in vivo阻害、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを用いた精母細胞におけるキネシン-7 CENP-Eの機能評価(英語)

減数分裂は真核生物における進化的に保存されたイベントであり、配偶子形成と有性生殖に不可欠です。私たちのプロトコルは、減数分裂と精子形成の研究に効果的な方法を提供します。精母細胞を分析するための一連のプロトコルについて説明しました。

この技術は、減数分裂紡錘体、相同染色体、および精母細胞中の細胞内小器官の観察に適用できます。この方法は、減数分裂の解析、遺伝子編集動物モデルの生成、組織または臓器における遺伝子導入に使用できます。実験者は、腹部手術中に無菌環境を維持し、このプロトコルの温度、時間、および主要な実験条件に注意を払う必要があります。

手順を実演するのは、私の研究室の大学院生である孟飛Xuさんです。GSK923295介在性セントロメアプロテインEまたはCENP-E阻害マウスモデルの構築を開始するには、麻酔をかけたマウスの手足を縛り、ワックストレイに固定します。手術部位を消毒した後、滅菌メスを使用してマウスの腹腔内に5ミリメートルの開口部を作り、続いて滅菌外科用クランプを皮膚に配置します。

次に、滅菌解剖鉗子で精巣上体脂肪パッドを引っ張り、滅菌ピンセットを使用して精巣を見つけます。立体鏡下で滅菌鉗子で精巣を固定した後、10マイクロリットルのRiodineを使用して、10マイクロリットルのGSK923295を最終濃度10マイクロモルで精細管にゆっくりと注入します。完了したら、精巣を腹腔内に押し戻し、テキスト原稿に記載されているように手術部位を縫合します。

採取したマウス精巣の勾配脱水のために、原稿に記載されているように、サンプルを様々な培地中で順次インキュベートします。連続インキュベーション後、組織を埋め込みボックスの底に置き、溶かしたパラフィンをボックスに追加します。パラフィンを完全に固化させるには、サンプルを摂氏4度で6時間冷却します。

その後、サンプルとナイフ表面の間の角度を5〜10度に保ちながら、サンプルをウルトラミクロトームのホルダーに固定します。スライスの厚さを5マイクロメートルに調整し、ウルトラミクロトームを使用して5マイクロメートルの厚さの切片を調製します。調製したら、サンプルスライドを摂氏40度の水浴に広げてから、スライドドライヤーで切片を摂氏37度で12時間乾燥させます。

12時間後、前述のようにスライドの順次インキュベーションを実行します。次に、スライドを蒸留水で5分間すすぎ、続いてメイヤーのヘマトキシリン溶液で室温で6分間染色します。次に、染色したスライドを流水で5分間すすぎ、蒸留水で2分間インキュベートします。

スライドを1%エタノール塩酸塩中で3秒間インキュベートし、次にすすぎ、水を2分間流します。サンプルを1%エオシンで15秒間染色した後、連続インキュベーションします。完了したら、15マイクロリットルのニュートラルガムと24 x 50ミリメートルのカバーガラスを使用してスライドを密封します。

免疫蛍光法の場合は、スライドを抗原賦活化液に入れ、圧力鍋で高圧下で4分間煮沸して抗原賦活化を行います。次に、スライドを室温まで自然に冷却してから、蒸留水で5分間、PBSで5分間2回すすぎます。細胞を透過させるには、500マイクロリットルの0.25%Triton X-100中でスライドをPBS中で10分間インキュベートし、次にスライドをPBSで5分間3回すすぎます。

抗原ブロッキングのために、サンプルを300マイクロリットルの3%ウシ血清アルブミンまたはBSAとともに1時間インキュベートし、一次抗体を3%BSA中のPBSTで摂氏4度で16時間インキュベートします。インキュベーション後、スライドを加湿した箱に入れて、組織が乾かないようにします。スライドを室温まで30分間自然に温め直します。

一次抗体を廃棄し、続いてスライドをPBSTで5分間3回リンスした。二次抗体を3%BSAおよびPBSTで希釈します。次に、サンプルを希釈した二次抗体とともに摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。

サンプルをPBSTで5分間5回リンスした後、核を50マイクロリットルのDAPIで室温で5分間染色します。カバースリップをフェード防止封入剤で取り付け、カバースリップをマニキュアで密封します。フローサイトメトリーでは、マウスの精巣を6cmのシャーレに採取し、外科用ハサミで1立方ミリメートルに切断します。

次に、精巣を1ミリリットルの1%コラゲナーゼで1.5ミリリットルの遠沈管で摂氏37度で10分間消化します。精子形成細胞を沈殿させるには、サンプルを1, 000 Gで5分間遠心分離し、上清を捨ててから、1ミリリットルの0.25%トリプシンEDTA溶液をサンプルに37°Cで20分間加えます。その後、サンプルを1, 000 Gで5分間遠心分離します。

上清を捨てて、沈殿した細胞を1ミリリットルの70%冷エタノールで摂氏4度で8時間以上インキュベートします。1, 000 Gで5分間遠心分離した後、細胞沈渣を収集し、精子形成細胞を500マイクロリットルのヨウ化プロピジウムまたはPI染色溶液で摂氏37度で30分間染色します。インキュベーション後、300メッシュスクリーンを使用してサンプルをろ過し、細胞の破片を除去し、細胞をフローチューブに集めて細胞を摂氏4度で保存します。

フローサイトメーターを使用して、488ナノメートルの励起波長での蛍光シグナルと光散乱を検出します。ModFit MF LT 32ソフトウェアを使用して、サンプル中のDNA含有量と光散乱を分析します。GSK923295の精巣注射後、精子細管ではCENP-E阻害により精子形成波が変化した。

しかしながら、精細管における精子形成波は規則的であり、対照群において組織化された。いくつかの相同染色体は、CENP-E阻害後に赤道板で整列していないことが観察されました。さらに、CENP-E阻害は、精細管における中期I精母細胞の増加をもたらした。

免疫蛍光分析は、CENP-E阻害後に精細管あたりの抗シナプトン複合体タンパク質3またはSYCP3陽性細胞の数の減少を示しました。一方、中期細胞あたりのSYP3ドットと細胞あたりのSYP3ストレッチは、GSK92395群で影響を受けませんでした。中期I精母細胞における紡錘体極の距離は、CENP-E阻害により増加した。

代表的な分析は、CENP-E阻害が対照と比較してGSK 923295群の一倍体細胞の減少をもたらしたことを示しています。二倍体細胞と異数性細胞の比率は、CENP-E阻害後に有意に影響されませんでした。逆に、四倍体細胞の比率は、対照群よりもGSK923295群で増加した。

精子形成細胞の透過型電子顕微鏡分析は、GSK923295群の精子形成細胞の破壊された組織を示した。実験者は、腹部手術および精巣注射中の注射位置、薬物投与量、注射方法、および縫合方法に注意を払う必要があります。この技術は、標的タンパク質に焦点を当てたin vivoエレクトロポレーションおよび遺伝子編集ツールとともに、縮瞳分裂および精子形成の分野で使用することができる。