Name: コヒーレントラマン散乱イメージングを用いた皮膚内の医薬品化合物の可視化と定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 学ぶコヒーレントラマン散乱イメージングによる皮膚内医薬品化合物の可視化と定量法。マウスおよびヒト皮膚組織を用いて、薬物の経皮浸透経路を解析し、標的薬物送達の設計に応用する。

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著者らは、この原稿の議論と校正に対して、エバンス・グループのフォティス・イリオプロス博士とダニエル・グリーンフィールド博士に感謝したい。さらに、著者らはレオ・ファーマからの支援に感謝したいと思います。 図 2 は、 BioRender.com で作成したものです。

<ol><li>Finnin, B., Walters, K. A., Franz, T. J. In vitro skin permeation methodology. In Transdermal and topical drug delivery: principles and methodology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFinnin%2C+B+%22Transdermal+and+topical+drug+delivery%3A+principles+and+practice%22">Transdermal and topical drug delivery: principles and practice</a>. Benson, H. E., Watkinson, A. C. , John Wiley & Sons. Hoboken NJ USA. 85-108 (2012).</li>
<li>Shin, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+road+to+development+of+an+in+vitro+permeation+test+%28IVPT%29+model+to+compare+heat+effects+on+transdermal+delivery+systems%3A+exploratory+studies+with+nicotine+and+fentanyl%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">On the road to development of an in vitro permeation test (IVPT) model to compare heat effects on transdermal delivery systems: exploratory studies with nicotine and fentanyl.</a> Pharmaceutical Research. 34 (9), 1817-1830 (2017).</li>
<li>Hossain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation%2C+characterisation%2C+and+topical+delivery+of+terbinafine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Preparation, characterisation, and topical delivery of terbinafine.</a> Pharmaceutics. 11 (10), 548(2019).</li>
<li>Santos, L. L., Swofford, N. J., Santiago, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+permeation+test+%28IVPT%29+for+pharmacokinetic+assessment+of+topical+dermatological+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">In vitro permeation test (IVPT) for pharmacokinetic assessment of topical dermatological formulations.</a> Current Protocols in Pharmacology. 91 (1), 79(2020).</li>
<li>Iliopoulos, F., Caspers, P. J., Puppels, G. J., Lane, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Franz+cell+diffusion+testing+andquantitative+confocal+Raman+spectroscopy%3A+In+vitro-in+vivo+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Franz cell diffusion testing andquantitative confocal Raman spectroscopy: In vitro-in vivo correlation.</a> Pharmaceutics. 12 (9), 887(2020).</li>
<li>Cordery, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+bioavailability+of+diclofenac+from+locally-acting%2C+dermatological+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Topical bioavailability of diclofenac from locally-acting, dermatological formulations.</a> International Journal of Pharmaceutics. 529 (1-2), 55-64 (2017).</li>
<li>Pensado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratum+corneum+sampling+to+assess+bioequivalence+between+topicalacyclovir+products%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Stratum corneum sampling to assess bioequivalence between topicalacyclovir products.</a> Pharmaceutical Research. 36 (12), 1-16 (2019).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermal+delivery+of+niacinamide-in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Dermal delivery of niacinamide-in vivo studies.</a> Pharmaceutics. 13 (5), 726(2021).</li>
<li>Bodenlenz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+flow+microperfusion+as+a+dermal+pharmacokinetic+approach+to+evaluate+topical+bioequivalence%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacokinetics%22%5BJournal%5D)">Open flow microperfusion as a dermal pharmacokinetic approach to evaluate topical bioequivalence.</a> Clinical Pharmacokinetics. 56 (1), 91-98 (2017).</li>
<li>Eirefelt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+dermal+pharmacokinetics+and+pharmacodymanic+effect+of+soft+topical+PDE4+inhibitors%3AOpen+flow+microperfusion+and+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluating dermal pharmacokinetics and pharmacodymanic effect of soft topical PDE4 inhibitors:Open flow microperfusion and skin biopsies.</a> Pharmaceutical Research. 37 (12), 1-12 (2020).</li>
<li>Stagni, G., O'Donnell, D., Liu, Y. J., Kellogg, J. D. L., Shepherd, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iontophoretic+current+and+intradermal+microdialysis+recovery+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Iontophoretic current and intradermal microdialysis recovery in humans.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 41 (1), 49-54 (1999).</li>
<li>Garcia Ortiz, P., Hansen, S. H., Shah, V. P., Menne, T., Benfeldt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+adultatopic+dermatitis+on+topical+drug+penetration%3A+assessment+by+cutaneous+microdialysis+and+tape+stripping%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Dermato-Venereologica%22%5BJournal%5D)">Impact of adultatopic dermatitis on topical drug penetration: assessment by cutaneous microdialysis and tape stripping.</a> Acta Dermato-Venereologica. 89 (1), 33-38 (2009).</li>
<li>Joshi, A., Patel, H., Joshi, A., Stagni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+applications+of+cutaneous+microdialysis%3A+Continuous%2Bintermittent+vs+continuous-only+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic applications of cutaneous microdialysis: Continuous+intermittent vs continuous-only sampling.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 83, 16-20 (2017).</li>
<li>Kuzma, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+local+bioavailability+of+metronidazole+from+topical+formulations+using+dermal+microdialysis%3A+Preliminary+study+in+a+Yucatan+mini-pig+model%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of local bioavailability of metronidazole from topical formulations using dermal microdialysis: Preliminary study in a Yucatan mini-pig model.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 159, 105741(2021).</li>
<li>Begley, R., Harvey, A., Byer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L.Coherent+anti-Stokes+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">L.Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy.</a> Applied Physics Letters. 25 (7), 387-390 (1974).</li>
<li>Evans, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+imaging+of+tissue+in+vivo+with+video-rate+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemical imaging of tissue in vivo with video-rate coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (46), 16807-16812 (2005).</li>
<li>Hill, A. H., Manifold, B., Fu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+imaging+depth+limit+of+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).</li>
<li>Feizpour, A., Marstrand, T., Bastholm, L., Eirefelt, S., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantification+of+pharmacokinetics+in+skin+with+stimulated+Raman+scattering+microscopy+and+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Label-free quantification of pharmacokinetics in skin with stimulated Raman scattering microscopy and deep learning.</a> Journal of Investigative Dermatology. 141 (2), 395-403 (2021).</li>
<li>Ghosh, B., Reddy, L. H., Kulkarni, R. V., Khanam, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+skin+permeability+of+drugs+in+mice+and+human+cadaver+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of skin permeability of drugs in mice and human cadaver skin.</a> Indian Journal of Experimental Biology. 38 (1), 42-45 (2000).</li>
<li>Nielsen, J. B., Plasencia, I., Sørensen, J. A., Bagatolli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Storage+conditions+of+skin+affect+tissue+structure+and+subsequent+in+vitro+percutaneous+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Storage conditions of skin affect tissue structure and subsequent in vitro percutaneous penetration.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 24 (2), 93-102 (2011).</li>
<li>Barbero, A. M., Frasch, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+frozen+human+epidermis+storage+duration+and+cryoprotectant+on+barrier+function+using+two+model+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of frozen human epidermis storage duration and cryoprotectant on barrier function using two model compounds.</a> Skin Pharmacology and Physiology. 29 (1), 31-40 (2016).</li>
<li>Babu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+various+methods+of+cold+storage+of+skin+on+the+permeation+of+melatonin+and+nimesulide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">The influence of various methods of cold storage of skin on the permeation of melatonin and nimesulide.</a> Journal of Controlled Release. 86 (1), 49-57 (2003).</li>
<li>Skelly, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA+and+AAPS+report+of+the+workshop+on+principles+and+practices+of+in+vitro+percutaneous+penetration+studies%3A+relevance+to+bioavailability+and+bioequivalence%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">FDA and AAPS report of the workshop on principles and practices of in vitro percutaneous penetration studies: relevance to bioavailability and bioequivalence.</a> Pharmaceutical Research. 4 (3), 265-267 (1987).</li>
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<li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+no.+428%3A+Skin+absorption%3A+In+vitro+method%5BTitle%5D)+AND+%22OECD%22%5BJournal%5D)">Test no. 428: Skin absorption: In vitro method.</a> OECD. , (2004).</li>
<li>Saar, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+molecular+imaging+in+vivo+with+stimulated+Raman+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering.</a> Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).</li>
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<li>Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-windowsparse+spectral+sampling+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Multi-windowsparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).</li>
<li>Herkenne, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+methods+for+the+assessment+of+topical+drug+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo methods for the assessment of topical drug bioavailability.</a> Pharmaceutical Research. 25 (1), 87-103 (2008).</li>
<li>Alfonso-Garcıa, A., Mittal, R., Lee, E. S., Potma, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+with+coherent+Raman+scattering+microscopy%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071407(2014).</li>
<li>Osseiran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+monitoring+of+cancer+cell+subpopulations+in+monolayers%2C+3D+spheroids%2C+and+xenografts+using+the+photoconvertible+dye+DiR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Longitudinal monitoring of cancer cell subpopulations in monolayers, 3D spheroids, and xenografts using the photoconvertible dye DiR.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).</li>
<li>Evennett, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kohler+illumination%3A+a+simple+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Kohler illumination: a simple interpretation.</a> Proceedings of the Royal Microscopical Society. 28 (4), 189-192 (1983).</li>
<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of microscopy.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 10 (2), 76(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hunter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matplotlib%3A+A+2D+graphics+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Computing+in+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Matplotlib: A 2D graphics environment.</a> Computing in Science & Engineering. 9 (3), 90-95 (2007).</li>
<li>Wickham, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWickham%2C+H+%22ggplot2%3A+Elegant+Graphics+for+Data+Analysis%22">ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis</a>. , Springer-Verlag. New York. (2016).</li>
<li>Kim, H., Han, S., Cho, Y. S., Yoon, S. K., Bae, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+R+packages%3A%27Non-Compart%27+and+%27ncar%27+for+noncompartmental+analysis+%28NCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+and+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Development of R packages:'Non-Compart' and 'ncar' for noncompartmental analysis (NCA).</a> Translational and Clinical Pharmacology. 26 (1), 10-15 (2018).</li>
</ol>

CLEは、複数の顕微鏡メーカーにライセンス供与されているCARS顕微鏡の特許の発明者です。他のすべての著者は、開示する利益相反はありません。

局所BA/BEの評価は、単一の方法が in vivo cPK を完全に特徴付けることができないため、多面的なアプローチを必要とする研究分野である。このプロトコルは、コヒーレントラマンイメージングに基づく外用医薬品のBA/BEの評価のための方法論を提示する。見落とされがちな最初のポイントの1つは、特に定量透過SRSイメージングの場合、皮膚サンプルがどれほど薄くなければならないかということです。皮膚が厚すぎる場合(すなわち、光が容易に通過できない場合)、SRS検出器によって測定される信号がほとんどまたはまったくないため、 濃度の低いデータが得られます。これらの組織サンプルを適切に調製するには、実験を左右する可能性があるため、注意が必要です。ヌードマウスの耳に関しては、PBSですすぎ、耳に残っている汚れを取り除くためにそれを乾かして撫でる以外に、ほとんど準備は必要ありません。
マウスの耳は、典型的には数百μmの厚さであり、これは透過SRSに最適である。ヒト皮膚試料は、典型的には皮下脂肪を含む厚さ数mmであるが、厚さは皮膚組織の解剖学的供給源およびドナー...

局所薬物製品適用後のcPKを評価するための方法論は、古典的なインビトロ浸透試験(IVPT)研究1,2,3,4,5およびテープストリッピング6,7,8から、オープンフロー微小灌流または皮膚微小透析9,10,11などの追加の方法論に拡大し、12,13,14。治療作用の潜在的に様々な局所部位が、関心のある疾患に応じて存在する。したがって、API が意図したローカル サイトに到達する速度と程度を評価するための、対応する数の方法論が存在する可能性があります。前述の方法論のそれぞれに利点がありますが、主な欠点は、マイクロスケールのcPK情報の欠如(つまり、APIがどこに行き、どのように浸透するかを視覚化できないこと)です。
局所BAおよびBEを推定するために関心のある非侵襲的方法論の1つはCRIであり、これはCARS顕微鏡とSRS顕微鏡の2つのイメージングモダリティに分解することができる。これらのコヒーレントなラマン法は、非線形ラマン効果を介して分子の化学的に特異的なイメージングを可能にする。CRIでは、2つのレーザーパルス列が集束され、サンプル内でスキャンされます。レーザー周波数間のエネルギーの差は、目的の化学構造に固有の振動モードをターゲットに設定するように設定されます。CRIプロセスは非線形であるため、信号は顕微鏡焦点でのみ生成され、組織の3次元薬物動態断層画像化を可能にする。cPKの文脈において、CASは、脂質に富む皮膚構造15の位置などの組織構造情報を得るために用いられてきた。対照的に、SRSは、そのシグナルが濃度と線形であるため、分子濃度を定量するために利用されてきた。エキソビボ皮膚標本の場合、透過モード17においてエピ方向16およびSRSにおいてCASを実施することが有利である。したがって、薄い組織サンプルはSRSシグナルの検出と定量を可能にします。
モデル組織として、ヌードマウスの耳は、軽微な欠点を有するいくつかの利点を提示する。1つの利点は、組織の厚さがすでに〜200〜300μmであり、さらなるサンプル調製を必要としないことである。さらに、いくつかの皮膚層形成は、1つの視野(例えば、角質層、皮脂腺(SG)、脂肪細胞、および皮下脂肪)を通して軸方向に焦点を合わせることによって見られる16,18。これにより、ヒト皮膚サンプルに移動する前の皮膚透過経路の予備的前臨床推定および局所BA推定が可能になります。しかしながら、ヌードマウスモデルは、皮膚構造の違いによるin vivoシナリオへの外挿の困難さなどの限界を提示する19。ヌードマウスの耳は予備的な結果を得るための優れたモデルですが、人間の皮膚モデルはゴールドスタンダードです。in vivo透過動態を正確に再現するための凍結ヒト皮膚の適合性および適用性に関する様々な解説があるが20、21、22、凍結ヒト皮膚の使用は、in vitro API透過動態の評価のための受け入れられた方法である23、24、25.このプロトコルは、マウスおよびヒトの皮膚のさまざまな皮膚層を視覚化し、脂質が豊富な構造と脂質が乏しい構造内のAPI濃度を定量化します。
CRIは、組織内の化合物を特異的に可視化するために多くの分野で利用されてきたが、局所適用された薬物製品のcPKを調査する努力は限られていた。CRIを用いて外用製品の局所BA/BEを評価するには、まず、正確な比較を行うための標準化されたプロトコルが必要です。皮膚への薬物送達にCRIを使用した以前の努力は、データ内の変動性を実証している。これはCRIの比較的新しいアプリケーションであるため、プロトコルを確立することは、信頼性の高い結果を得るために重要です18,26,27。このアプローチは、ラマンスペクトルの生物学的サイレント領域内の1つの特定の波数のみを標的とする。しかし、ほとんどのAPIと不活性成分には、指紋領域内にラマンシフトがあります。これは、指紋領域の組織から生じる固有のシグナルのために、以前は課題を提起していた。最近のレーザーおよび計算の進歩により、この障壁が取り除かれており、これは、ここで提示されたアプローチと組み合わせて利用することもできる28。ここで紹介するこのアプローチは、サイレント領域(2,000-2,300 cm-1)にラマンシフトを持つAPIの定量化を可能にします。これは、薬物の生理化学的特性に限定されず、これは、先に述べたいくつかのcPKモニタリング方法論29について当てはまるかもしれない。
このプロトコルは、厚いヒト皮膚サンプルが厚いサンプルによる光散乱による薬物製品適用後に最小限のシグナルを生成するため、さまざまな調製物の皮膚厚さのサンプル間の変動を低減する必要があります。この原稿の目標は、再現性のある画像化基準を保証する組織調製方法論を提示することです。さらに、CRIシステムは、潜在的な誤差源を低減し、信号対ノイズを最小限に抑えるために、説明どおりにセットアップされています。しかし、本稿では、CRI顕微鏡の指導原理や技術的メリットについては、これまで取り上げてきた30では触れない。最後に、実験の成功または失敗を判断するための結果の解釈を可能にするために、広範なデータ分析手順が検討されます。

<table><tbody><tr><td>Tissue Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autoclavable Biohazard Bags</td><td>FisherBrand</td><td>22-044562</td><td>本文で参照されているように: バイオハザードバッグ https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562&searchType=RAPID&matchedCatNo=22044562</td></tr><tr><td>細胞培養バッファー: Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x</td><td>Corning</td><td>MT21030CV</td><td>本文で参照されているように: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv&searchType= RAPID&matchedCatNo=21-030-cv</td></tr><tr><td>使い捨てメス</td><td>エクセルインターナショナル</td><td>14-840-00</td><td>本文で参照されているように: scalpel https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true</td></tr><tr><td>高精度 45&deg;アングルブロードポイントピンセット/鉗子</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-000-132</td>テキスト<td>で参照されているように:forceps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=</td></tr><tr><td>Kimwipes繊細なタスクワイパー、1層</td><td>Kimberly-ClarkプロフェッショナルKimtechサイエンス</td><td>06-666</td><td>本文で参照されているように: task wiper https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666</td></tr><tr><td>parafilm M Laboratory Wrapping Film</td><td>Bemis</td><td>13-374-12</td><td>本文で参照されているように: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412</td></tr><tr><td>ペトリ皿 (35 mm x 10 mm)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB0875711YZ</td><td>本文中を参照しているように、小さなペトリ皿 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true</td></tr><tr><td>ペトリ皿(60 mm x 15 mm)</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB0875713A</td><td>本文中を参照しているように、大きなペトリ皿 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true</td></tr><tr><td>外科用はさみ</td><td>Roboz</td><td>NC9411473</td><td>本文で参照されているように: はさみ https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC&searchType=RAPID&matchedCatNo=RS-5915SC</td></tr><<tr><td>strong>レーザー/顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>650/60 nm BrightLineシングルバンドバンドパス</td><td>フィルターSemrock</td><td></td><td>テキストで参照されるように:CARSフィルター-CH2振動(645nm / 60nmフィルター)</td></tr><tr><td>コントロールボックスIX2-UCB</td><td>オリンパス</td><td></td>テキスト<td>で参照されるように:コントロールボックス</td></tr><tr><td>D700 / 30m</td><td>クロマ</td><td></td><td>本文中を参照: CARSフィルター - 重水素化バンド https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m</td></tr><tr><td>DeepSee Insight</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>本文中を参照: Laser https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser</td></tr><tr><td>デジタルハンドヘルド光パワーおよびエネルギーメーターコンソール</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>本文で参照されているように: power meter https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td></tr><tr><td>Fluoview ソフトウェア</td><td>Olympus</td><td></td><td>本文で参照されているように: 顕微鏡制御ソフトウェア</td></tr><tr><td>つや消し顕微鏡スライド</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>本文で参照されているように: microscope slides https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446</td></tr><tr><td>FV1000</td><td>オリンパス</td><td></td><td>本文中参照元: 顕微鏡</td></tr><tr><td>インキュベーションチャンバー</td><td>東海ヒット</td><td>GM-800</td><td>本文中参照先: インキュベーションチャンバー</td></tr><tr><td>積分球フォトダイオード パワーセンサー</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>本文中参照先: photodiode https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341</td></tr><tr><td>電源 FV31-PSU</td><td>オリンパス</td><td></td><td>本文で参照されているように:Power Supply</td></tr><tr><td>Precision 4063、80MHzデュアルチャネル関数発生器BK</td><td>精度</td><td></td><td>テキストで参照されているように:関数発生器</td></tr><tr><td>ProScan&ndash;精密顕微鏡の自動化</td><td>先行科学機器</td><td></td><td>本文で参照されているように: stage controller https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation</td></tr><tr><td>SecureSeal Imaging Spacers</td><td>Grace Biolabs</td><td>654004</td><td>テキストで参照されているように: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/</td></tr><tr><td>SRS検出キット</td><td>APE</td><td></td><td>本文中を参照:SRS検出器</td></tr><tr><td>UPLSAPO 20X NA:0.75</td><td>オリンパス</td><td></td><td>本文中を参照:20X Objective https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/</td></tr><tr><td>Lipid/Drug Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;35 mm ディッシュ、No. 0 コーティングなしカバースリップ、ガラス径 14 mm</td><td>MatTek Corporation</td><td>NC9711297</td><td>本文で参照されているように: ガラス底皿 https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297</td></tr><tr><td>綿チップ アプリケーター</td><td>FisherBrand</td><td></td><td>本文で参照されているように: 綿先端アプリケーター</td></tr><tr><td>Distriman Postive Displacement ピペット</td><td>ギルソン</td><td></td><td>テキストで参照されているように: Postive Displacement Pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=</td></tr><tr><td>Distriman Postive Displacement Pipette Tips</td><td>Gilson</td><td></td><td>テキストで参照されているように: Tipsfor pipette https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true</td></tr><tr><td>Data Analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td>オープンソース <td>本文で参照されているように:FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>Jupyter-Lab</td><td>オープンソース</td><td></td><td>本文で参照されているように:JupyterLab https://jupyter.org/</td></tr> <tr><td>Rstudio</td><td>オープンソース</td><td></td><td>テキストで参照されているように:Rstudio https://www.rstudio.com/</td></tr></tbody></table>

コヒーレントラマン散乱イメージングを用いた皮膚内の医薬品化合物の可視化と定量

Visualizing and Quantifying Pharmaceutical Compounds within Skin using Coherent Raman Scattering Imaging

局所製剤適用後の皮膚薬物動態(cPK)は、局所バイオアベイラビリティ(BA)を機構的に理解するために、規制および医薬品開発科学者にとって特に関心のある研究分野となっている。テープストリッピング、真皮微量透析、または真皮開放流微小灌流などの半侵襲的技術はすべて、マクロスケールcPKを定量化する。これらの技術は膨大なcPKの知識を提供してきましたが、コミュニティは細胞レベルでの医薬品有効成分(API)の浸透と浸透に関する機械的な理解を欠いています。 
マイクロスケールcPKに対処するための非侵襲的アプローチの1つは、コヒーレントラマン散乱イメージング(CRI)であり、外因性標識または化学修飾を必要とせずに、内因性分子振動を選択的に標的とする。CRIには、コヒーレント抗ストークスラマン散乱(CARS)と刺激ラマン散乱(SRS)の2つの主要な方法があり、APIまたは不活性成分の高感度かつ選択的な定量を可能にします。CARSは通常、構造皮膚情報を導き出したり、化学的コントラストを視覚化したりするために利用されます。対照的に、分子濃度と直線的なSRSシグナルは、皮膚層別化中のAPIまたは不活性成分を定量するために使用される。 
マウス組織はCRIによるcPKに一般的に利用されてきたが、局所BAおよび生物学的同等性(BE)は、規制当局の承認前にヒト組織において最終的に評価されなければならない。この論文は、局所 BAおよびBE の評価における定量的薬物動態学的CRI研究に使用されるex vivo皮膚を調製および画像化するための方法論を提示する。この方法論は、時間の経過とともにヒトおよびマウスの皮膚内で信頼性が高く再現可能なAPI定量を可能にします。脂質が豊富なコンパートメントおよび脂質が乏しいコンパートメント内の濃度、ならびに経時的な総API濃度が定量化される。これらは、ミクロおよびマクロスケールのBAおよび潜在的にBEの推定に利用される。

イメージングは、実験終了時に組織が軸方向(&lt;10μm)または横方向に有意に移動しなかった場合に成功したと見なされます(図4)。これは、対象のAPIのSRS測定が、定量化が層特異的である初期深さを代表していない場合の即時の指標です。これは、関心のある各XY位置のzスタックをイメージングすることによって軽減され、トレードオフは時間分解能です。凍結皮膚がこれらの研究で使用される場合、APIの浸透および浸透は新鮮な皮膚と比較して迅速であり、製剤適用からイメージングの開始までの最小限の時間が不可欠である。もう1つの考慮事項は、実験に使用された目的です。60倍の対物レンズを使用する場合、単一の視野(FOV)内の平坦なサーフェスを選択するのは比較的簡単です。しかし、20倍の対物レンズの場合、視野ははるかに大きいため、組織調製の重要なステップは、皮膚とガラス底イメージング皿との均一な接触を保証することです。FOV内の元の深さと比較して、平坦なFOVと同様の深さは、肯定的な結果を得るための2つの鍵です。
レーザーの位置合わせは、画像の...

皮膚内の医薬品化合物を視覚化および定量化するためのコヒーレントなラマン散乱イメージング方法論が記載されている。この論文では、皮膚組織調製物(ヒトおよびマウス)および局所製剤の適用、時空間濃度プロファイルを定量化するための画像取得、および局所薬物送達を評価するための予備薬物動態解析について説明する。

Cutaneous pharmacokinetics (cPK) after topical formulation application has been a research area of particular interest for regulatory and drug development ...

この方法論は、コヒーレントラマンイメージングを使用して局所適用された薬物製品を定量するための再現性のある正確な方法を可能にするという点で重要です。他の方法論は、かさばる皮膚薬物動態情報を提供し、一方、この方法論は、薬物の透過経路などのバルクおよびマイクロスケールの皮膚薬物動態情報の両方を提供することができる。可視化・定量化・浸透経路により、特定の経路を念頭に置いた医薬品の開発が目的部位に到達することが可能になります。組織調製は、この方法論の最も困難な部分であることが証明されます。組織は、皮膚を通して読むことができるように十分に薄くなければならない。ヌードマウスの耳皮膚組織の調製を開始するには、安楽死させたヌードマウスを取得し、鉗子および顕微手術ハサミを使用してマウスの耳を除去する。次に、60ミリメートル×15ミリメートルの大きさの大きなペトリ皿に片方の耳を置きます。次に、マウスの耳をPBSで2回すすぎ、毎回タスクワイパーで耳を乾かします。24時間以内に使用する場合は、PBSの耳を2〜8°Cの35ミリメートル×10ミリメートルの小さなペトリ皿に入れます。収穫の24時間後に使用するには、PBSのないペトリ皿に耳を入れ、パラフィルムで皿を覆ってマイナス20°Cの冷凍庫に保管します。生物学的フードの下で作業している間、皮下脂肪がアクセスできるように、角質層側が下を向いた大きなペトリ皿に人間の皮膚組織を置きます。その後、鉗子と顕微手術はさみを使用して皮下脂肪を除去します。皮下脂肪がハサミで除去できなくなったら、10枚の刃の使い捨てメスを皮膚に対して45度の角度で使用し、鉗子で皮膚を静止させながら残りの皮下脂肪を除去します。脂肪が取り除かれたら、人間の皮膚を1センチ×1センチに切断する。脂質イメージングのために、マウス耳の前部を35ミリメートルの番号ゼロの皿のガラス底に向かって向けて配置する。ヒトの皮膚の場合、角質層を伏せて皮膚を配置し、表面層から深層への薬物定量を可能にする。組織がガラス底に集中したら、綿の先端アプリケーターを使用して、皮膚が平らで、ガラス底皿のカバースリップ面と完全に接触していることを確認します。イメージング中の動きを防ぐには、ワッシャーを皮膚の上に置き、刺激ラマン散乱またはSRS透過検出のためにワッシャーの中央穴から組織が見えるようにします。予め決定された用量の製剤を皮膚上にピペットし、次いで手袋をはめた指を用いて製剤を時計回りに30秒間擦る。製剤が透過するまでに割り当てられた時間が経過した後、製剤側がガラス底皿に向かって向くように皮膚を配置する前に、余分な製剤を除去する。次に、顕微鏡制御またはMCソフトウェアをオンにして実験セットアップに進みます。接眼レンズを通して、調整ノブで軸方向の焦点を調整して、組織の焦点が合っていることを確認します。完了したら、ポンプビームとストークスビームの両方のブロックを解除し、ALG1 および ALG2 チャネルが有効になっていることを確認します。SRSフォトダイオードがコンデンサーの上にあることを確認し、MCソフトウェアの[フォーカスx2]をクリックして、CARSおよびSRSチャンネルのスキンを視覚化します。マルチエリアタイムラプスまたはMATLモジュールで、[表示]タブに移動し、[登録済みポイントリスト]をクリックしてイメージングリストを表示します。角質層が特定されたら、軸方向の焦点またはZ焦点をスクロールして、特定の組織層別化を同定する。特定の深さは、角質層、皮脂腺、脂肪細胞、または皮下脂肪などの皮膚内に、脂質同調コントラストを有するライブイメージング中に決定されるように、追加することができる。ただし、深度スタック全体を取得する場合は、XY 位置を追加でき、相対的な Z 位置は無視できます。各スキン層別化に固有の深度をイメージングする場合は、レジスタポイントを選択してMATLキューに追加します。完全な深さスタックの場合は、「集録パラメータ」ウィンドウで「深さ選択機能を持つ各 XY 位置の登録点」をクリックします。次に、MATLモジュールで繰り返し回数を1に設定し、[準備完了]をクリックします。Play 矢印がグレーから黒に変わったら、Play を押して予備脂質スタックのイメージングを開始します。イメージングサイクルが完了したら、ポンプビームとストークスビームの両方をブロックし、レーザーグラフィカルユーザーインターフェイスの波長を、ターゲット波数またはラマン振動に基づいて目的の波長に変更します。手動の時間遅延ステージを調整しながら、先験的に確立された脂質および医薬品有効成分またはAPIを画像化するために同じ電力が使用されるようにします。サイクルの繰り返しの合計数を選択したら、ポンプビームのブロックを解除し、フォトダイオードを使用して電力が目的の電力と一致するかどうかを確認する前に、再生を押してセットポイントの自動イメージングを開始します。次に、皮脂腺脂質画像をフィジーにインポートし、[チャネルの分割]というラベルの付いたボックスにチェックを入れて、ファイルをCARSチャネルとSRSチャネルに分割することで、各皮膚層別化のデータ分析を実行します。関心領域またはROIマネージャを開くには、[分析]、[ツール]、[ROIマネージャ]をクリックします。C が 1 に等しくなるように SRS チャネルを使用して、画像内の皮脂腺をデマーキーし、ROI マネージャーの [T の追加] をクリックしてマーキングを ROI マネージャーに追加します。画像内の各皮脂腺についてこのプロセスを繰り返します。脂質が豊富な領域をマスクするには、各ROIを選択し、[その他]、[または結合]、[追加]タブの順にクリックします。脂質不足の領域をマスクするには、フィジーメニューの長方形ツールを使用して、画像全体の周りに正方形を描画します。ROI マネージャーに地域を追加します。ROIマネージャですべての脂質リッチ領域を選択するROIに加えて、新しく追加された正方形ROIをクリックします。[その他] で [XOR] を選択して脂質不良領域のマスクを生成し、ROI マネージャーに追加します。画像、スタック、ツール、および連結タブの順に移動して、画像を番号順に連結します。または、画像をフィジーにロードし、セットアップページで同様の名前のファイルをグループ化するというオプションを選択して、画像をインポートします。連結された画像をアクティブにしたまま、ROI マネージャに移動して脂質が豊富な領域を選択し、[その他] タブをクリックしてから [マルチメジャー] を選択し、[結果] ウィンドウが表示されるのを待ちます。「結果」ウィンドウから、データをスプレッドシートにエクスポートし、「領域」というタイトルの列を追加して、脂質が豊富な領域をデータの各行に追加します。脂質の外側にあった領域に脂質不良を加える。データを視覚化するには、スプレッドシートを保存してRパッケージggplot2にインポートします。次に、画像を画像数対平均強度の関数としてプロットし、濃度-時間データを推定します。スプレッドシートからインポートされた強度時間データに対して、RStudio で非コンパートメント解析または NCA を 1 つのレイヤーの呼び出しで実行します。完了したら、Jmax メトリックと AUCflux すべてのメトリックをプロットして視覚的に比較します。さらに、実験条件間で統計的比較を行う。代表的な分析は、角質層、皮脂腺、脂肪細胞、ヌードマウス耳皮膚からの皮下脂肪、および角質層、真皮乳頭、およびヒト皮膚からの皮脂腺を描写する。ヌードマウス耳皮膚において、皮脂腺の限られた組織移動は、製剤適用時および適用後120分で腺の同じ組織深さで観察された。皮膚における実質的な組織運動は、薬物適用の120分後にかろうじて見える皮脂腺を示し、元のプロトコルの非効率性を実証した。いくつかの研究では、強度対時間プロファイルは高い初期濃度を示し、続いて濃度が低下し、組織への薬物のさらなる吸収がないことを示した。一方、いくつかの研究は、後に実験期間にわたって減少した強度の上昇を示し、組織へのフラックスが画像化前に最大に達していなかったことを実証した。同じAPIに対する2つの製剤の濃度時間プロファイルのNCA分析は、エトキシエトキシエタノールが、皮膚層に関係なくゲル製剤のそれと比較して拡張されたAPI透過を提供することを示した。同じ製剤間の全暴露分析では、皮膚のより深い層で同様の観察結果が示された。薬物塗布後のヒト皮膚の調製およびガラス底皿への適切な皮膚配置は、実験の成功にとって極めて重要である。ここでの明確な解決策は、この方法論の適合性を実証しました。さらなる研究には、製剤がAPIの浸透と浸透にどのように影響するかを理解するために、クリームなどの市販の製剤が含まれます。

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Research

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Medicine

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コヒーレントラマン散乱イメージングを用いた皮膚内の医薬品化合物の可視化と定量

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