Name: 細胞代謝を評価するための自己蛍光イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学ぶ NAD(P)HとFADの自己蛍光イメージングを用いた細胞代謝評価法。ラベルフリーで非破壊のこの手法は、神経細胞やがん細胞、幹細胞など様々な生細胞の時間経過観察に適用可能です。

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資金源には、Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) とTexas A&M Universityが含まれる。 図 1 は、BioRender.com を使用して作成されました。

著者らは、開示する利益相反はありません。

自己蛍光強度および寿命イメージングは、細胞における代謝を評価するために広く使用されている21,55。FLIMは高分解能であり、したがって単一細胞を解決し、細胞の不均一性が腫瘍の攻撃性および薬剤耐性に寄与するため、癌研究にとって重要である7,39,41,44,45,46,58。同様に、細胞代謝の自己蛍光イメージングは、免疫細胞機能が細胞代謝に関連しているため、免疫細胞のイメージングに有用であり、免疫細胞集団はしばしば不均一である...

代謝は、エネルギーを生産する細胞プロセスです。細胞代謝は、解糖系、酸化的リン酸化、およびグルタミン分解を含む複数の経路を包含する。健康な細胞は、これらの代謝経路を使用して、免疫細胞によるサイトカインの産生などの増殖および機能のためのエネルギーを生成する。代謝障害、癌、神経変性を含む多くの疾患は、細胞代謝の変化によって特徴付けられます1。例えば、一部のがん細胞型は、酸素の存在下でも解糖系の割合が上昇し、核酸、タンパク質、および脂質を合成するための分子を生成します2,3。ウォーバーグ効果として知られるこの現象は、乳がん、肺がん、膠芽腫など、多くのがんタイプの特徴です4。がんの進行に伴う細胞代謝の変化のため、細胞代謝は薬物応答の代理バイオマーカーとなり得る5,6。さらに、細胞の不均一性は個人において異なる薬物応答につながる可能性があるため、細胞レベルで薬物の有効性を理解することは極めて重要です7,8。
細胞代謝の変化を同定および定量化する技術は、がんおよび薬物応答の研究に不可欠です。化学分析およびタンパク質分析は、細胞または組織の代謝を評価するために使用されますが、単一細胞分解能および空間情報が不足しています。代謝プレートリーダーベースのアッセイは、経時的にサンプル中のpHおよび酸素消費量、およびその後の化学物質による代謝摂動を測定することができる。pHを使用して細胞外酸性化率(ECAR)を計算することができ、細胞の解糖系活性に関する洞察が得られます9。2-[フッ素-18]フルオロ-D-グルコース陽電子放射断層撮影法(FDG PET)および磁気共鳴分光法(MRS)を含む全身イメージング法は、代謝測定を通じて腫瘍の再発および薬物有効性を同定するために臨床的に使用される非侵襲的イメージングモダリティである10,11,12,13,14。
FDG-PETは、放射性標識グルコース類似体であるFDGの組織取り込みを画像化する。周囲の組織に対する腫瘍によるFDG-PETの取り込みの増加は、ウォーバーグ効果によるものである12,13。MRSは、13Cや31Pなどの代謝に使用される分子の一般的な核を画像化し、運動や食事などの刺激に応答して代謝がどのように変化するかについての動的情報を得ることができます14。FDG-PETおよびMRSは臨床的に使用することができるが、これらの技術は腫瘍内の不均一性を解決するための空間分解能を欠いている。同様に、酸素消費量の測定は、大量の細胞集団に対して行われます。自己蛍光イメージングは、これらの技術の空間分解能の障害を克服し、細胞代謝を定量化する非侵襲的な方法を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63282/63282fig01v2.jpg"> 図1:一般的な代謝経路におけるNADHおよびFAD。 NADHおよびFADは、解糖系、クレブスサイクル、および電子輸送鎖に使用される補酵素である。これらの分子の自己蛍光イメージングは、細胞代謝に関する情報を提供する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63282/63282fig01largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)および酸化型フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)は、解糖系、酸化的リン酸化系、グルタミン分解系などの代謝反応の補酵素です(図1)。NAD(P)HとFADはどちらも自己蛍光性であり、蛍光イメージングに内因性のコントラストを提供します1,15。NADPHはNADHと同様の蛍光特性を有する。このため、NAD(P)H は、NADH と NADPH2,16 の結合信号を表すためによく使用されます。
蛍光寿命イメージング(FLIM)は、蛍光寿命または蛍光色素分子が励起状態にある時間を定量化します。蛍光の寿命は蛍光色素分子の微小環境に反応し、細胞代謝に関する情報を提供します17。NAD(P)HおよびFADは、タンパク質結合または遊離立体配座のいずれかで細胞内に存在することができ、それぞれが異なる寿命を有する。遊離NAD(P)Hは、タンパク質結合NAD(P)Hよりも寿命が短い。逆に、遊離FADは束縛されたFADよりも寿命が長い18,19。寿命および寿命成分の重みは、蛍光寿命減衰データから式(1)20を通して定量化することができる。
I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)
式(1)は、時間の関数として規格化された蛍光強度を表す。この式のα 1とα 2は、それぞれ短寿命と長寿命(α 1+α 2=1)の比例成分を表し、τ1とτ2はそれぞれ短寿命と長寿命を表し、Cは背景光7,20を表します。振幅加重寿命は、ここではτmとして表され、式(2)を使用して計算されます。
τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)
平均寿命は、蛍光色素分子の強度減衰に対して「t」を平均することによって計算することができ、2指数関数的な減衰の場合、式(3)17,21で示されます。
τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)
蛍光強度画像は、蛍光寿命減衰を積分することにより、寿命画像から計算することができる。自己蛍光イメージングは、生細胞の代謝を細胞内分解能で特徴付けるために使用できる非破壊的で標識のない方法です。光酸化還元比は、セルの化学的酸化還元状態の光学アナログ測定を提供し、NAD(P)HとFAD強度の比として計算されます。光学酸化還元比の計算式は標準化されていませんが22,23,24,25,ここではNAD(P)HとFADを合わせた強度に対するFADの強度と定義しています。この定義が使用されるのは、分母の強度の合計がメトリックを 0 ~ 1 の間で正規化し、シアン化物阻害の予想される結果が酸化還元比の減少であるためです。遊離NAD(P)HおよびFADの蛍光寿命は、pH、温度、酸素への近接性、浸透圧など、代謝溶媒微小環境の変化に関する洞察を提供します17。
NAD(P)HとFADの結合画分の蛍光寿命の変化は、代謝経路の利用と基質特異的代謝を示す可能性があります26。成分重量は、補酵素の遊離から結合画分への変化について解釈することができる18、19。全体として、これらの定量的自己蛍光寿命測定基準は、細胞代謝の分析を可能にし、自己蛍光イメージングは、正常組織からの新生物の同定27,28、幹細胞の特性評価29,30、免疫細胞機能の評価31,32,33,34,35、神経学的活性の測定36、 37、38、および乳癌および頭頸部癌などの癌タイプにおける薬物有効性を理解する21、39、40、41、42。高解像度の自己蛍光イメージングは、単一細胞分析および集団内不均一性の定量化のための画像セグメンテーションと組み合わせることができます43,44,45,46,47。
NAD(P)HおよびFADは、強度または寿命イメージング用に構成された単一光子または多光子蛍光顕微鏡でイメージングできます。単一光子顕微鏡の場合、NAD(P)HとFADは、これらの波長で共通のレーザー光源のために、それぞれ375-405nmと488nmの波長で励起されるのが一般的です48。2光子蛍光励起では、NAD(P)HとFADはそれぞれ約700~750nmと700~900nmの波長で励起します15,49。蛍光色素分子が励起されると、NAD(P)HおよびFADは、それぞれ~410 nm~~490 nmおよび~510 nm~~640 nmの波長で光子を放出します15。NAD(P)HおよびFADの最大発光波長は、それぞれ約450nmおよび535nmである48。
励起波長と発光波長が異なるため、2つの代謝補酵素の蛍光をスペクトル的に単離することができます。NAD(P)HおよびFADのスペクトル特性を理解することは、自己蛍光イメージングプロトコルの設計および最適化に必要です。シアン化物は電子輸送鎖(ETC)錯体IV阻害剤である。細胞代謝に対するシアン化物の影響、ならびに細胞内のNAD(P)HおよびFADの自己蛍光強度および寿命は、よく特徴付けられる27,40。したがって、シアン化物摂動実験は、NAD(P)HおよびFADイメージングプロトコルを検証するための有効な手段である。シアン化物実験が成功すれば、NAD(P)HおよびFADイメージングプロトコルを使用して未知のグループまたは摂動の代謝を評価できるという確信が得られます。

<table><tbody><tr><td>2-デオキシ-d-グルコース(2-DG)</td><td>シグマ</td><td>AC111980000;AC111980010;AC111980050;</td><td></td></tr><tr><td>AC111980250 抗生物質 抗菌薬 (ペン連鎖球菌</td>)<td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>細胞サンプル</td><td>アメリカンタイプ 培養コレクション</td><td>N/A</td><td>MCF-7 がん株</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>ブロード研究所</td><td>N/A</td><td>画像解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>コニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td>15 mL コニカルチューブ</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td>培養培地</td></tr><tr><td>FAD 二色性ミラー</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td>495 nm</td></tr><tr><td>FAD 蛍光フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-550/88-25</td><td>550/88 nm</td></tr><tr><td>FAD 励起フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-458/64-25</td><td>458/64 nm</td></tr><tr><td>FBS ThermoFisher</td><td></td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>蛍光寿命顕微鏡</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>多光子レーザー</td><td>コヒーレント</td><td>N/A</td><td>2P コヒーレント レーザー、チューナブル 680 nm-1080 nm</td></tr><tr><td>NAD(P)H ダイクロイックミラー</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td>409 nm</td></tr><tr><td>NAD(P)H 蛍光フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td>447/60 nm</td></tr><tr><td>NAD(P)H 励起フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-357/44-25</td><td>357/44 nm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Cyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>380970</td><td></td></tr><tr><td>SlideBooks 6</td><td>3i</td><td>N/A</td><td>画像取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>SPCImage</td><td>Becker &Hickl GmbH</td><td>N/A</td><td>蛍光寿命解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーター</td><td>okoLab</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>バイオサイエンス</td><td>786-262</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>YGビーズ</td><td>Polysciences</td><td>19096-2</td><td>Ygマイクロスフェア(20.0 &micro;m)</td></tr></tbody></table>

細胞代謝を評価するための自己蛍光イメージング

Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism

細胞代謝は細胞がエネルギーを生成するプロセスであり、癌を含む多くの疾患は異常な代謝によって特徴付けられる。還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)および酸化型フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)は、代謝反応の補酵素である。NAD(P)HおよびFADは自己蛍光を示し、励起および発光波長によってスペクトル的に単離することができる。両方の補酵素、NAD(P)HおよびFADは、遊離またはタンパク質結合配置のいずれかで存在することができ、それぞれが異なる蛍光寿命(蛍光色素分子が励起状態にとどまる時間)を有する。蛍光寿命イメージング(FLIM)は、細胞代謝の標識のない分析のために、NAD(P)HおよびFADの蛍光強度および寿命の定量化を可能にする。蛍光強度と寿命顕微鏡は、適切な励起波長と発光波長を選択することで、NAD(P)HとFADのイメージングに最適化できます。シアン化物による代謝摂動は、細胞内の代謝変化を検出するための自己蛍光イメージングプロトコルを検証します。本稿では、細胞代謝を測定するためのNAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージング技術を実証する。

上皮乳癌細胞株MCF-7を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したDMEM中で培養した。蛍光画像化のために、細胞を、画像化の48時間前に35mmガラス底画像化皿当たり4×105細胞の密度で播種した。細胞をシアン化物処理の前後に、上記のプロトコールを用いて画像化した。シアン化物実験の目的は、NAD(P)HおよびFAD蛍光のスペクトル分離を確認し、細胞の代謝変化を検出するためのイメージングシステムおよび分析プロトコルを検証することです。ペアのNAD(P)HおよびFAD蛍光寿命画像を、シアン化物前の5つの異なる場所およびシアン化物を媒体に添加した後の5つの異なる場所で撮影した。蛍光寿命パラメータ(光学酸化還元比、NAD(P)H α 1、NAD(P)Hτ1、NAD(P)Hτ2、NAD(P)Hτm、FAD τ1、FAD τ2、FAD α 1、FAD τ1、FAD τ2、およびFAD τm)は...

このプロトコルは、内因性代謝補酵素、還元型ニコチンアミドアデニン(リン酸)ジヌクレオチド(NAD(P)H)、および酸化フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)の蛍光イメージングおよび分析について記載しています。NAD(P)HおよびFADの自己蛍光イメージングは、細胞代謝を評価するための標識フリーの非破壊的方法を提供します。

Cellular metabolism is the process by which cells generate energy, and many diseases, including cancer, are characterized by abnormal metabolism. Reduced ...

ADHおよびFADは、異なる励起波長および発光波長で自己蛍光を示す内因性分子である。代謝反応の補酵素としての使用のために、自己蛍光顕微鏡は細胞代謝を評価することができる。NADHおよびFADの自己蛍光イメージングは、外因性標識を必要とせず、細胞内分解能を有する非破壊的方法である。自己蛍光顕微鏡は、生きたサンプルや時間経過研究に使用できます。自己蛍光イメージングは、任意の生細胞または組織に広く適用することができる。自己蛍光イメージングは、ニューロン、癌細胞、腫瘍、インビボ、幹細胞、および免疫細胞に使用されてきました。この手順を実証するのは、テキサスA&M大学の定量光学イメージング研究所の大学院生であるLinghao Huです。レーザー光源と検出器を含む多光子蛍光寿命顕微鏡のすべてのコンポーネントをオンにして実験を開始します。サンプルを配置する前に、明視野ランプをオンにし、光が接眼レンズに入ることを確認します。次に、細胞イメージングの目的を選択します。対気目標を使用しない場合は、対物レンズの上に適切な浸漬媒体を 1 滴ずつ塗ります。ガラス底の皿を顕微鏡ステージ上のサンプルホルダーの上に置きます。次に、X/Yステージコントロールを使用して試料を対物レンズで中央に配置し、試料が固定され、イメージング中に動かないことを確認します。完了したら、接眼レンズを覗き込み、目標を上に動かしてセルに焦点を合わせます。顕微鏡が囲い内にある場合は、ライトボックスのドアを閉じます。次に、画像取得ソフトウェアを開き、[多光子イメージング]タブをクリックして、原稿に記載されているように多光子イメージングパラメータを設定します。検出器のゲインを蛍光寿命イメージング(FILM)に最適な値に調整します。次に、試料の各ピクセルにおけるレーザー支出の滞留時間を所望の値に変更する。ニコチンアミドアデニンリン酸ジヌクレオチド、またはNADPHの場合、多光子レーザーを750ナノメートルに設定します。次に、レーザーのシャッターを開けたときにセルが損傷しないように、レーザーのパワー制御がゼロに設定されていることを確認します。発光フィルターを400~500ナノメートルに設定します。パラメータを設定したら、フォーカスまたはライブビュー方式でイメージングを開始し、画像設定を最適化します。レーザー出力を3ミリワットから8ミリワットにゆっくりと上げながら、セルにピントが合っていることを確認します。調整が完了したら、最大使用電力を記録します。記録された最大電力設定は、ペトリ皿の他のセグメントのイメージングに使用します。画像積分時間が60秒のNADPH-FILM画像を収集し、蛍光寿命減衰曲線内の細胞質画素に対して100光子のピークなど、画像に十分な数の光子があることを確認します。光子の数が少なすぎる場合は、レーザー出力または画像取得の時間を長くします。フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD)イメージングでは、多光子レーザーを890ナノメートルに設定し、レーザーが新しい波長でモードロックするのを待ちます。レーザーのパワーコントロールが最初にゼロに設定されていることを確認します。発光フィルターを500~600ナノメートルに設定します。画像設定を最適化するには、レーザー出力を 5 ~ 10 ミリワットに増やし、最大使用電力を記録して、フォーカスまたはライブビュー方式でイメージングを開始します。後続の視野のFADイメージングに同じ電源設定を使用します。画像積分時間60秒のFAD-FILM画像を収集し、蛍光寿命減衰曲線内に十分な光子があることを確認します。光子の数が少なすぎる場合は、レーザー出力または画像取得の継続時間を長くし、各画像を2つの視野に離して、さらに4〜5視野(FOV)でイメージングを繰り返します。80ミリモルのシアン化ナトリウム溶液を作るには、130.24ミリグラムのシアン化ナトリウムを25ミリリットルのPBSに溶解する。培養皿から、100マイクロリットルのシアン化ナトリウム溶液で置換する培養液100マイクロリットルを吸引し、ディッシュ中のシアン化物を4ミリモル濃度で得た。細胞をインキュベーターに5分間入れて、細胞がシアン化物溶液と反応できるようにします。シアン化物曝露後、前述のように細胞のNADPHおよびFAD画像を取得する。この研究では、尿素から測定された機器応答関数(IRF)を使用して蛍光寿命パラメータを計算しました。パラメータを、セグメンテーションに用いた各細胞の細胞質のピクセルにわたって平均化した。個々の細胞を同定し、バックグラウンドノイズを除去するためにマスクした。その後、核を同定し、細胞マスク上に投影した。さらに、細胞を濾過して、典型的な細胞のサイズに適合しないマスクされた領域を除去した。NADPHおよびFADの多光子蛍光寿命イメージングにより、シアン化物処理前後の細胞形態および代謝の可視化が可能となった。NADPHの寿命はシアン化物処理で短くなるのに対し、FADの寿命はシアン化物処理後に長くなることが観察された。代表的な箱ひげ図は、MCF7細胞の光学酸化還元比がシアン化物処理後に減少したことを示した。シアン化物曝露は、MCF7細胞の振幅加重NADPH寿命を減少させた。短寿命および長期寿命はNADPHでは減少したが、NADPHアルファ1については増加した。FADの場合、MCF7細胞の振幅加重寿命はシアン化物曝露後に増加した。短寿命と長寿命の両方がFADでは増加しましたが、FADアルファ1では減少しました。サンプルに十分なレーザー出力を持たせることが重要ですが、出力が多すぎると細胞に損傷を与える可能性があることに注意してください。自己蛍光イメージングは細胞に損傷を与えないため、その後の生化学的アッセイを同じサンプルで使用することができます。

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