Name: in vivo阻害、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを用いた精母細胞におけるキネシン-7 CENP-Eの機能評価(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 学ぶ、マウス精母細胞におけるCENP-E阻害による減数分裂と染色体整列への影響を評価する方法。免疫蛍光法とフローサイトメトリーによりゲノム安定性を解析し、男性生殖生物学の理解に貢献します。

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有益な議論をしてくれた福建医科大学の細胞骨格研究室のすべてのメンバーに感謝します。フローサイトメトリーの技術支援をしてくださった福建医科大学公共技術サービスセンターのJun-Jin Linに感謝します。福建医科大学公共技術サービスセンターの電子顕微鏡研究所のMing-XiaWu氏とLin-Ying Zhou氏に、電子顕微鏡の技術支援に感謝します。福建医科大学基礎医学実験教育センターのSi-Yi Zheng、Ying Lin、Qi Ke、Jun Songの支援に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号82001608)、中国福建省自然科学財団(助成金番号2019J05071)、福建省健康技術プロジェクト(助成金番号2018-1-69)、福建医科大学科学研究スタートアップ基金(助成金番号2017XQ1001)、福建医科大学高レベル人材科学研究スタートアップ資金プロジェクト(助成金番号XRCZX2017025)、研究プロジェクト漢方薬大学院生のオンライン教育と教育(助成金番号B-YXC20200202-06)。

すべての動物実験は、福建医科大学の動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました(プロトコル番号SYXK 2016-0007)。すべてのマウス実験は、国立衛生研究所の実験動物のケアと使用の関連ガイドライン(NIH出版物番号8023、改訂1978)に従って実施されました。
1. GSK923295を介したCENP-E阻害マウスモデルの構築
<ol><li>手術器具を121°Cで30分間滅菌します。外科用ウルトラクリーンワークベンチに紫外線C(UVC)を2時間照射します。実験に用いた3週齢の雄性ICR(がん研究所)マウスの体重を測定し、必要な麻酔薬の投与量を計算します。</li>
	<li>ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の組み合わせを腹腔内注射で投与することにより、マウスに麻酔をかけます。マウスの角膜反射、侵害受容反射、呼吸、および筋緊張の組み合わせを通じて、マウスの麻酔の深さを確認します。マウスが深く麻酔されていることを確認します。 注意: 動物を加熱パッドの上に置いて、手術中に熱サポートを提供します。</li>
	<li>マウスの手足を縛り、ワックストレイに固定します。麻酔下での乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を一滴置きます。マウスの腹毛を下腹部から陰嚢にかけて実験動物のカミソリを用いて剃る。滅菌ドレープで手術部位を固定します。</li>
	<li>腹側の腹部をベタジンスクラブで消毒し、続いて75%エタノールを3回消毒します。滅菌メスを使用して腹腔を開き、<5 mmの開口部を作ります。</li>
	<li>滅菌外科用クランプで皮膚をクランプし、滅菌解剖鉗子で精巣上体脂肪パッドを引っ張って、滅菌ピンセットを使用して精巣を見つけます。ステレオスコープ下で滅菌鉗子で精巣を固定し、10 μLのレオダイン30を使用して、10 μLのGSK923295を精細管に最終濃度10 μMでゆっくりと注入します。対照群の構築のために、10 μLの1%DMSO(ジメチルスルホキシド)/ PBS(リン酸緩衝生理食塩水)溶液を注入します。 注意: GSK923295溶液は-80°Cで10mMの濃度で保管してください。 0.1 μLの10 mM GSK923295を100 μLのPBS溶液に溶解し、10 μMのGSK923295溶液を調製します。</li>
	<li>滅菌手術用鉗子で精巣を腹腔内にそっと押し戻します。直径0.1 mmの縫合線を使用して、腹膜と皮膚を2〜4針で別々に縫合します。</li>
	<li>腹部手術後、動物の背中にある3 x 3 mmの場所に永久マーカーを付け、マウスを給餌ケージに戻し、十分な食物と水で清潔で病原体のない環境を確保します。</li>
	<li>ろ過された空気、滅菌された食品、および水を通して環境を無菌状態に保ちます。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物の世話をします。術後鎮痛のために、ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)の用量を12時間ごとに3日間皮下投与します。.完全に回復するまで、マウスが他の動物の会社に戻されないようにします。 注:マウスは術後ケアを受け、必要に応じて術後の痛みを軽減するために0.5%リドカインを使用して創傷局所麻酔を適切に行います。</li>
</ol>2.ヘマトキシリン-エオジン(HE)染色と組織病理学
<ol><li>腹部手術の4日後、CO2チャンバー内で2L/minの流速でCO2でマウスを安楽死させる。安楽死の確認方法としての子宮頸部脱臼による死亡の確認。外科用ハサミを使用して陰嚢を開き、鉗子で精巣を取り除きます。注射の4日後にマウスの精巣を採取しGSK923295 30 mLの10%ホルムアルデヒド溶液に室温で12時間固定します。</li>
	<li>グラジエント脱水のために、サンプルを40 mLの70%エタノール中で1時間、40 mLの85%エタノール中で1時間、40 mLの95%エタノール中で1時間、および40 mLの100%エタノール中で1時間順次インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを40 mLのキシレン中で40分間インキュベートした後、40 mLのパラフィン中で65°Cで1時間インキュベートします。 埋め込みボックスの底にティッシュを置きます。溶かしたパラフィンを埋め込みボックスに入れます。組織を冷却して、4°Cで6時間完全に固化させます。</li>
	<li>サンプルをウルトラミクロトームのホルダーに固定し、サンプルとナイフ表面の間の角度を5〜10°に保ち、スライスの厚さを5μmに調整します。ウルトラミクロトームを用いて厚さ5μmの切片を調製し、40°Cの水浴中でスライドを広げ、スライド乾燥機で切片を37°Cで12時間乾燥させた。</li>
	<li>スライドを200 mLのキシレン中で40分間、200 mLの100%エタノール中で6分間、200 mLの95%エタノール中で2分間、200 mLの90%エタノール中で2分間、200 mLの80%エタノール中で2分間、および200 mLの70%エタノール中で2分間インキュベートします。 それぞれ。</li>
	<li>スライドを蒸留水で5分間すすぎ、メイヤーのヘマトキシリン溶液で室温で6分間染色します。 注:メイヤーのヘマトキシリン溶液:0.011 mol / Lヘマトキシリン、6.7%無水エタノール、0.646 mol / L硫酸アルミニウムカリウム、および0.003 mol / Lヨウ素酸ナトリウム。</li>
	<li>スライドを流水で5分間すすぎ、蒸留水で2分間インキュベートします。</li>
	<li>スライドを1%塩酸エタノール中で3秒間インキュベートし、流水で2分間すすぎます。</li>
	<li>サンプルを1%エオジンで15秒間染色し、95%エタノールで5秒間、100%エタノールで2分間、キシレンで40分間インキュベートします。</li>
	<li>15 μLの中性ガムと24 x 50 mmのカバーガラスを使用してスライドを密封します。</li>
</ol>3. 免疫蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡
<ol><li>免疫蛍光のためにマウス精巣の厚さ5 μmのパラフィン切片を収集します。スライドをキシレン中で40分間、100%エタノール中で6分間、95%エタノール中で2分間、90%エタノール中で2分間、80%エタノール中で2分間、および70%エタノール中で2分間インキュベートする。スライドを蒸留水で5分間すすぎ、スライドを0.01 M PBSで5分間すすぎます。</li>
	<li>スライドを抗原賦活化溶液(0.01 Mクエン酸緩衝液)に入れ、圧力鍋を使用して高圧下で4分間煮沸して抗原賦活化を行います。スライドを室温まで自然に冷却します。蒸留水で5分間2回、PBSで5分間すすぎます。 注:0.01 Mクエン酸緩衝液(pH 6.0):2.1 mmol / Lクエン酸、11.6 mmol / Lクエン酸三ナトリウム二水和物。</li>
	<li>スライドを500 μLの0.25%TritonX-100/PBS中で10分間インキュベートすることにより、細胞を透過させます。スライドをPBSで5分間3回すすぎます。</li>
	<li>抗原ブロッキングのために、サンプルを300 μLの3%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBST(PBS中の0.1%Tween-20)で1時間インキュベートします。一次抗体を含むサンプルを3%BSA/PBST中、4°Cで16時間インキュベートします。 スライドを加湿した箱に入れて、組織が乾かないようにします。スライドを室温まで30分間自然に温め直します。</li>
	<li>一次抗体を廃棄し、スライドをPBSTで5分間3回すすぎます。二次抗体を3%BSA/PBSTで希釈します。サンプルを二次抗体とともに37°Cで1〜2時間インキュベートします。 サンプルをPBSTで5分間5回すすぎます。</li>
	<li>核を50 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で室温で5分間染色します。カバーガラスをフェード防止封入剤で取り付け、カバーガラスをマニキュアでシールします。</li>
	<li>NA 40x/ 0.75対物レンズを備えた蛍光顕微鏡を使用して、スライド内の蛍光シグナルを観察および記録します。</li>
</ol>4. フローサイトメトリー
<ol><li>マウスの精巣を6cmのシャーレに集め、外科用ハサミで精巣を1mm3 個に切断する。</li>
	<li>1 mLの1%コラゲナーゼ1 mLを1.5 mLの遠沈管で37°Cで10分間消化した後、サンプルを1,000 x g で5分間遠心分離して精子形成細胞を沈殿させます。</li>
	<li>上清を捨て、0.25%トリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)溶液1 mLを37°Cで20分間加えた後、サンプルを1,000 x g で5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を捨て、沈殿した細胞を1 mLの70%冷エタノールで4°Cで8時間以上インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを1,000 x g で5分間遠心分離し、細胞沈渣を収集します。精子形成細胞を500 μLのヨウ化プロピジウム(PI)染色溶液(50 μg/mL PI、100 μg/mL RNase A、0.2% Triton X-100 PBS溶液)で37°Cで30分間染色します。 注意: 細胞凝集を避けるために、5分ごとに遠沈管を静かに振ってください。</li>
	<li>300メッシュスクリーンを使用してサンプルをろ過し、細胞の破片を取り除きます。細胞をフローチューブに集め、4°Cで保存します。</li>
	<li>フローサイトメーターを用いて励起波長488 nmの蛍光シグナルと光散乱を検出します。モッドフィットMFLT32ソフトウェアを使用してDNA含有量と光散乱を分析します。</li>
</ol>5. 透過型電子顕微鏡
<ol><li>鋭利なメスを使用して精巣を1 mm 3個に切断し、微細構造の変化を避けるために、サンプルを0.1 M PBS(pH 7.2)中の3 %グルタルアルデヒド-1.5%パラホルムアルデヒド溶液で4°Cで4時間インキュベートします。サンプルを0.1 M PBSで5分間3回すすぎます。 注意: メスとはさみは鋭利である必要があり、人工的な圧迫や引っ張りを避けるようにしてください。サンプルの処理は固定液中で行わなければならない。</li>
	<li>サンプルを1%オスミン酸-1.5%フェロシアン化カリウム溶液に4°Cで1.5時間固定します。ろ紙で水を乾燥させ、サンプルを0.1 M PBSで5分間3回すすぎます。</li>
	<li>サンプルを40 mLの50%エタノール中で4°Cで10分間脱水します。 サンプルを40 mLの70%エタノール飽和酢酸ウラン色素中で4°Cで12時間、40 mLの90%エタノール中で4°Cで10分間、40 mLの90%エタノールアセトン中で室温で10分間、および40 mLの無水アセトン中で室温で10分間3回インキュベートします。</li>
	<li>サンプルを無水アセトン-エポキシ樹脂618包埋剤(v / v = 1:1)混合物中で1.5時間インキュベートし、次にサンプルをエポキシ樹脂618包埋剤に35°Cで3時間包埋しました。</li>
	<li>樹脂重合の場合は、サンプルをエポキシ樹脂618包埋剤中で35°Cで12時間、45°Cで12時間、次に60°Cで24時間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルとガラスナイフを取り付けてから、サンプルとナイフの間の距離を調整します。極薄ミクロトームを用いて厚さ90 nmの超薄切片を作製します。サンプルを一定の速度でスライスし、スライドをニッケルメッシュ上に置きます。スライドを室温のペトリ皿に入れる。</li>
	<li>スライドを2%酢酸ウラニルで10分間染色した後、サンプルを2%クエン酸鉛で10分間染色します。スライドを蒸留水ですすいでください。スライドを室温で24時間乾燥させる。</li>
	<li>スライドを観察し、透過型電子顕微鏡を用いて70-100kVで電子像を記録します。</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

本研究では、腹部手術とGSK923295のマイクロインジェクションを用いて、マウス精巣の in vivoCENP-E阻害モデルを確立しました。本研究で用いた腹部手術と精巣注射法には、以下のような利点があります。第一に、マウスの年齢に限定されない。実験者は、早期に、例えば3週齢以下のマウスで精巣注射を行うことができる。第二に、GSK923295はCENP-Eに対して特異的かつ優れた阻害効果を有する。第三に、この方法は操作が簡単で再現性が高いです。さらに、精巣の完全性が維持され、これは臓器の状況における無傷組織の研究に適している。
このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。例えば、術後感染症31の予防のためには腹部手術中に無菌環境を維持することが重要である。さらに、異なる年齢または異なる実験動物のマウスについては、精巣の大きさおよび薬剤の有効性に応じて注射量を適宜調整すべきである19,32。さ...

減数分裂は、真核生物における最も重要で、非常に剛性が高く、進化的に保存されたイベントの1つであり、配偶子形成、有性生殖、ゲノムの完全性、および遺伝的多様性に不可欠です1,2,3。哺乳類では、生殖細胞は、DNA複製の1ラウンド後に、減数分裂IおよびIIの2つの連続した細胞分裂を受ける。有糸分裂の姉妹染色分体とは異なり、重複した相同染色体はペアになり、減数分裂Iの間に2つの娘細胞に分離します4,5。減数分裂IIでは、姉妹染色分体が引き離されて分離し、DNA複製のない一倍体配偶子を形成します6。紡錘体アセンブリの欠陥や染色体の誤分離など、2つの減数分裂のいずれかの間違いは、配偶子の喪失、不妊または異数性症候群を引き起こす可能性があります7,8,9。
蓄積された研究は、キネシンファミリーモーターが有糸分裂細胞と減数分裂細胞の両方で染色体の整列と分配、紡錘体集合、細胞質分裂、および細胞周期の進行の調節に重要な役割を果たすことを示しています10,11,12。キネシン-7 CENP-E(セントロメアプロテインE)は、染色体会議、染色体輸送と整列、および有糸分裂13,14,15,16,17,18における紡錘体集合チェックポイントの調節に必要なプラスエンド指向性動原体モーターです。減数分裂の間、特異的阻害剤によるCENP-E阻害GSK923295、精子形成細胞の細胞周期停止、染色体ミスアライメント、紡錘体解体、およびゲノム不安定性につながります19。分裂する精母細胞のセントロメアにおけるCENP-Eの局在パターンとダイナミクスは、CENP-Eが減数分裂中のセントロメアの連続的な集合のために動原体タンパク質と相互作用することを示していますI20,21。卵母細胞では、CENP-Eは染色体の整列と減数分裂Iの完了に必要です13、22、23。CENP-Eの抗体またはモルホリノ注射は、染色体の不整列、異常な動原体の配向、およびマウスおよびショウジョウバエ卵母細胞の両方における減数分裂I停止をもたらす23。有糸分裂におけるCENP-Eの本質的な役割と比較して、減数分裂におけるCENP-Eの機能とメカニズムはほとんど不明のままです。CENP-Eの染色体会議における詳細なメカニズムと雄減数分裂細胞におけるゲノム安定性は、まだ明らかにされていません。
精子形成は複雑で長期にわたる生理機能プロセスであり、連続的な精原細胞の増殖、減数分裂、精子形成が含まれます。したがって、プロセス全体を哺乳動物および他の種においてインビトロで再現することは極めて困難である24、25。インビトロでパキテン期以降の精母細胞分化を誘導することは不可能である。雄減数分裂に関する研究は、一般に、初期減数分裂前期の実験的解析に限定されてきた25,26。精母細胞の短期培養27,28や臓器培養法25など、多くの技術的努力にもかかわらず、男性の減数分裂を研究するための効果的な方法はほとんどありません。さらに、必須遺伝子の遺伝的欠失は、通常、発生停止と胚致死をもたらします。例えば、CENP-Eを欠くマウス胚は着床に失敗し、過去の着床を発達させることができず29、これは減数分裂におけるCENP-Eの機構的研究における障害となっている。まとめると、男性減数分裂を研究するための実用的で実行可能なシステムを確立することは、減数分裂の研究分野を大いに促進することができます。
小細胞透過性阻害剤は、細胞分裂および発生過程におけるキネシンモーターを研究するための強力なツールです。アロステリック阻害剤であるGSK923295は、CENP-Eモータードメインに特異的に結合し、ADP(アデノシン二リン酸)の放出をブロックし、最終的にCENP-Eと微小管との間の相互作用を安定化させる30。この研究では、 in vivo 阻害マウスモデルが、腹部手術と精巣注射によって提示されます GSK923295。CENP-E阻害は、初代精母細胞の中期Iにおいて染色体のミスアライメントをもたらす。さらに、CENP-E阻害は、精母細胞の減数分裂停止および精子形成の破壊をもたらす。精母細胞の分析には一連のプロトコルが記載されており、精母細胞における減数分裂紡錘体微小管、相同染色体、および細胞内小器官の観察に適用できます。私たちの in vivo 阻害法は、減数分裂と精子形成の研究に効果的な方法です。

<table><tbody><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1 ml シリンジ</td><td>いくつかの市販ブランドが利用可能</td><td></td><td>滅菌済み。</td></tr><tr><td>1.5 mL 遠心分離機チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心分離機チューブ</td><td>コーニング</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>6 cm ペトリ皿</td><td>コーニング</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10009164</td><td></td></tr><tr><td>チューブリンウサギポリクローナル抗体</td><td>Beyotime</td><td>AF0001</td><td>免疫蛍光アッセイ用。1:100で使用します。</td></tr><tr><td>ウサギ抗ヒストンH3(リン酸化S10)モノクローナル抗体</td><td>Abcam</td><td>ab267372</td><td>免疫蛍光アッセイ用。1:100で使用します。</td></tr><tr><td>ウサギ抗TUBA4Aポリクローナル抗体</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110022</td><td>免疫蛍光アッセイ用。1:100で使用します。</td></tr><tr><td>抗SYCP3ウサギモノクローナル抗体</td><td>Abcam</td><td>ab175191</td><td>免疫蛍光アッセイ用。1:100で使用します。</td></tr><tr><td>接着顕微鏡スライド</td><td>CITOTEST</td><td>188105</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibody</td><td>Beyotime</td><td>A0423</td><td>Sencodary antibody.1:500で使用します。</td></tr><tr><td>アルミニウム カリウムの硫酸塩</td><td>Sinopharmの化学試薬Co.、株式会社</td><td>10001060</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>Sinopharmの化学試薬Co.、株式会社</td><td>100092690</td><td></td></tr><tr><td>反退色封入媒体</td><td>Beyotime</td><td>P0131</td><td>蛍光信号のphotoblechingを防ぐ。</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>69003435</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5424BK745380</td><td></td></tr><tr><td>クロラール水和物</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>80037516</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>上海実験試薬Co., Ltd</td><td>122670</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Sangon Biotech</td><td>A004194-0100</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>CITOTEST</td><td>10212020C</td><td>20 &times; 20 mm. 厚さ 0.13-0.16 mm.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>染料</td><td></td><td>91347802</td><td></td>バット</tr><tr><td>Eosin Y、アルコール可溶</td>性<td>Sinopharm化学試薬Co.、Ltd</td><td>71014460</td><td></td></tr><tr><td>エーテル</td><td>Sinopharm化学試薬Co.、Ltd 10009318</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド-水溶液</td><td>Sinopharm化学試薬Co.、Ltd</td><td>10010018</td><td></td></tr><tr><td>GSK923295</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10299</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン、無水</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>71020784</td><td></td></tr><tr><td>ICR マウス</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J software</td><td>National Institutes of Health</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td> <td>Fluorescent image analysis.</td></tr><tr><td>ライカウルトラミクロトーム</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカEM UC-7 ウルトラミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Modfit MFLT32</td><td>Verity Software House</td><td></td><td>フローサイトメトリー結果の解析用。</td></tr><tr><td>マニキュア</td> 利用可能な<td></td><td></td><td>いくつかの商用ブランド</td></tr><tr><td>中性ガム</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-S2 顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>Ti-S2</td><td></td></tr><tr><td>ピクリン酸</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>J60807</td><td></td></tr><tr><td>Rheodyne</td><td>Sangon Biotech</td><td>F519160-0001</td><td>10 &mu;l rheodyne</td></tr><tr><td>スライスされたパラフィン</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>69019461</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素酸ナトリウム</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>80117214</td><td></td></tr><tr><td>手術器具</td> 腹部手術のために利用できる<td></td><td>いくつかの商業ブランド</td><td>。121°で滅菌します。C、20分</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム二水和物</td><td>上海実験試薬有限公司</td><td>173970</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd</td><td>30188928</td><td>滅菌PBSで希釈して0.25%の作業溶液を作ります。</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.、Ltd</td><td>30189328</td><td>滅菌PBSで希釈して0.1%の作業溶液を作ります。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sinopharmの化学試薬Co.、株式会社</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Sinopharmの化学試薬Co.、株式会社</td><td>10023418</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo阻害、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを用いた精母細胞におけるキネシン-7 cenp-eの機能評価(英語)

Functional Assessment of Kinesin-7 CENP-E in Spermatocytes Using In Vivo Inhibition, Immunofluorescence and Flow Cytometry

真核生物では、減数分裂は有性生殖におけるゲノムの安定性と遺伝的多様性に不可欠です。精巣の精母細胞の実験的解析は、雄減数分裂における紡錘体集合と染色体分配の研究に重要です。マウス精母細胞は減数分裂の機構研究に理想的なモデルですが、精母細胞を分析するための効果的な方法が不足しています。本論文では、マウス精母細胞におけるキネシン-7 CENP-Eのin vivo阻害のための実用的かつ効率的な方法が報告されています。3週齢のマウスにおける腹部手術による特異的阻害剤の精巣注射GSK923295詳細な手順が提示される。さらに、ここでは、組織採取および固定、ヘマトキシリン-エオジン染色、免疫蛍光法、フローサイトメトリーおよび透過型電子顕微鏡法のための一連のプロトコルについて説明する。ここでは、男性の減数分裂を研究するための強力な手法となる可能性のある、腹部手術と精巣注射によるin vivo阻害モデルを紹介します。また、CENP-E阻害が減数分裂I期の初代精母細胞における染色体のずれと中期停止をもたらすことを実証します。私たちのin vivo阻害法は、減数分裂の機構研究を容易にし、雄生殖系列の遺伝子改変に有用な方法として役立ち、将来の臨床応用に光を当てます。

我々は、GSK92329519の腹部手術と精巣注射によるマウス精巣のin vivo CENP-E阻害モデルの構築に成功しました。この方法の主要な技術的ステップを図1に示します。GSK923295の精巣注射を4日間行った後、さらなる分析のために精巣を採取した。対照群では、精細管における精子形成波は規則的で組織化されていた(図2A)。しかし、GSK923295群では精細管で精子形成波が変化し、中期停止した初代精母細胞はCENP-E阻害後に有意に増加しました(図2B-D)。重要なことに、いくつかの相同染色体は、CENP-E阻害後に赤道板で整列していませんでした(図2B-D)。さらに、CENP-E阻害は、精細管...

本稿では,男性減数分裂の貴重なモデルであるGSK923295の腹部手術と精巣注射によるCENP-Eの in vivo 阻害について報告する.免疫蛍光法、フローサイトメトリー法、透過型電子顕微鏡アッセイを用いて、CENP-E阻害がマウス精母細胞に染色体のミスアライメントとゲノム不安定性をもたらすことを示しています。

in vivo阻害、免疫蛍光法およびフローサイトメトリーを用いた精母細胞におけるキネシン-7 CENP-Eの機能評価(英語)

In eukaryotes, meiosis is essential for genome stability and genetic diversity in sexual reproduction. Experimental analyses of spermatocytes in testes ...

減数分裂は真核生物における進化的に保存されたイベントであり、配偶子形成と有性生殖に不可欠です。私たちのプロトコルは、減数分裂と精子形成の研究に効果的な方法を提供します。精母細胞を分析するための一連のプロトコルについて説明しました。この技術は、減数分裂紡錘体、相同染色体、および精母細胞中の細胞内小器官の観察に適用できます。この方法は、減数分裂の解析、遺伝子編集動物モデルの生成、組織または臓器における遺伝子導入に使用できます。実験者は、腹部手術中に無菌環境を維持し、このプロトコルの温度、時間、および主要な実験条件に注意を払う必要があります。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生である孟飛Xuさんです。GSK923295介在性セントロメアプロテインEまたはCENP-E阻害マウスモデルの構築を開始するには、麻酔をかけたマウスの手足を縛り、ワックストレイに固定します。手術部位を消毒した後、滅菌メスを使用してマウスの腹腔内に5ミリメートルの開口部を作り、続いて滅菌外科用クランプを皮膚に配置します。次に、滅菌解剖鉗子で精巣上体脂肪パッドを引っ張り、滅菌ピンセットを使用して精巣を見つけます。立体鏡下で滅菌鉗子で精巣を固定した後、10マイクロリットルのRiodineを使用して、10マイクロリットルのGSK923295を最終濃度10マイクロモルで精細管にゆっくりと注入します。完了したら、精巣を腹腔内に押し戻し、テキスト原稿に記載されているように手術部位を縫合します。採取したマウス精巣の勾配脱水のために、原稿に記載されているように、サンプルを様々な培地中で順次インキュベートします。連続インキュベーション後、組織を埋め込みボックスの底に置き、溶かしたパラフィンをボックスに追加します。パラフィンを完全に固化させるには、サンプルを摂氏4度で6時間冷却します。その後、サンプルとナイフ表面の間の角度を5〜10度に保ちながら、サンプルをウルトラミクロトームのホルダーに固定します。スライスの厚さを5マイクロメートルに調整し、ウルトラミクロトームを使用して5マイクロメートルの厚さの切片を調製します。調製したら、サンプルスライドを摂氏40度の水浴に広げてから、スライドドライヤーで切片を摂氏37度で12時間乾燥させます。12時間後、前述のようにスライドの順次インキュベーションを実行します。次に、スライドを蒸留水で5分間すすぎ、続いてメイヤーのヘマトキシリン溶液で室温で6分間染色します。次に、染色したスライドを流水で5分間すすぎ、蒸留水で2分間インキュベートします。スライドを1%エタノール塩酸塩中で3秒間インキュベートし、次にすすぎ、水を2分間流します。サンプルを1%エオシンで15秒間染色した後、連続インキュベーションします。完了したら、15マイクロリットルのニュートラルガムと24 x 50ミリメートルのカバーガラスを使用してスライドを密封します。免疫蛍光法の場合は、スライドを抗原賦活化液に入れ、圧力鍋で高圧下で4分間煮沸して抗原賦活化を行います。次に、スライドを室温まで自然に冷却してから、蒸留水で5分間、PBSで5分間2回すすぎます。細胞を透過させるには、500マイクロリットルの0.25%Triton X-100中でスライドをPBS中で10分間インキュベートし、次にスライドをPBSで5分間3回すすぎます。抗原ブロッキングのために、サンプルを300マイクロリットルの3%ウシ血清アルブミンまたはBSAとともに1時間インキュベートし、一次抗体を3%BSA中のPBSTで摂氏4度で16時間インキュベートします。インキュベーション後、スライドを加湿した箱に入れて、組織が乾かないようにします。スライドを室温まで30分間自然に温め直します。一次抗体を廃棄し、続いてスライドをPBSTで5分間3回リンスした。二次抗体を3%BSAおよびPBSTで希釈します。次に、サンプルを希釈した二次抗体とともに摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。サンプルをPBSTで5分間5回リンスした後、核を50マイクロリットルのDAPIで室温で5分間染色します。カバースリップをフェード防止封入剤で取り付け、カバースリップをマニキュアで密封します。フローサイトメトリーでは、マウスの精巣を6cmのシャーレに採取し、外科用ハサミで1立方ミリメートルに切断します。次に、精巣を1ミリリットルの1%コラゲナーゼで1.5ミリリットルの遠沈管で摂氏37度で10分間消化します。精子形成細胞を沈殿させるには、サンプルを1, 000 Gで5分間遠心分離し、上清を捨ててから、1ミリリットルの0.25%トリプシンEDTA溶液をサンプルに37°Cで20分間加えます。その後、サンプルを1, 000 Gで5分間遠心分離します。上清を捨てて、沈殿した細胞を1ミリリットルの70%冷エタノールで摂氏4度で8時間以上インキュベートします。1, 000 Gで5分間遠心分離した後、細胞沈渣を収集し、精子形成細胞を500マイクロリットルのヨウ化プロピジウムまたはPI染色溶液で摂氏37度で30分間染色します。インキュベーション後、300メッシュスクリーンを使用してサンプルをろ過し、細胞の破片を除去し、細胞をフローチューブに集めて細胞を摂氏4度で保存します。フローサイトメーターを使用して、488ナノメートルの励起波長での蛍光シグナルと光散乱を検出します。ModFit MF LT 32ソフトウェアを使用して、サンプル中のDNA含有量と光散乱を分析します。GSK923295の精巣注射後、精子細管ではCENP-E阻害により精子形成波が変化した。しかしながら、精細管における精子形成波は規則的であり、対照群において組織化された。いくつかの相同染色体は、CENP-E阻害後に赤道板で整列していないことが観察されました。さらに、CENP-E阻害は、精細管における中期I精母細胞の増加をもたらした。免疫蛍光分析は、CENP-E阻害後に精細管あたりの抗シナプトン複合体タンパク質3またはSYCP3陽性細胞の数の減少を示しました。一方、中期細胞あたりのSYP3ドットと細胞あたりのSYP3ストレッチは、GSK92395群で影響を受けませんでした。中期I精母細胞における紡錘体極の距離は、CENP-E阻害により増加した。代表的な分析は、CENP-E阻害が対照と比較してGSK 923295群の一倍体細胞の減少をもたらしたことを示しています。二倍体細胞と異数性細胞の比率は、CENP-E阻害後に有意に影響されませんでした。逆に、四倍体細胞の比率は、対照群よりもGSK923295群で増加した。精子形成細胞の透過型電子顕微鏡分析は、GSK923295群の精子形成細胞の破壊された組織を示した。実験者は、腹部手術および精巣注射中の注射位置、薬物投与量、注射方法、および縫合方法に注意を払う必要があります。この技術は、標的タンパク質に焦点を当てたin vivoエレクトロポレーションおよび遺伝子編集ツールとともに、縮瞳分裂および精子形成の分野で使用することができる。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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パラフィン埋め込まれたマウス精巣のセクションで蛋白質の検出と精巣細胞の不死化線 (mECap18)...

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インビボカエノハブディティス・エレガンスニューロンにおける微小管動態と向きの評価

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

本研究では、キネシン-3ファミリーのメンバーであるKIF1A(1-393LZ)をSf9-バキュロウイルス発現系を用いて精製する。これらの精製モーターの in vitro...

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

学ぶ、マウス精母細胞におけるCENP-E阻害による減数分裂と染色体整列への影響を評価する方法。免疫蛍光法とフローサイトメトリーによりゲノム安定性を解析し、男性生殖生物学の理解に貢献します。

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