現と相関する疾患を治療できる治療法を開発する標的として、近年注目されている。
溶液中のMMPメカニズムを研究するためには、活性で可溶性MMPの生産のために、より容易で堅牢な組換えタンパク質の発現および精製方法が必要である。しかし、ほとんどのMMPの触媒ドメインは、翻訳後機構の欠如のために可溶性形態で 大腸菌 (E. coli)で発現することができないが、哺乳類の発現系は通常高価であり、収率が低い。MMP封入体は、広範な精製およびリフォールディングの退屈で面倒なプロセスを経なければならず、天然の立体構造におけるMMPの収率を著しく低下させる。本稿では、Rosetta2(DE3)pLysS(以下、R2DPという)細胞を用いて、N末端Hisタグとそれに続くプロドメイン(Hisx6-pro-MMP-3cd)を含むマトリックスメタロプロテイナーゼ-3触媒ドメイン(MMP-3cd)を作製するためのプロトコールを提示する。R2DP細胞は、細菌発現系において通常稀なコドンを含むクロラムフェニコール耐性プラスミドを介して真核生物タンパク質の発現を増強する。組換えタンパク質発現に最適な従来の細胞株BL21(DE3)と比較して、この新しい株を用いた精製により、精製Hisx6-pro-MMP-3cdの収率が向上しました。活性化および脱塩時に、プロドメインはN末端Hisタグとともに切断され、無数の インビトロ用途で 即時使用するための活性MMP-3cdを提供する。この方法は、高価な装置または複雑な融合タンパク質を必要とせず、細菌における組換えヒトMMPの迅速な生産を記載する。

SDS-PAGE上でサンプルを実行する場合、タンパク質は不溶性封入体の形で発現されるため、溶解および超音波処理された画分は、タンパク質がまだ尿素に再可溶化されていないため、Hisx6-pro-MMP-3cd抽出物をほとんどまたはまったく含まないはずです。 図3 は、BL21(DE3)細胞およびR2DP細胞からのHisx6-pro-MMP-3cdのHis-tag精製溶出画分を比較したものである。溶出画分は、透析前にBL21(DE3)細胞およびR2DP細胞の両方について別々にプールした。各ステップからの画分は、タンパク質を脱塩した後に実行した(図4)。すべてのHisx6-pro-MMP-3cdサンプルは約30 kDaのバンドを表示し、アクティブなMMP-3cdはHisタグとプロドメインを削除すると約20 kDaのバンドを表示します(図4 および 補足図S1)。
大腸菌...

hisタグの精製、透析、および活性化は、細菌における可溶性で活性なマトリックスメタロプロテイナーゼ-3触媒ドメインタンパク質発現の収率を増加させるために用いられる。タンパク質画分は、SDS-PAGEゲルを介して分析される。

Matrix metalloproteinases (MMPs) belong to the family of metzincin proteases with central roles in extracellular matrix (ECM) degradation and remodeling, ...

この詳細なプロトコールは、他のMMP治療標的に適用することができる、大腸菌における組換えMMP−3触媒ドメインに対する細菌発現の非常に効率的かつ費用対効果の高い方法を記載している。大腸菌は、複雑なタンパク質折り畳みおよび翻訳後プロセシングシステムを欠いている。この方法は、R2DP細胞株を使用して、大腸菌における真核生物タンパク質発現を増強する。特定のMMPの過剰産生は、癌、心臓血管疾患、および神経変性疾患のようないくつかの疾患をもたらす。活性可溶性MMPは、MMP阻害治療薬の開発に必要である。LBアンピシリンクロラムフェニコール耐性プレートからpET His-tagプロMMP-3触媒ドメイン形質転換体の単離コロニーを、摂氏37度で5ミリリットルのLBアンピシリンクロラムフェニコール耐性培地に接種する。各培養物からアリコートを保存し、40%グリセロールストックを調製する。500ミリリットルのLBアンピシリンクロラムフェニコール耐性培地を含む1リットルフラスコに、600ナノメートルで0.05〜0.1の光学密度で一晩培養して接種する。600ナノメートルの光学密度をいくつかの時点で測定し、通常は0.4〜0.6の間に収まるまで3〜4時間測定します。1モルのIPTGストックを用いて培養物を1ミリモルの最終濃度に誘導する。37度振とう機でさらに3〜4時間インキュベートする。細胞を250ミリリットルの円錐形のボトルに入れ、13、000G、摂氏4度で10分間遠心分離し、培養物が完全にペレットになるまで繰り返す。ペレット1グラムあたり3ミリリットルの溶解バッファーを加え、ボルテックスまたはピペッティングによってペレットを再懸濁する。培養物1リットル当たり10重量%重量%のデオキシコール酸ナトリウムを1.25ミリリットル加える。培養物1リットルあたり10マイクロリットルのDNase Iを加える。室温で150RPMで30分間振る。13、000 G、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を捨てる。ペレットを封入体緩衝液の1リットル当たり100ミリリットルの培養液に再懸濁し、上下にピペッティングする。過熱を防ぐために超音波処理中に氷の上にサンプルを保管してください。15秒の6サイクル、5の出力と50%パルスのために各サンプルを超音波処理します。サンプルを13、000Gおよび摂氏4度で10分間遠心分離する。ペレットを確認してください。ペレットがコンパクトな場合は、上清を捨てる。各ペレットを1リットルの培養物および5ミリリットルの可溶化緩衝液から再懸濁する。タンパク質が可溶化できるように、氷上で少なくとも30分間インキュベートする。細胞を摂氏4度で13,000倍Gで10分間遠心分離する。遠心分離後にペレットが形成された場合は、上清を別の50ミリリットルの円錐管に注ぎます。ペレットを、上下にピペッティングすることにより、培養物1リットル当たりさらに5ミリリットルの可溶化緩衝液に再懸濁する。13、000 G、摂氏4度で10分間遠心分離します。次に、上澄み液を引き上げます。ペレットを捨てるか、追加の超音波処理のために摂氏マイナス80度で保管してください。HT洗浄バッファーに対してブランクにし、第1の洗浄画分のA280を記録した。A280がベースラインに近づくまで、他のフラクションで繰り返します。5ミリリットルのHT溶出バッファーを加えてHisタグ付きタンパク質を直ちに溶出させる。HT溶出と標識されたマイクロフュージチューブ内の0.5〜1ミリリットル画分でフロースルーを収集する。溶出画分のA280を測定する。A280が1ミリリットルあたり0.3ミリグラムを超える場合は、HT平衡化バッファーで画分を希釈します。透析チューブ中の溶出したMMP画分を1リットルの透析緩衝液1つに沈め、チューブおよびその内容物をマグネチックスターで摂氏4度で少なくとも8時間撹拌する。1リットルの透析バッファーに2本移し、チューブとその内容物をマグネチックスターで4°Cで少なくとも8時間攪拌する。次に、1リットルの透析バッファー3に移し、チューブとその内容物をマグネチックスターで摂氏4度で8時間以上攪拌する。サンプルを適切な容器に移し、ダイヤルされたMMPとしてラベルを付けます。チューブに沈殿物がないか調べます。MMP当たり1ミリグラムの1ミリリットルアリコート当たり、20ミリモルAPMAを50マイクロリットル加えて、最終APMA濃度を1ミリモルに達する。沈殿物ができたら、最高速度で摂氏4度で10分間遠心分離します。上清を活性化MMPと標識した1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに保存する。沈殿物をAPMA廃棄物のマークの付いた容器に廃棄する。SDS−PAGEは、R2DP細胞におけるBL21 DE3細胞からのHisタグプロMMP−3触媒ドメインのHis−tag精製溶出画分を比較するために実行した。Hisタグ付きMMP触媒ドメインおよびBL21 DE3細胞の最初の8つの溶出画分は、R2DP細胞におけるHisタグ付きMMP触媒ドメインの溶出画分よりも少ないタンパク質を示した。MMP3 CDおよびR2DP細胞の誘導、リフォールディング、濃縮、活性化、および脱塩画分が示されている。活性化すると、活性化されたMMP-3 CDバンドの分子量は約20キロダルトンであり、Hisタグ付きザイモゲンは約30キロダルトンにとどまる。細胞溶解物を遠心分離する場合、ペレットはコンパクトではないかもしれない。それが起こるとき、より超音波処理し、より長く遠心分離する。タンパク質を再濃縮すると、沈殿が生じることがある。可溶化バッファーに溶かし、このプロセスを繰り返します。ここで記載される手順は、最終的にMMP酵素活性の分子機構を理解するために使用することができる活性ヒトMMPsの可溶性発現のための詳細な方法を提供する。FPLCなどの代替タンパク質精製方法を用いて、MMPタンパク質を精製することができる。

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生物化学

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学ぶアフィニティークロマトグラフィーを用いたMMP-3の細菌発現と精製法。E. coli R2DP株を活用し、Hisタグ精製と透析により活性型タンパク質を高収率で得る。治療薬開発や他のMMP研究への応用が可能です。

アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製

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