Name: ブタ末梢血からの血液伸長内皮細胞(BOEC)の特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学ぶブタ末梢血から血液伸長内皮細胞(BOEC)を培養する方法。組織工学や細胞治療、疾患モデリングの研究に応用可能な高増殖性内皮細胞を少量採血で効率的に樹立する技術を解説します。

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著者らは、NIH / NHLBI R00 HL129068からの資金提供を認めたいと考えています。

すべての動物実験は、ウィスコンシン医科大学とメイヨークリニックのそれぞれの施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。
注:この研究では、ヨークシャー/ランドレース/デュロックのクロス家畜豚(Sus domestic us)、オスとメス、40〜80 kg、3〜6か月齢を使用しました。
1.ブタ末梢血の採取
<ol><li>材料を準備します。<ol><li>ヘパリン溶液を滅菌生理食塩水で100 U / mLに希釈します。.</li>
		<li>2つの50 mLコニカルチューブと2つの60 mLシリンジのそれぞれに3〜4 mLのヘパリン溶液を追加します。</li>
		<li>希釈していないヘパリン溶液(1,000 U / mL)を延長チューブに引き込みます。</li>
		<li>ヘパリン充填延長チューブの一方の端に19 G針を接続し、もう一方の端にヘパリン含有60 mLシリンジを接続します。</li>
	</ol></li>
	<li>制度的方針に従って豚を麻酔する<ol><li>麻酔を誘発するために、アトロピン(0.05 mg / kg)、チレタミン/ゾラゼパム(2-5 mg / kg)、およびキシラジン(2 mg / kg)のIM注射を投与します。. 注:動物が意識を失い、下顎筋が硬くなくなると、適切な麻酔が達成されます。</li>
		<li>動物を仰臥位に置き、安定感を高めるために丸めたタオルを両側に置きます。</li>
		<li>麻酔下での乾燥を防ぐために眼科用軟膏を目に塗ります。</li>
		<li>毛布、加熱パッド、および/または加熱された手順テーブルを含む麻酔中の熱サポートを提供します。</li>
	</ol></li>
	<li>ベタジンスクラブ溶液で大腿鼠径部をきれいにします。</li>
	<li>19 Gの針で大腿静脈または動脈に穴を開け、ゆっくりと(~1-2 mL / s)50 mLの血液をシリンジに引き込みます。 注: 描画が速すぎると、セルが損傷する可能性があります。</li>
	<li>針を所定の位置に残し、すぐに延長チューブをねじり、60 mLシリンジを外します</li>
	<li>血液をヘパリン含有50mLのコニカルチューブにゆっくりと移します。</li>
	<li>50 mLのコニカルチューブにしっかりと蓋をし、数回静かに反転させて混合し、氷の上に置きます。</li>
	<li>残りのヘパリン含有60 mLシリンジを延長チューブに接続し、延長チューブのネジを外し、さらに50 mLの血液をシリンジにゆっくりと吸引します。</li>
	<li>すぐに動脈または静脈から針を外し、残りの血液を延長チューブからシリンジにゆっくりと引き抜きます。</li>
	<li>60 mLシリンジを延長チューブから外し、残りのヘパリン含有50 mLコニカルチューブに血液をゆっくりと移します。</li>
	<li>50 mLのコニカルチューブにしっかりと蓋をし、数回静かに反転させて混合し、氷の上に置きます。</li>
	<li>ブタの大腿鼠径部に圧力止血を適用します。</li>
	<li>制度的方針に従って豚を回復します。動物が胸骨横臥を維持し、通常の住居/犬小屋エリアに戻るのに十分な意識を取り戻すまで、動物を継続的に監視します。</li>
</ol>2. 単核球の単離
<ol><li>4本の50 mLコニカルチューブでリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で血液を1:1に希釈します。 注:この作業は、細胞培養物の汚染を避けるために、無菌技術を使用して細胞培養フードで実行する必要があります。</li>
	<li>25 mLの室温ですぐに使用できる密度勾配溶液を8本の50 mLコニカルチューブに加えます。</li>
	<li>50 mLのコニカルチューブを含む各密度勾配溶液の内側に沿って、チューブをピペットチップに対して鋭角に保持することにより、25 mLの血液/生理食塩水を非常にゆっくりとピペットします。 注意: 血液溶液は、密度勾配溶液の上に穏やかに重なり、明確に定義されたインターフェースを維持する必要があります。</li>
	<li>チューブを560 x g および室温(RT)で30分間遠心分離します。 注意: 最良の結果を得るには、可能であれば遠心分離機ブレーキを無効にしてください。</li>
	<li>薄いピペットを使用して、各チューブからバフィーコート(密度勾配溶液の上と透明な血漿の下の単核細胞の濁った層)を注意深く収集し、2つの新しい50 mLコニカルチューブに均等に分配します。チューブを含む密度勾配溶液を廃棄します。 注意: 密度勾配溶液とプラズマをできるだけ少なく収集しながら、できるだけ多くのバフィーコートを収集します。</li>
</ol>3.細胞の洗浄とメッキ
<ol><li>6ウェルプレートをフィブロネクチンでコーティングします。<ol><li>ヒト血漿フィブロネクチンを滅菌水で1 mg / mLに希釈してストック溶液を作ります。アリコートは-20°Cで保存してください。</li>
		<li>600 μLのフィブロネクチンストック溶液を3 mLのPBSで希釈して、3.6 mLのフィブロネクチンの作業溶液を作ります。</li>
		<li>600 μLのフィブロネクチン作業溶液を6ウェルプレートの各ウェルに移し、均一にコーティングされるまで穏やかに揺り動かします。</li>
		<li>フィブロネクチンがウェルをコーティングするまで30分待ち、各ウェルから溶液を静かに吸引します。</li>
	</ol></li>
	<li>フィブロネクチンがコーティングするのを待っている間に、単核球を洗います<ol><li>チューブに最大45 mLのPBSを補充します</li>
		<li>560 x g 、低ブレーキで4°Cで5分間遠心分離します。両方のチューブから上清を吸引します。</li>
		<li>各細胞ペレットを25 mLのPBSに再懸濁します。</li>
		<li>繰り返してもう一度洗います。</li>
	</ol></li>
	<li>各細胞ペレットを5 mLのPBSに再懸濁し、15 mLの0.8%塩化アンモニウム溶液を各チューブに加えます。 注:このステップは、残りの赤血球を溶解することです。</li>
	<li>氷上で10分間インキュベートします。</li>
	<li>以前と同様に、チューブにPBSを補充し、560 x g 、低ブレーキで4°Cで5分間遠心分離して細胞を洗浄します。両方のチューブから上清を吸引します。</li>
	<li>各細胞ペレットを25 mLのPBSに再懸濁し、もう一度洗浄を繰り返します。</li>
	<li>各細胞ペレットを、10%ウシ胎児血清(FBS)と10,000 U/mLペニシリン、10 mg/mLストレプトマイシンおよび25 μg/mLアムホテリシンを含む1x抗生物質/抗真菌溶液を添加した6 mLのEGM-2培養液に再懸濁します。 注:EGM-2培地は、200μLのヒドロコルチゾン、2mLのヒト線維芽細胞増殖因子(hFGF-B)、500μLの血管内皮増殖因子(VEGF)、500μLのインスリン様成長因子(R3IGF-1 )の組換えアナログ、500μLのアスコルビン酸、500μLのヒト上皮成長因子(hEGF)を添加したEBM-2培養培地からなる。 500 mLあたり500 μLのゲンタマイシン/アンホテリシン、および500 μLのヘパリン。</li>
	<li>2 mLの細胞懸濁液をフィブロネクチンコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに静かに移し、均一にコーティングされるまで穏やかに揺り動かします。 注:目標は、形成される内皮コロニーの数を最大化するために、できるだけ多くの細胞を播種することです。</li>
</ol>4. 細胞培養
<ol><li>細胞を37°C、5%CO2、湿度100%でインキュベートします。</li>
	<li>翌日、1 mLの新鮮な培養液を各ウェルに穏やかに加えます。 注:フィブロネクチンコーティングに緩く接着している細胞を乱さないように優しくすることが重要です。</li>
	<li>翌日、各ウェルから1.5 mLの培養液を静かに吸引し、1.5 mLの新鮮な培地と交換して、半培養液交換を行います。</li>
	<li>次の5日間のそれぞれで、各ウェルに完全培養培地交換を静かに行います(1ウェルあたり2 mLの新鮮な培地)。</li>
	<li>その後、週に3回培養液を静かに交換します。</li>
	<li>低出力(対物レンズ4倍)光学顕微鏡下で細胞培養を定期的に可視化します。 注:付着性血液伸長内皮細胞(BOEC)コロニーは、プレーティング後7〜10日でウェルに現れ始めます。非接着細胞型は培地の変更とともに廃棄され、他の接着細胞型はBOECコロニーが成長するにつれて徐々に消散します。</li>
	<li>BOECをフィブロネクチンコーティングT-75フラスコに~70%-80%コンフルエントに通過させ、培養培地の交換を週に3回続けます。 注:播種密度は、代わりにコロニーをT25フラスコに継代させることで制御できます。その後の継代はフィブロネクチンコーティングを必要とせず、培地交換は週に2回に減らすことができます。</li>
	<li>継代1〜3からの細胞は、実験に使用したり、凍結培地に移して将来の使用のために液体窒素中に保存したりすることができる。</li>
</ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

BOECは、さまざまな科学的および治療的アプローチで使用できる強力なツールです7、8、16。BOECは、血管疾患および癌の発症に関与する重要な要因を解明するためにEC遺伝子発現を分析するために使用されています5,19,20,21。BOECは、血管再生や遺伝子送達などの治療用途にも使用されています22,23,24。遺伝子組み換えBOECは、抗血管新生腫瘍治療能力で知られています25...

内皮は非常に複雑で動的な構造であり、血管壁の重要な構成要素です。血管の内面を裏打ちし、循環血液と周囲の組織との間の物理的インターフェースを提供します。この不均一な構造は、血管新生、炎症、血管調節、止血などのさまざまな機能を果たすことが知られています1、2、3、4。ヒト臍帯静脈内皮細胞は、内皮細胞の機能を評価するために広く研究されている細胞型です。しかし、患者固有のバッチ変動性、一貫性のない表現型、および最小分割効率は、これらすべての機能を改善できる細胞源を決定する必要性を示唆しています5。
初代内皮細胞の均質な集団を得ることは技術的に困難な場合があり、初代内皮細胞は高い増殖能力を持っていません6。したがって、血管再生を研究し、病態生理学的プロセスを評価するために、さまざまなグループが末梢血に由来するさまざまな種類の内皮細胞、例えば内皮前駆細胞(EPC)または血液伸長内皮細胞(BOEC)を取得して評価することを試みてきました6,7,8,9。.紡錘形の初期EPCは造血幹細胞(HSC)に由来し、成長力が限られており、成熟内皮細胞を産生する血管新生能力も限られています。さらに、それらは炎症性単球によく似ています。さらに、機能的で増殖する成熟内皮細胞にさらに分化するそれらの能力は、依然として議論の余地がある6、7、9、10である。末梢血単核細胞(PBMC)の連続培養は、後期増殖EPC、BOEC、または内皮コロニー形成細胞(ECFC)として知られる細胞の二次集団を生じさせる可能性があります6、7、9、10。Medinaらは2018年に、EPCの限界、命名法の曖昧さ、およびEPC11の下で継続的にグループ化された多くの異なる細胞型との一致の一般的な欠如を認めました。対照的に、BOECは、血管修復、健康と病気、および細胞療法におけるその役割で認識されるようになりました。これらの細胞のさらなる研究および治療的使用は、循環前駆細胞からこれらの細胞型を一貫して導出するためのプロトコルに依存するであろう。
BOECなどの初代細胞は、増殖性の高い成熟内皮細胞6を得るための代理として使用することができる。BOECは初期のEPCとは表現型的に異なり、石畳の形態や付着接合部やカベオラの発現などの典型的な内皮の特徴を示します12。Hebbelらによる遺伝子プロファイリング13,14,15は、BOECまたはECFCが微小血管および大血管形成を促進する真の内皮細胞であることを発見しました。したがって、BOECは、病態生理学的プロセスおよび遺伝的変異を評価するためのツールとして使用できます16。それらはまた、血管再生のための細胞療法のための優れた細胞源と考えられています17。したがって、これらの高度に増殖する細胞を一貫して導出するための標準化されたプロトコルが不可欠です。
BOECは、ヒトの病態生理学的および遺伝的変異を研究するための強力なツールを提供しますが、BOECのより均質な供給源は、より堅牢で信頼性の高い実験および治療結果を提供する可能性があります。優れた均質性は、同様の条件で飼育された遺伝的に類似した動物に由来する異種細胞源を使用することによって達成することができる18。異種細胞源は宿主の免疫応答を誘発する傾向がありますが、免疫調節戦略は、免疫適合性のある動物および細胞を含む動物製品を生成することを目的として開発されています。特にブタは末梢血の豊富な供給源であり、人間との解剖学的および生理学的類似性のために医療機器および他の治療法を研究するために一般的に使用されている。したがって、この研究は、ブタ末梢血からの高増殖性BOECの分離と拡大のためのプロトコルを改良します。以下に詳述するプロトコルは、比較的少量の血液から多数のBOECを取得するための簡単で信頼性の高い方法です。培養物を数回の継代で拡張して、単一の血液サンプルから数百万の細胞を生成することができます。

<table><tbody><tr><td>19 G ニードル</td><td>Covidien</td><td>1188818112</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>60 mL シリンジ</td><td>Covidien</td><td>8881560125</td><td></td></tr><tr><td>塩化アンモニウム溶液 (0.8%)</td> <td>Stemcell Technologies</td><td>07850</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌剤溶液 (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-253-839</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 培養液</td><td>ロンザ・ウォーカーズビル</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>延長チューブ</td><td>Hanna Pharmaceutical Supply Co.</td><td>03382C6227</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Atlas Biologicals</td><td>F-0500-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque 1077</td><td>Cytiva</td><td>17144003</td><td>密度勾配溶液</td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム注射液 (1,000 units/mL)</td><td>Pfizer</td><td>00069-0058-01</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血漿フィブロネクチン</td><td>Gibco</td><td>33016-015</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ピペットセット</td><td>Eppendorf</td><td>2231300004</td><td></td></tr><tr><td>滅菌水</td><td>Gibco</td><td>15230-162</td><td></td></tr><tr><td>薄型ピペット</td><td>Celltreat Scientific</td><td>229280</td><td></td></tr></tbody></table>

ブタ末梢血からの血液伸長内皮細胞(boec)の特性評価

Characterization of Blood Outgrowth Endothelial Cells (BOEC) from Porcine Peripheral Blood

内皮は、血管新生、止血、炎症、恒常性などの多くの生理学的機能において重要な役割を果たす動的な統合構造です。内皮は、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病などの病態生理においても重要な役割を果たしています。内皮細胞は血管とリンパ管の内層を形成し、構造と機能の不均一性を示します。ヒト末梢血由来の内皮細胞の機能性を、造血幹細胞由来の内皮前駆細胞や成熟血液伸長内皮細胞(または内皮コロニー形成細胞)を中心に、様々なグループが評価しています。これらの細胞は、治療および疾患モデリングのための自家リソースを提供します。異種細胞は、同様の条件で飼育された遺伝的に類似した動物を使用することによって達成されるそれらの利用可能性および均質性のために、代替の治療薬源を提供し得る。したがって、ブタ末梢血からの高度に増殖性の血液伸長内皮細胞の単離および拡大のための堅牢なプロトコルが提示されている。これらの細胞は、心血管組織工学、細胞療法、疾患モデリング、薬物スクリーニング、内皮細胞生物学の研究、異種移植における炎症反応および凝固反応を調べるための in vitro 共培養など、多くの用途に使用できます。

培養開始からBOECコロニーが観察されるまで培養細胞の形態が観察された(図1)。より小さな集団の接着細胞が培養皿に付着して増殖し始めましたが、非接着細胞は培地の変更とともに除去されました(図1B)。コロニーは、中心点から放射状に外側に増殖する内皮様細胞の集まりとして6日目に最初に現れました(図1D)。培養が進むにつれて、細胞コロニーはより密になり、成熟内皮細胞と同様の石畳の形態を示しました(図1F)。典型的な内皮石畳の形態は、光学顕微鏡を使用してBOECの簡単な予備識別を提供します。
内皮細胞コロニーは、典型的には、培養10〜14日で継代の準備ができている。この時点で、6ウェルプレートは通常、生存率が93%〜98%の~100万個の細胞を生成します。最初の継代中に、内皮細胞は増殖し、T75フラスコ内に6~1000万個の細胞を生成します。
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ブタ末梢血からの血液伸長内皮細胞(BOEC)の特性評価

The endothelium is a dynamic integrated structure that plays an important role in many physiological functions such as angiogenesis, hemostasis, ...

このプロトコルは、さまざまな組織工学、細胞療法、および疾患モデリングの調査に使用できる、高度に増殖する血液伸長内皮細胞を提供します。この技術は、1回の採血から一貫して多くの細胞を生成します。この技術を成功させるには、細胞をできるだけ早く培地とインキュベーター環境に迅速に入れることが重要です。まず、ヘパリン溶液を滅菌生理食塩水で1ミリリットルあたり100単位に希釈します。2つの50ミリリットルコニカルチューブと2つの60ミリリットルシリンジのそれぞれに3〜4ミリリットルのヘパリン溶液を追加します。次に、希釈せずに1ミリリットルあたり1, 000単位のヘパリン溶液を延長チューブに引き込みます。ヘパリンで満たされた延長チューブの一方の端に19ゲージの針を接続し、延長チューブのもう一方の端にヘパリンを含む60ミリリットルのシリンジを接続します。次に、麻酔をかけたブタの大腿鼠径部をベタジンスクラブ溶液できれいにします。19ゲージの針で大腿静脈または動脈を穿刺し、毎秒1〜2ミリリットルで、50ミリリットルの血液をゆっくりと注射器に引き込みます。針を所定の位置に残して、すぐに延長チューブをねじり、60ミリリットルのシリンジを外します。血液をヘパリンを含む50ミリリットルの円錐管にゆっくりと移します。円錐形のチューブにしっかりと蓋をし、チューブを数回静かに反転させて混合し、氷の上に置きます。残りのヘパリン含有60ミリリットルシリンジを延長チューブに接続します。延長チューブのねじれをほどき、さらに50ミリリットルの血液をシリンジにゆっくりと吸い込みます。すぐに動脈または静脈から針を外し、残りの血液を延長チューブからシリンジにゆっくりと引き抜きます。60ミリリットルのシリンジを延長チューブから外し、残りのヘパリンを含む50ミリリットルの円錐形のチューブに血液をゆっくりと移します。50ミリリットルの円錐形のチューブにしっかりと蓋をし、数回静かに反転させて混合し、氷の上に置きます。ブタの大腿鼠径部に圧力止血を適用します。4本の50ミリリットルの円錐管でPBSで血液を1対1に希釈します。25ミリリットルの室温ですぐに使用できる密度勾配溶液を8本の50ミリリットルの円錐管に加えます。密度勾配溶液を含む各50ミリリットルの円錐管内に25ミリリットルの血液生理食塩水を、ピペットチップに対して鋭角に保持してゆっくりとピペットします。チューブを560 g、室温で30分間遠心分離します。密度勾配溶液の上と透明な血漿の下の単核細胞の濁った層であるバフィーコートを細いピペットで各チューブから慎重に集め、2つの新しい50ミリリットルの円錐形チューブに均等に分配します。チューブを含む密度勾配溶液を廃棄します。6ウェルプレートをフィブロネクチンでコーティングするには、ヒト血漿フィブロネクチンを滅菌水で1ミ

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）は血管の恒常性と修復を研究するために有望なツールです。...

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

我々は、心臓弁内皮細胞（VEC）の純粋な集団を分離して培養する方法を提供する。...

弁内皮細胞の単離

自己細胞とテスト生体適合性とチタンの血液接触生体材料をシードする方法について説明する。このメソッドは、ブタ静脈cavaeに外科的に移植後数分以内に接種した内皮前駆細胞およびチタンチューブを、使用しています。この手法は、他の多くの埋め込み型医用機器に適応可能です。...

大動物モデルにおける心血管デバイス用自家血管内皮前駆細胞播種技術と生体適合性試験

我々は、無菌連続流回路における層流のせん断応力を受ける接着細胞への方法を記述しています。細胞の接着、形態は、透明なチャンバーを通過代謝物の分析と将来の実験や培養のためのせん断曝露後に細胞を回収するための回路から得られた試​​料を研究することができる。...

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

内皮コロニー形成細胞（ECFCs）組み込み表示されていること、堅牢なクローン増殖能と血管内皮細胞を循環している...

ヒト臍帯血由来血管内皮コロニー形成細胞の表現型および機能解析

このビデオでは、ワンステップコラゲナーゼ消化法を用いて、ブタモデルの腹部大動脈から内皮細胞を単離する様子を実演しています。内皮細胞は、さらなるダウンストリームアプリケーションのために培養することができます。...

ブタ大動脈内皮細胞(pAEC)単離:収穫されたブタ腹部大動脈から内皮細胞を単離するための酵素ベースの方法

このビデオでは、10〜12日以内に、胚前脳からの内皮細胞の純粋培養を調製するための簡単​​で信頼性の高い戦略を示し、脳血管新生のさまざまな側面に焦点を当てた研究のために有用であろう。...

胚前脳からの内皮細胞の単離および培養

このプロトコルは、少量の成体末梢血からの血液増殖内皮細胞(BOEC)の信頼性の高い生成と特性評価を可能にします。BOECは、血管障害患者の内皮細胞の代用として、また人工多能性幹細胞を作製するための基質として使用することができます。...

ヒト末梢血からの血液伸長内皮細胞の生成と文化

造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）は、まだ少しはいくつかの内皮細胞は、血液が形成になることを指定するプロセスについて知られている、開発中に特殊な（造血）内皮細胞に由来します。我々は、マウス胚組織から造血内皮細胞およびHSPCの同時分離を可能にするフローサイトメトリーベースの方法を示しています。...

マウス胚性造血内皮細胞の単離

このプロトコルの目的は、臍帯血由来の血管内皮前駆細胞を分離することです。一部のアプリケーションは虚血性疾患の治療、心血管のリスクを持つ患者を識別するためのバイオ...

ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

全体、高血圧症非血の研究と凝固解析を可能にする生体外モデルを提案します。健康な内皮細胞の自然な抗凝固効果に依存するシステムの抗凝固療法と血管内皮細胞の活性化血液凝固になります。...

3 D 細胞培養と非高血圧症全血を用いた血管内皮細胞の抗凝固および抗炎症作用の評価

学ぶブタ末梢血から血液伸長内皮細胞(BOEC)を培養する方法。組織工学や細胞治療、疾患モデリングの研究に応用可能な高増殖性内皮細胞を少量採血で効率的に樹立する技術を解説します。

ブタ末梢血からの血液伸長内皮細胞(BOEC)の特性評価

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