Name: ベアマン・ファネルによる野生の線虫の迅速な分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 学ぶベアマン・ファネル法による野生線虫の迅速分離技術。腐植質からCaenorhabditis属を抽出し、自然環境での遺伝子機能解析や個体群遺伝学研究に活用できます。初心者でも実施可能な野外採集プロトコルです。

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この研究は、NIH助成金R35GM141906とR21ES031364とデイモン・ルニヨン・フェローシップDRG-2371-19によって支援されました。

1. フィールド内の播種されたNGMプレートの調製
<ol><li>旅行前に、23.005 gのネマトード成長培地(NGM)( 材料表を参照)の粉末と封止可能なビニール袋のプレパックを計量します。必要なメディアのリットルごとに1袋を作ります。 注:旅行前に事前にパッケージングを行う場合、現場での機能バランスの必要性が回避されます。</li>
	<li>旅行前に、1M MgSO4の1mL、1M CaCl2の1mL、および1Mリン酸カリウムバッファーの25 mLを必要な各リットルの媒体に対して調製してください。1 L のリン酸カリウムバッファーを作るために、ワームブック20で説明したように KH2PO4 の 108.3 g と K2HPO4 の 35.6 g を水に溶かします。</li>
	<li>旅行前に、WormBook20に記載されているように、37 °CでLBで栽培されたOP50(材料表を参照)の一晩培養を行います。50 mL円錐管に培養物をアリコートし、漏れを防ぐためにパラフィンフィルムでトップスを包みます。</li>
	<li>現場では、NGMパケットの内容物を、2重蒸留水(ddH20)の973 mLまたは1Lフラスコまたはボトルで入手可能な最も純粋で最も無菌の水に溶解します。</li>
	<li>熱い皿またはストーブの熱湯浴に、緩いキャップまたはアルミホイルカバーで、メディアフラスコまたはボトルを置きます。すべての粉末が溶解し、明確になるまで時々かき混ぜます(これは〜30分かかります)。 注:磁気ホットプレートが利用可能な場合は、手動攪拌の量を制限するための優れたオプションです。</li>
	<li>水浴から媒体を取り出し、時折揺れたり、かき混ぜて~58°Cに冷却します。培地を58°Cに冷却したら、血清学的または標準的なピペットを使用して、1Mリン酸カリウムバッファーの25 mL、1mLの1M MgSO4、1m CaCl2の1 mLを加え、各ステップ間で十分に混合します。</li>
	<li>利用可能な最も無菌環境では、ピペットまたは所望のサイズのプレートにメディアを注ぎ、一晩冷却し、固めます。各基板サンプルに60mmプレート(約10mL)を注ぎます。各アイソメスラインに35mmプレート(〜3.5mL)を注ぎます。必要な小皿の数は、事前に予測することは困難です。</li>
	<li>OP50培養のピペット50 μLを各プレートに入れ、使用前に一晩乾燥して成長させます。</li>
</ol>2. 線虫基板の回収
<ol><li>現場で細菌が豊富な基質を特定します。いくつかの例は、腐った果物、花、真菌、および草本植物の茎を含む。土壌や葉のごみも適していますが、 カエノアハブディティスを含むことはめったにありません。</li>
	<li>手袋をはめた手で、この基板のサンプル(1-15 cm3)を、ユニークなサンプルID(図1A)でラベル付けされた密封可能なビニール袋(材料表を参照)に入れます。</li>
	<li>サンプルID、緯度、経度、日付、基材の説明、および周囲および基板温度、収集時間、基板の状態、基質関連マクロインバーテブラートの存在など、実験に関連するその他の局所環境測定値を記録します。このプロセス21を合理化するためにスマートフォンアプリが利用可能です。</li>
</ol>3. ベアマン漏斗の配列の準備
<ol><li>じょうごごとに、ハサミを使ってゴムチューブのセグメントを切り取ります( 材料表を参照)。</li>
	<li>プラスチック漏斗の端にチューブセグメントをフィットさせます( 材料表を参照)。フィット感が非常にタイトであるため、これはいくつかの努力を必要とするかもしれません。</li>
	<li>チューブクランプをゴムチューブの上にスライドさせ、締め付けます。</li>
	<li>漏斗のホールを作るためには、平らな出荷の向きから一緒に折り畳まれていない段ボールフライバイアルトレイ( 材料表を参照)の底部に直径35mmの円形の穴を切断するためにメスを使用します。標準トレイは、3 x 4アレイにこれらの穴の12を収容することができます。</li>
	<li>段ボールを反転し、側面を1回折りたたみ(フライバイアルトレイを作るように2回ではない)、側面をテープでつなぎ、逆段ボールトレイを高めます(図2)。</li>
	<li>穴に漏斗を置き、まずチューブクランプが閉じた位置にあることを確認します。</li>
</ol><img alt="研究室での逆さまのプラスチックカップ用の段ボール点滴乾燥セットアップ。乾燥プロセス、機器の使用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:段ボールフライバイアルトレイ、折り畳み、カットを行い、それぞれ12台のBaermannファネルをサポートします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
4. 漏斗へのサンプルの転送
<ol><li>各漏斗に水(利用可能な限り無菌)を注ぎ、リムの約3cm下に充填します。気泡がチューブに閉じ込められている場合は、漏斗をタップして放出します。</li>
	<li>手袋をはめた手で、漏斗の上に糸くずのないワイプまたは具体的にキムワイプ(正方形を作るために半分に折りたたむ)を置き、水に沈むように中央を押し下きます。</li>
	<li>手動で自然の基質(果物、花、土壌、葉のごみなど)の大きな固体部分を小さな断片に分割し、ワームが基板から落下するために移動しなければならない距離を最小限に抑えます。 注:葉のごみやぎこちない形のサンプルは、フードプロセッサーやブレンダーで前処理することができます。</li>
	<li>天然基質(1-15 cm3)のサンプルを、組織を穿刺することなく、リムの上にサンプルが突き出ることなく、漏斗の中の組織/糸くずのないワイプの上にそっと置きます。</li>
	<li>フィールド コレクション メモに対応するサンプル ID を使用して、じょうごまたはじょうごの横の段ボールにラベルを付けます。</li>
	<li>サンプルの上にティッシュ/糸くずのワイプの角を折ります(図1B)。土壌や破片が漏斗の底に通過しないように、組織/糸くずのない拭き取りに含まれるサンプルを保管するように注意してください。 注:このステップは、角が漏斗の端にドレープするのを防ぐためで、漏斗の側面から水を吸い取ります。</li>
	<li>手、へら、またはピペットの先端で、漏斗から漏斗、交差汚染サンプルに移動する可能性のある活性昆虫、ミリペデス、または他の動物を選び出します。サンプルの周りにティッシュ/糸くずのないワイプを完全に包むか、クロス汚染を防ぐためにサンプルの上部に第2のティッシュを置く。</li>
	<li>サンプル全体を水没させるために、漏斗にさらに水を追加します(図3)。</li>
</ol><img alt="注入技術、浸漬時間分析、およびテイスティングセットアップによるお茶サンプルの実験。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:ベアマンファネルを組み立てた。 各サンプルはティッシュ/糸くずのないワイプで包まれ、漏斗の水の下に沈め、締め付けられる。12時間の期間にわたって、線虫は組織を通って漏斗の底に移動します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
5. 漏斗からの線虫の抽出
<ol><li>〜12時間または一晩待ちます。この間、アクティブワームは、組織/糸くずのないワイプを介して、クランプされた漏斗の底まで、基質からくねくねします。 注:12時間よりずっと長く待つことは、低酸素症や病原性感染によるワームの死亡を危険にさらし、特にワームや細菌で混雑しているサンプルの期間が短い場合にもリスクがあります。</li>
	<li>OP50 大腸菌 のスポットで播種された60mm NGMワームプレートの底に漏斗のサンプルIDを書きます。プレートから蓋を取り外します。</li>
	<li>そのサンプルを含む漏斗を漏斗スタンドから取り外します。一方の手で漏斗を開いたワームプレートの上に直立させ、もう一方の手でチューブクランプの圧力を解放し、一滴の水がチューブからワームプレートに落ちるようにします(図1C)。漏斗から水が落ちるとすぐに、NGMプレートの洪水を防ぐためにすぐに再び閉じます。 注: カエノハブディティス 種を含むOP50に引き付けられたワームを選択するには、細菌の芝生から離れてドロップを解放します。水がプレートに浸かるか、蒸発すると、 カエノーハブディティス 線虫は細菌の芝生に這い込みます。</li>
	<li>クリーンアップ:漏斗の内容を捨てる。その後の再利用のために、お湯で漏斗を洗います。</li>
</ol>6. 文化の確立
<ol><li>5x-50倍の倍率で、離れた線虫を実体顕微鏡で観察します。プレートには線虫を含め、はるかに低い周波数では、小さなオリゴカイト・アンネリド、タージグレード、ロティファー、および小さな甲殻類を含める必要があります(図4)。 注:漏斗が正しく設定されている場合、ミコン、昆虫、または目に見える生きている材料は漏斗を通してそれを作っていないでしょう。</li>
</ol><img alt="個体群密度を示す線虫の顕微鏡画像。生物学的研究分析に役立ちます。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:バーマンの漏斗からNGMプレートに最初に放出された液滴の内容物<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig04large.jpg" target="_blank"></a>。
<ol start="2"><li>アイソヘマフロダイトまたはアイソメスラインを確立するには、ワームピックを使用して、各L4雌雄同体または交配した成人女性(より大きな体の大きさと雄の尾部の欠如によって認識可能)をOP50で播種された別の35mm NGMプレートに移します(図1D)。ワームを転送する前と後にワームピックを殺菌するためにライターを使用してください。</li>
	<li>パラフィンフィルムを使用して、プレートを十分にラップして移動します。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

この方法の中心的な原則は、線虫が水中に沈んだ組織を通過する一方で、その基質およびより大きな無脊椎動物汚染物質は通過しなくて済むということです。プロトコルの重要なステップは、(1)適切な基板を収集し、(2)基板を浸入し、ろ過材料に包み、水中、(3)フィルターを通過して水の底に沈んだワームを収集し、(4)個々のワームを単離して等雌またはアイソヘルマフロダイト線を作成する。この方法の他のすべての部分は、利用可能なリソース、基板の性質、またはフィールドワークの目標に応じて、必要に応じて変更を受けやすい。検討する価値のある変更点は以下の通りです。
果物を植えることによってワームに餌を与える 現場に見られる細菌が豊富な腐敗物質が十分に供給されていない場合は、リンゴやトマトなどのサンプルをロットに持ち込んで腐敗させたいと思うかもしれません。大きな動物がそれらを取り除かないように、いくつかのステークで餌をよくピン留めし、後で簡単に収集することができます。直射日光を避け、餌が腐敗する前に乾燥する可能性があります。
どのような材料から漏斗装置を構築する チューブクランプを収容するのに十分な大きさの穴を持ち、トップヘビーファネルを支えるのに十分安定した穴を持つ構造は、動作します。単一の漏斗のために、飲むガラスは適したホールダーである。顔のティッシュ、トイレットペーパー、ペーパータオルなど、あらゆる種類のティッシュを使用できます。
低酸素症や感染を防ぐために、漏斗に少ない材料を入れる、または待ち時間を調整する サンプルに非常に高濃度のワームや細菌が含まれている場合、線虫は12時間のインキュベーションが完了する前に低酸素症または感染によって死に始める可能性があります。これが懸念される場合、研究者は漏斗を早期にチェックするか、人口の多い基板の非常に小さなサブサンプルで追加の漏斗を準備することができます。
実験ニーズと制約に合わせてNGMプレート調製を調整する NGMプレートは、実験に適したあらゆる媒体および食料源で調製することができる。上記のフィールド プロトコルは、手荷物の重量を最小限に抑えるように設計されています。手荷物の制限やフィールドワークのタイミングによっては、実験室で準備されたNGMプレートや商業的に購入したNGMプレートを持参する方が、フィールドにプレートを注ぐよりも好ましい場合があります。
実験室で漏斗の隔離を行う プロトコルは、それが自然界で発生するように線虫集団を捕獲するために、フィールド条件下で完全な手順を実行することを記述します。いくつかの研究目標では、密封された袋の中のサンプルでラボに戻った後、後で線虫を分離するのに十分かもしれません。それでも、Baermannの漏斗法は他の分離方法より生き残った線虫のよりきれいで完全なサンプルを提供する。しかし、密封された袋のサンプルは、温度および低酸素の潜在的な極端にさらされるため、旅行中に選択を経験する可能性があります。これを最小限に抑えるには、サンプル収集後できるだけ早く分離を実行します。
Baermann漏斗に対する一般的な代替方法は、基板をNGMプレートに直接置き、ワームが這い出すのを待つことです。また、ミテや昆虫の幼虫で汚染されたプレートを生成します。Baermannの漏斗方法は、活性ワームの全集団をその基質から素早く分離するための低コスト、低技術、低労働戦略です。
Baermannの漏斗法は、野生の線虫のすべてのタイプを収集するために普遍的に適用されません。植物に住む線虫の中には、基質から出てくるのに12時間よりもはるかに長い時間がかかり、あまりにも早く放出される液滴には欠け、一部の昆虫寄生虫は底ではなく漏斗の上部に這い上がり、collection14を回避します。Baermannの漏斗に代わるものは、ワームを回復するために、より専門的な機器またはより多くの労力を必要とします。ただし、上記の注意点が実験の問題である場合は、依然として推奨される場合があります。van Bezooijen14によってレビューされた代替オプションには、漏斗に水の一定の霧を提供し、酸素を追加し、懸濁液中の細菌のオーバーフローを可能にする漏斗スプレー法が含まれます。これにより、植物からの線虫のより長い抽出期間が可能になります。ブレンダー遠心浮揚法は、比重によって分離することによってゆっくりと移動、非アクティブ、または上向きに這う線虫を回復し、オーステンブリンク溶離器は浮遊線虫から分離された沈降沈降に底流を適用し、Cobb's Methodは一連のふるいを使用して線虫をその大きさ、形状、およびsmentationrateによって分離する。しかし、rhabditidを収集するために、Baermannファネルは効果的に迅速かつ最小限の労力でクリーンなサンプルを生成します。

実験室でC.エレガンスを研究する研究者が、野生のC.エレガンスと関連するrhabditid線虫に焦点を当てるにつれて、貴重な生物学的洞察が浮上しています。野生の線虫の研究は、遺伝子とゲノムを自然な文脈に置き、実験室の条件によって潜在的に隠された機能を明らかにする1,2,3,4,5。これらの研究は、進化自体の前提条件に関する洞察を生み出します, 遺伝的変異6,7,8,9,10.野生のサンプルによって捕捉された自然な遺伝的変異はまた、多くの複雑な形質11,12,13の遺伝的基盤への侵入を提供する。
線虫の自然集団の分離を必要とする研究を設計する場合、特にリモートフィールドワークを行う場合、実用的な考慮事項が第一に来る。このプロトコルは、餌または野生の基質からOP50上で培養することができる活性線虫の全集団をきれいに隔離することを目的とする。この方法は、 カエノルハブディティス、 オシャリウス、 プリスティオンコスを含む自由に生きるラブディチドおよびジプロガステリド線虫を抽出するのに適しています。
基質から線虫を単離する技術は数多くあります14,15。最も基本的なアプローチは、基板を線虫媒質プレートに直接配置し、動物が這い出るときに動物を8,15に引き出す方法です。この方法は、サンプルからすべての線虫を分離することが目標である場合、大量の時間と労力を必要とします。より洗練された技術は、動物の体重、サイズ、移動性、またはこれらの14のいくつかの組み合わせを利用しています。各方法には、セットアップとスループットの点で利点と欠点があります。また、サンプリングバイアスが異なり、サンプル中の動物が方法の分離原理の軸に沿って変化する場合は、特定の線虫を選択することができます。
バールマン漏斗法は、寄生虫hookwormworm16を含む土壌に住む線虫を研究しながらジャワで装置を発明したオランダの医師G.K.T.F.バーマンによって1917年に最初に記述されました。バーマンの漏斗は移動性の主義に基づいて機能する。基板は布または紙のフィルターが並ぶ漏斗に配置され(現在のプロトコルでは「リントフリーワイプ」と呼ばれるこの研究に「キムワイプ」が使用されます)、下部に密閉されています。じょうごは水で満たされ、フィルターが密閉された出口から分離している間サンプルを水に浸します。サンプル中の活性線虫は、水の中に自分自身を解放し、フィルターを泳ぎ、最終的に漏斗の底に落ち着きます。漏斗出口が開き、線虫の滴がプレートに排出される(図1)。
<img alt="分解プロセス、ベルレーゼ漏斗抽出、昆虫分離図、昆虫学的研究セットアップ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:バーマン漏斗技術の概要. (A)関心のある部位から細菌が豊富なサンプルを収集する。(B)ベアマン漏斗にサンプルを沈め、ワームがうごめいて沈むのを待つ。(C) 漏斗から一滴を解放する。(D) 単一の雌雄同体または交配した雌を別々のプレートに移動する。イラストはラミン・ラーニ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
Baermannの漏斗はあらゆる種類の線虫に対しては機能しません(特定の選択肢については「議論」セクションを参照)、 カエノアハブディティス または小さい14のサイズ範囲でアクティブなフォームに最も適しています。しかし、研究がバーマン漏斗を使用できる場合は、多くの利点があります。この方法は、限られたセットアップ、実践的な時間、およびコストを必要とする、現場で実用的です。研究者は、プレート上の基板の閉塞なしにきれいなサンプルを残し、容易に選ぶことを作る。フィルターを使用すると、昆虫の幼虫やミカによるプレートの汚染も防止され、プレートを噛んだり、サンプル中の線虫を捕食したりします。最も重要なことは、Baermannの漏斗は、研究の設計に応じて必要とされるかもしれない基質14からほぼ全集団を効率的に抽出する。例えば、野生集団の段階や性分布を数えたり、成長が遅い遺伝子型や稀な遺伝子型を見つけたり、OP50に引き付けられていない線虫をサンプリングすることに興味を持つ研究者は、この方法の恩恵を受ける可能性があります。これは、サンプリングスキームがサンプリング時間に人口のスナップショットを取るので、生態学的17、集団遺伝的18、またはmetagenetic19 の質問を研究している研究者に適しています。
本稿は、ベアマンの漏斗を用いて線虫の集団を隔離し、容易な輸送のために選ばれた装置を用いて、現場にイソメスおよびイソヘルマフロダイト線を確立するための完全なプロトコルを記述する。研究室の近くでフィールドワークを行っている研究者にとって、これらのステップの多くは省略または簡素化することができます。

<table><tbody><tr><td>1 L ガラス瓶</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ステップ1 - プレートメディアを作るための容器</td></tr><tr><td>1 mLピペットチップ</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>ステップ1 - ワーム培地の添加剤とシードプレートを分注</td></tr><tr><td>1 mLピペッター</td><td>任意の</td><td>NA</td><td>ステップ1 - ワーム培地の添加剤とシードプレートを分注</td></tr><tr><td>35 mmウォームプレート</td><td>Tritech</td><td>T3500</td><td>ステップ1 - ウォームプレート</td></tr><tr><td>内径4mmゴムチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>14178A</td><td>ステップ 3 - 漏斗</td></tr><tr><td>の一部 60 mm ウォーム プレート</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>ステップ 1 - ウォーム プレート</td></tr><tr><td>65 mm ファンネル</td><td>フィッシャー</td><td>22170156</td><td>ステップ 3 - ファンネルの一部</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>フィッシャー</td><td>C79-500</td><td>ステップ 1 - ウォーム プレート ミディアム</td></tr><tr><td>クッキング ポット</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ステップ 1 - 寒天を溶かしてプレート</td></tr><tr><td>を注ぐための水浴大腸菌株OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td>ステップ1 - ワーム食品</td></tr><tr><td>フィールド顕微鏡</td><td>OMAX</td><td>G223CS</td><td>ステップ6 - フィールドでワームを表示するため</td></tr><tr><td>フライバイアル収納トレイ</td><td>アゼルサイエンティフィック</td><td>ES-260T</td><td>ステップ3 - 12漏斗を保持するためのプラットフォームを構築する</td></tr><tr><td>ホットプレートまたはストーブ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ステップ1 - ウォーターバス</td></tr><tr><td>Kimwipesを加熱する</td><td>KimberlyClark</td><td>34120</td><td>ステップ 4 - 漏斗用フィルター LB</td></tr><tr><td>培</td>地 <td>Gibco</td><td>10855021</td><td>ステップ 1 - OP50</td></tr><tr><td>Lighter</td><td>NA</td><td>NA</td><td>成長用 ステップ 6 - ワームピックを滅菌する</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td>ステップ 1 - ウォームプレート媒体</td></tr><tr><td>NGM-lite 寒天</td><td>USBiological</td><td>N1000</td><td>ステップ1 - ウォームプレート媒体</td></tr><tr><td>パラフィルムMラッピングフィルム</td><td>フィ</td><td>ッシャー13-374-10</td><td>ステップ6-旅行用パックワームプレート</td></tr>リン酸<tr><td>二塩基性</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP363-500</td><td>ステップ1-ウォームプレート中</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>フィ</td><td>ッシャーP285-3</td>ステップ<td>1-ウォームプレート中メス</td></tr><tr><td></td><td>NA</td><td>NA</td><td>ステップ3-漏斗</td>は</tr><tr><td>さみ</td><td>NA</td><td></td><td>の穴を開けるステップ3 - ゴムチューブをカット</td></tr><tr><td>テープ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ステップ3 - 漏斗ホルダーをテープで固定</td></tr><tr><td>チューブクランプ</td><td>フィッシャー5869</td><td></td><td>ステップ3 - 漏斗の一部</td></tr><tr><td>ウォームピック</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ステップ6 - 個々のワームを分離するため</td></tr><tr><td>ジップロックスタイルの収納袋</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ステップ2 - 基板サンプルを袋詰めする</td></tr></tbody></table>

ベアマン・ファネルによる野生の線虫の迅速な分離

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

堅牢な実験モデル生物であるだけでなく、 カエノハブディティス・エレガンス とその親族も自然界に生息する本物の動物です。自然環境における野生の線虫の研究は、独特のゲノムおよび現象の文字が進化する選択的な体制、複雑な形質変化の遺伝的基礎、およびすべての動物集団の基本的な自然遺伝的多様性を含む、生物学の多くの側面を理解するのに価値がある。この原稿は、腐った果物、花、真菌、葉のごみ、土壌など、自然の基質から線虫を抽出するための簡単で効率的な方法を説明しています。バーマン漏斗法は、古典的なネマトロジー技術であり、活性線虫をその基質から選択的に分離する。Baermannの漏斗技術は、サンプルからほぼすべての活性ワームを回収するため、豊富で急成長している遺伝子型と共に発生する稀で成長の遅い遺伝子型の回復を可能にし、複数世代の生殖を伴う抽出方法では見逃される可能性があります。この技術は、メタジェネティック、集団遺伝学的、生態学的な問題にも適しています。それは、年齢、性別、および遺伝子型の自然分布の公平なビューを可能にする、同時にサンプル内の全集団をキャプチャします。このプロトコルは、現場での大規模な展開を可能にし、基板をワームプレートに急速に変換し、複数の大陸のフィールドワークを通じて検証しました。

このプロトコルは、2018年8月にスミソニアン熱帯研究所のフィールドステーションで、パナマのバロコロラド島で果物、花、真菌、土壌、茎から線虫を分離するために使用されました。1人の研究者が4日間にわたって処理した131個の基質のうち、130個の基質(99.2%)が線虫を生み出した。44個の基質(33.6%)がカエノーハブディティス線虫を生み出した(図5)。これら44の基質から確立された培養物の分析は、PCRおよび交配試験23によって、6つの異なるカエノルハブディティス種(C.ベセイ、C.熱帯、C.ブリッグサ、C.sp.24、C.sp.57、およびC.パナメンシス)の存在を明らかにした。
このプロトコルは、2019年8月に4日間にわたって、ウクライナのチェルノブイリ排除ゾーンの様々な基質から線虫を分離するために再び使用されました。生きたワームは、63個の土壌サンプルのうち62個、無脊椎動物サンプル17個中1つ、果物サンプル75個中31個、12個の餌サンプルのうち1つ(ディスカッションセクションを参照)から回収され、キノコ、川のリード、またはオオカミの便サンプルからワームは回収されませんでした(各サンプル1個)。その後の18SリボソームDNA15のシーケンシングは、これらの線虫をオシャシウス、パナグロライム、アクロベロイデス、メソルハブディティス、パナグレロス、プリスティオンチュス、ペロテラと同定したが、カエノールハブディティスは同定されなかった(図5)。
<img alt="ウクライナのパナマにおける線虫およびCaenorhabditisサンプルの場所別および収集率の棒グラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5: 2 回のコレクション トリップの成功率 2018年のパナマ(左)と2019年のウクライナ(右)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、現場の天然基質から生きた線虫を効率的に抽出する方法を概説する。

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

カエノーハブディティス線虫は、自然の中に住んでいる本物の動物です。野生の線虫を収集し、実験室の人工的な条件によって隠される可能性のある自然な文脈で遺伝子やゲノムを研究することができます。この技術は、現場の細菌が豊富な有機基質からワームを抽出し、ペトリ皿にきれいな培養物を作り出し、収集された時点で各集団のスナップショットを撮影する。これらの集団は、生態学、集団遺伝学、またはメタ遺伝学の質問に適しています。野生株培養は、定量的遺伝学的研究のためにも貴重である。このテクニックは、現場研究初心者にとってもシンプルで実行が簡単です。しかし、成功した収集旅行は、旅行の前に、材料の思慮深い準備を必要とします。腐った果物、花、真菌、草本植物の茎、土壌、または葉のごみなど、フィールド内の細菌が豊富な基質を特定します。小さなボリュームの基板をラベル付きのビニール袋に入れます。腐敗材料が興味のあるフィールド側でまれである場合は、餌としていくつかの果物を置きます。それを岩に任せて、それを取り出し、それを植民地化したワーム。基板のサンプルID、緯度、経度、日付、説明を記録します。周囲および基板温度、基板条件、収集時間、および基質関連マクロ無脊椎動物の存在など、実験に関連する他の局所的な環境測定値を記録する。はさみを使用して、各漏斗からゴムチューブの3センチメートルのセグメントをカットします。プラスチック漏斗の端にチューブを取り付けろ。チューブクランプをゴムチューブの上にスライドさせ、締め付けます。漏斗のホールを作るために、展開された段ボールフライの卑劣な皿の中央に円形の穴を切った。段ボールを反転し、側面を一度折り、それらを一緒にテープで貼ります。これは、ベンチの上の穴を高める脚を作成します。チューブクランプが閉じた位置にあることを確認し、漏斗を穴に入れ、各漏斗に滅菌水を注ぎ、リムの約3センチメートル下に充填します。漏斗をタップして、チューブ内の閉じ込められた気泡を解放します。糸くずのないワイプを半分に折り、正方形を作り、漏斗の上に置きます。その後、ワイプを押し下げて水に沈めます。自然な基質の任意の大きな固体部分を手動で分割します。サンプルの一部を漏斗のワイプにそっと置きます。拭き取りを穿刺したり、サンプルがリムの上に突き出したままにしないでください。漏斗の端に水がくびれ出るのを防ぐために、サンプルの上に、慎重にワイプのコーナーを折ります。フィールド コレクション メモに対応するサンプル ID を使用して、じょうごにラベルを付けます。移動してサンプルを交差汚染する可能性のある活性な昆虫、または他の動物を選び出します。各じょうごにさらに水を加える, 全体のサンプルを水没します.一晩室温でインキュベートしながら、活性線虫は組織を揺らし、漏斗の底に沈む。6センチメートルNGMワームプレートの底に、OP50大腸菌のスポットで座った漏斗のサンプルIDを書きます。プレートから蓋を取り出し、漏斗スタンドからサンプルを含む漏斗を取り出し、開いたワームプレートの上に片手で直立したままにします。もう一方の手でチューブクランプの圧力を解放し、1〜2滴の水をチューブから細菌の芝生の隣のワームプレートに落とします。漏斗から水が落ちるとすぐに、すぐに再び閉じて、NGMプレートの洪水を防ぎます。クリーンアップするには、漏斗の内容物を投げ出し、その後再利用するためにお湯で洗います。孤立した線虫を立体顕微鏡で観察します。線虫に加えて、時折小さなオリゴキットアネリッド、タージグレード、ロティファー、小さな甲殻類があります。ISO雌雄同体、またはISO雌線を確立するには、各L4雌体素子または交配成人女性を、OP50で座った別の3.5センチメートルNGMプレートに移します。ワームピックを、転送の前後に殺菌します。最後に、パラフィンフィルムで、旅行のためにプレートを徹底的に包みます。バロコロラド島パナマでは、2018年に131個の基質がこの方法で処理されました。99%が線虫を生み出した。34%がカエノーハブディティス線虫を生み出した。チェルノブイリ排除区域ウクライナでは、2019年に、170個の基質がこの方法で処理されました。56%が線虫を生み出し、いずれもカエノールハブディティスはなかった。この方法は、線虫がワイプを泳ぐので機能します。しかし、基板や他の動物は上に滞在します。プロトコルの多くの側面を変更して、フィールドで使用可能なリソースを利用することができます。この方法を用いて収集されたサンプルは、研究者がその後の実験室研究のために確立された文化に集団生物学の質問の広い配列に対処することを可能にする。

rapid-isolation-of-wild-nematodes-by-baermann-funnel

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

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