Name: 回転細胞培養システムを用いた模擬微小重力下でのリンパ球の培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶ回転細胞培養システムを用いた模擬微小重力下でのリンパ球培養法。免疫細胞の挙動変化を地上で再現し、宇宙環境が人体生理に与える影響を分子レベルで解明する実用的アプローチです。

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この研究は、カナダ宇宙庁(CSA)の研究助成金(17ILSRA3、免疫プロファイル)によってサポートされています。著者は、このプロトコルの初期トラブルシューティングに協力してくれたRoxanne Fournier博士(トロント大学)、Randal Gregg博士(リンカーン記念大学)、Preteesh Mylabathula博士(アリゾナ大学)に感謝し、感謝します。

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著者には利益相反はありません。

人類が月と火星へのより長い宇宙ミッションの準備をするにつれて、宇宙飛行士の深刻な健康リスクを軽減するためにより多くの研究が行われる必要があります。人間の生理学に影響を与える宇宙環境の主要な側面の1つは、微小重力です。ここでは、市販の回転細胞培養系を用いてリンパ球をSMGに供する細胞培養方法を説明した。
このプロトコルには、使用する細胞の種類や株に応じて最適化する必要があるいくつかの重要なステップが含まれています。これらには、1)細胞の倍加時間とSMG処理の長さに応じて適切な播種密度を選択すること、および2)最適な処理長、回転速度、および適切なコントロールを決定することが含まれます。研究対象の細胞タイプまたは株に適した細胞濃度の中間範囲にある播種密度を選択するだけで十分です。ただし、低すぎる播種密度を選択すると、細胞の増殖と生存率が低くなり(表1)、高すぎる密度を選択すると、栄養素の枯渇が早まり、細胞の生存率が低下する可能性があります。選択された播種密度は、研究されている細胞の倍加時間にも依存します。倍加時間が短い細胞はより低い密度で播種することがで...

宇宙飛行は、免疫系を含む人間の生理学の多くの側面に影響を与えることが示されています。多くの研究は、in vivoでの宇宙飛行およびin vitroでのシミュレートされた微小重力(SMG)への曝露の結果としての免疫調節不全の証拠を示しています 1,2,3,4。人間の生理学に影響を与える宇宙環境の主要な側面の1つは、微小重力です。微小重力とは、宇宙環境における低い重力によって経験される「無重力」を指します5。人類が月と火星へのより長い宇宙ミッションの準備をするにつれて、宇宙飛行士の深刻な健康リスクを軽減するためにより多くの研究が行われる必要があります。
科学研究のための実際の微小重力条件は、国際宇宙ステーション(ISS)に搭載された宇宙または軌道に打ち上げられた超小型衛星で達成することができます。ただし、これらのオプションは、調整に非常にコストがかかり、複雑になる可能性があります。宇宙で生物学的研究を行うことの現在の限界を考えると、地球上で実際の微小重力とSMGを誘発するためのいくつかの選択肢が存在します。ドロップタワー、放物線飛行、観測ロケットなど、地球上で短期間の実際の微小重力を生み出すことができる大規模な操作が存在します。しかしながら、これらの方法は、主にそれらの短期間の微小重力処理(すなわち、数秒から20分)のために、生物学的システムに対する微小重力の影響を研究するのにあまり適していない。これらの方法については、他の場所でより詳細に説明されています5,6。生物学的細胞培養に適したオプションには、2Dクリノスタットまたは回転壁容器(RWV)デバイス、3Dクリノスタットまたはランダムポジショニングマシン(RPM)などの小規模デバイスが含まれます。これらのデバイスは、37°Cおよび5%CO2に維持された細胞培養インキュベーター内に設置することができ、水平軸(2D)または2つの垂直軸(3D)5のいずれかで細胞培養を回転させます。ただし、これらの培養方法は、生物学的研究のコンテキストで宇宙で最も実現可能な実際の微小重力とは対照的に、SMGを生成することを強調することが重要です。
現在の論文の目的は、2Dクリノスタット分類に該当する市販のRWVデバイス(材料表)を使用してリンパ球をSMGにさらすための手順を概説することです。このデバイスを操作するための一般的なプロトコルは製造元から入手できますが、現在の記事では、トラブルシューティングと最適化の手順をより詳細に説明することを目的としています。この記事では、このデバイスが浮遊細胞培養、特にリンパ球でSMGを生成するためにどのように機能するかの背後にある理論についても説明します。これに関連して、浮遊細胞培養とは、追加の足場に付着することなく、補充された培養培地中で自由に増殖する細胞を指す。リンパ球を含む多くの細胞型が浮遊細胞培養で増殖します。リンパ球は、T、B、およびナチュラルキラー(NK)細胞を含む免疫系の細胞であり、リンパ器官および血流に存在する7。
ここで説明するRWV 2Dクリノスタットは、時間平均重力ベクトル無効化5,6,8,9の原理に基づいて動作し、重力ベクトルは細胞培養物を水平軸上で回転させることによってランダム化される。これは、培養容器の回転速度を細胞の沈降速度に一致させることによって達成される。培養容器の回転速度が細胞の沈降速度とよく一致している限り、細胞は自由落下に保たれ、宇宙環境で経験したように沈降することはできません。最初のスピードアップ段階の後、培養容器内の培地は最終的に時間の経過とともに「固体回転」に達します。この水平回転はまた、細胞培養容器内の層流を誘導する。これは、層流によって細胞に誘発されるせん断応力が乱流のせん断応力よりもはるかに小さいことを考えると、「低せん断」環境を作り出します。ただし、クリノスタットが完全なシステムではないことを考えると、細胞に与えるせん断応力を最小限に抑える小さな層流運動が導入されています。そのため、培地に浮遊している細胞は、回転中にこの流れによって引きずられます。水平回転中、重力ベクトルは細胞に作用し、図1に示すように細胞を振動軌道に導きます。せん断応力の別の小さな原因は、細胞が培地を通って「落下」し、細胞の周囲に層流を引き起こすことによって引き起こされます。培養容器が水平軸を中心に回転すると、細胞が経験する重力ベクトルも回転します。時間の経過とともに、この回転する重力ベクトルは平均してゼロに近づきます。この現象は時間平均重力ベクトル無効化と呼ばれ、SMG 5,6,8,9の状態を誘発する。この装置は、多くの種類の細胞に対するSMGの影響を研究するために使用されており、そのうちのいくつかは参考文献10、11、12でカバーされています。その他の例は、デバイスの製造元の Web サイトにあります。
このRWVデバイスは、デバイスメーカーから入手できる特殊な「高アスペクト比船舶」(HARV)を使用しています。これらのHARVはそれぞれ10 mLの細胞培養を保持します。ただし、50mLのHARVも入手可能です。10 mLまたは50 mLのHARVは、ダウンストリームの実験アッセイを完了するために必要な細胞数に応じて使用できます。HARVはポリカーボネート製で、細胞培養中のガス交換を可能にするシリコーン酸素化膜を備えています。これにより、細胞培地のpHが維持され、効率的な細胞呼吸が可能になります。容器の表面には、メイン充填ポートと2つのキャップ付きシリンジポートがあります(図2A)。細胞培養物をメイン充填ポートにロードした後、2つのシリンジを容器にロードして、気泡の除去を支援します。10 mL容器を使用する場合は、2つの3 mLシリンジがうまく機能します。一方のシリンジを空のデバイスに取り付け、シリンジを完全に押し下げ、もう一方のシリンジを3 mLの細胞培養液で満たして取り付けます(図2E)。これらは、SMG処理を維持するために重要な容器から気泡を除去するために組み合わせて使用されます。一般に、「フラスコ」コントロールと「1G」コントロールと呼ばれる2つのネガティブコントロールを設定することをお勧めします。「フラスコ」コントロールは、標準的なT25浮遊細胞培養フラスコ中で増殖される細胞に対応する。1Gコントロールは、インキュベーターに入れるだけの特殊な10 mL培養容器内で増殖する細胞に対応します(つまり、SMG処理を受けることなく)。コントロールの詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください。
ここで説明する方法は、NK92細胞株13を使用してNK細胞に特に焦点を当てて、リンパ球に対するSMGの影響を研究しようとしている研究者に適しています。これらの研究の結果は、宇宙飛行が人間の免疫系に及ぼす悪影響をよりよく理解し、軽減するのに役立つ可能性があります。

<table><tbody><tr><td>ディスポーザブル高アスペクト比容器 (HARV) (10 mL)</td><td>Synthecon</td><td>D-410</td><td>ガンマ滅菌培養容器 (4/箱)</td></tr><tr><td>Luer-Lokチップシリンジ (3 mL)</td><td>BD</td><td>309657</td><td>10 mL HARVs</td></tr><tr><td>NK92 細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td></td></tr><tr><td>ロータリー細胞培養システム (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4D</td><td>回転式壁容器装置; 2D クリノスタット</td></tr><tr><td>Sarsedt 15 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-809-220</td><td></td></tr><tr><td>Sarsedt 50 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>Sarsedt 滅菌血清ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>T25 懸濁培養フラスコ</td><td>Sarsedt</td><td>83.3910.502</td><td>フラスココントロール用</td></tr></tbody></table>

回転細胞培養システムを用いた模擬微小重力下でのリンパ球の培養

Culturing Lymphocytes in Simulated Microgravity Using a Rotary Cell Culture System

宇宙で生物学的研究を行うことの現在の限界を考えると、細胞培養を地球上のシミュレートされた微小重力(SMG)にさらすためのいくつかの選択肢があります。これらのオプションは、方法、原理、および浮遊細胞培養での使用への適合性が異なります。ここでは、2Dクリノスタットまたは回転壁容器(RWV)装置としても知られる市販の回転細胞培養システムを用いて、リンパ球を模擬微小重力に供するための細胞培養方法について説明する。この細胞培養法は、時間平均重力ベクトル無効化の原理を利用して、細胞を水平軸上で回転させることによって微小重力をシミュレートします。このシステムで培養された細胞を回収し、細胞機能と生理機能に対するシミュレートされた微小重力の影響を評価するために、さまざまな実験アッセイで利用することができます。培養技術は、使用する細胞種や系統によって若干異なる場合がありますが、ここで説明する方法は、どのような浮遊型細胞培養にも適用できます。

この培養方法は、1)細胞の増殖が対照群(理想的にはすべての実験群)間でほぼ一貫していること、2)播種密度、処理期間、および細胞の種類/株の倍加時間を考慮して増殖が適切であり、3)採取した細胞の生存率が85%以上である場合に成功と見なされます(表1).理想的には、得られた細胞は、特にその後の実験およびアッセイで使用するために、標準的な細胞培養の場合と同じくらい健康でなければなりません(すなわち、生存率85%以上)。この培養方法は、逆の場合に失敗したと見なされ、その結果、得られた細胞は死滅するか、対照群間で増殖が大幅に異なるか、または約70%以下の生存率が最適ではありません(表1)。SMG治療群における増殖は、SMG治療が細胞生理機能にどのように影響するかに応じて、対照と比較して異なる場合とそうでない場合がある。しかし、これは今日まで問題ではなく、細胞増殖は対照群と治療群でほぼ同等でした(表1)。前述のように、これらのパラメータは下流のアッセイと実験の成功にとって重要であり、2つの対照群から得られた細胞は比較的同じように機能するはずです。<...

市販の回転細胞培養システムを用いて、専用の使い捨て培養容器を用いて模擬微小重力下でリンパ球を培養するためのステップバイステップガイドです。この培養方法は、いずれの浮遊型細胞培養にも適用することができる。

Given the current limitations of conducting biological research in space, a few options exist for subjecting cell culture to simulated microgravity (SMG) ...

この手法により、模擬微小重力が免疫細胞に及ぼす影響を研究し、宇宙環境の側面が分子レベルで人間の生理機能にどのように影響するかをよりよく理解するのに役立ちます。この技術は経済的に実現可能であり、細胞培養物を宇宙に送ることや、細胞培養物を地球上でシミュレートされた微小重力にさらす他の方法と比較して、セットアップと保守が比較的簡単です。オーバーフローやこぼれを避けるために、容器を満たしながらゆっくりと進むことをお勧めします。最初の気泡除去後、シリンジを使用して血管が完全にいっぱいになっていることを確認します。これにより、治療中に大きな気泡が形成される可能性が最小限に抑えられます。まず、プラスチック包装から培養容器を取り出します。リムの各血管は、コントロールまたは治療のいずれにあるかにかかわらず、使用されている細胞の種類またはライン、およびその他の関連情報に従ってラベルを付けます。容器を安定させ、充填ポートキャップペグまたはOリングに触れずに充填ポートを慎重に開きます。容器が満たされている間、ペグまたはOリングを上に向けてエタノールパッドにキャップを置きます。シリンジポートからキャップを取り外さないでください。滅菌血清学的ピペットを使用して、細胞培養に適した完全培地10 mLを容器にロードし、キャップを充填ポートに慎重に置きます。シリンジポートキャップと充填ポートがしっかりと閉じていることを確認します。次いで、充填された容器をインキュベーターに入れ、その後の工程を行いながら、細胞培養のために容器をプライミングする。培地プライミング容器をインキュベーターから取り出します。フラスココントロールの場合は、上記で調製したストックから10 mLの細胞培養物をT25浮遊培養フラスコにロードします。10 mLのストック細胞培養液を、シリンジのロードに使用する別の15 mLコニカルチューブに追加します。シリンジポートキャップを緩めて容器から取り外し、ストック活栓が開いた位置にあることを確認します。容器を安定させ、充填ポートキャップペグまたはOリングに触れずに充填ポートを慎重に開きます。容器が満たされている間、ペグまたはOリングを上に向けてエタノールパッドにキャップを置きます。活栓が開いた位置にあることを確認してください。容器は、血清学的ピペットを使用して容器から廃棄物容器に培地を注ぐことによって空にすることができる。または、真空システムに取り付けられたピペットを通過させる滅菌ガラスを使用して培地を吸引します。ピペットや真空システムを使用しているときは、酸素化膜が損傷し、容器が使用できなくなる可能性があるため、触れないようにしてください。調製したストック細胞培養物を含む50 mLコニカルチューブをしっかりと閉じ、ゆっくりと数回反転させて内容物を完全に混合します。新鮮な滅菌血清学的ピペットを使用して、50 mLチューブから10 mLの細胞培養ストックを引き出します。容器を持ち上げて傾け、充填口が上を向くようにします。次に、細胞培養ストックを充填ポートから容器に慎重に分注します。こぼれないように容器を後ろに傾けながら、容器を充填ポートの先端まで充填します。ピペットで酸素化膜は非常に壊れやすいので触れないように注意してください。容器に積み込まれたら、Oリングに触れずに充填ポートキャップを慎重に元に戻します。最初の3 mLシリンジをパッケージから取り出し、数回ポンプで押して緩めます。次に、シリンジをシリンジポートの1つに取り付け、シリンジが完全に押し下げられていることを確認します。10 mLのアリコート細胞培養物を含む15 mLのコニカルチューブをしっかりと閉じ、ゆっくりと数回反転させて内容物を完全に混合します。同様に、2番目の3 mLシリンジをパッケージから取り出し、数回ポンプで送ります。次に、このシリンジを15 mLコニカルチューブから細胞培養物に注意深く半沈め、培養液を吸引します。シリンジを完全にチューブに分注し、3 mLの培養液を吸引することで、気泡を最小限に抑えます。充填されたシリンジを残りのシリンジポートに取り付け、シリンジと充填ポートの周囲をエタノールパッドで慎重に消毒します。酸素化膜にエタノールが付着しないでください。残りの容器についてもこのプロセスを繰り返します。最後の容器の50 mLコニカルチューブに細胞培養がわずかに不十分に残っている場合は、シリンジのロードに使用した15 mLコニカルチューブから残りの量を回収します。シリンジポートの活栓を閉じて、シリンジから血管への細胞と気泡の移動を制限します。容器を逆さまにして数回横に叩いて、最初の泡を集めます。容器をすばやく後ろにひっくり返して上向きにし、次に反対側を向いてわずかな角度で、泡がすべて容器の上側に浮くようにします。空の注射器でポートの下の泡を操作し、それらがポートに入り始めるのを見てください。両方のシリンジポート活栓を開きます。容器をそっと叩いて、泡が空の注射器に浮かぶのを促します。空のシリンジで大きな気泡をゆっくりと吸い上げながら、シリンジ全体を慎重に押し下げて容器内の圧力を維持し、酸素化膜が破裂しないようにします。このプロセスを数回繰り返して、すべての気泡が除去されていることを確認します。気泡が効果的に除去されたら、シリンジポート活栓を閉じます。治療中はシリンジをオンのままにして、その後の気泡除去を可能にし、両方のシリンジの容量がほぼ等しくなるようにします。回転ベースとリボンケーブルの表面を70%エタノールで慎重に拭き取ります。リボン ケーブルが電源装置に接続されていることを確認します。回転ベースをインキュベーターに入れ、リボンケーブルをベースに取り付けます。電源をインキュベーターの近くに置きますが、インキュベーターの外側に置きます。容器のねじ山を回転ペグに合わせ、ベースの回転ペグを反時計回りにゆっくりと回して、SMG処理容器を取り付けます。容器がしっかりと取り付けられていることを確認してください。オートクレーブRO水で水トレイを満たして、インキュベーターを湿度約100%に維持します。細胞が培地から落下しないように、細胞の沈降速度に合わせてインキュベーターの回転速度を調整します。治療開始の初日は、本文に記載されているように、数時間ごとに気泡の形成を確認します。希望の治療期間が終了するまで、少なくとも1日1回泡を取り除きます。計画された処理時間が経過したら、回転を停止して装置を分解します。装置の回転ペグを時計回りに回しながら容器を静かに静止させて、治療容器を取り外します。コントロールフラスコ、コントロール、および処理された容器を滅菌生物学的安全キャビネットに入れます。コントロールフラスコを除く各容器を取り、下向きになるように裏返します。次に、それを静かに叩いて、すべての細胞を懸濁させます。次に、充填口を下に向けて容器を横向きに回転させ、もう一度叩いてセルを充填口に導き、効率的な吸引を実現します。各容器を個別に取り扱います。2つのポートからシリンジを外し、バイオハザード廃棄物に分注します。シリンジポートの活栓を開きます。充填ポートキャップを慎重に取り外し、滅菌済みの10 mL血清学的ピペットを使用して内容物を吸引し、容器が空になったら傾けます。すべての対照群と治療群の内容物を、個別にラベル付けされた15mLコニカルチューブに分注します。各チューブを閉じ、数回静かに反転させて、適切に混合されていることを確認します。得られた細胞培養物の濃度および生存率を決定するための好ましい方法を使用して、その後の実験アッセイの準備をします。NK-92細胞株の開始生存率および着座密度を、得られた終末生存率および終末濃度と比較した。72時間のSMG治療後、陰性と陽性転帰の2つの事例が比較された。比較のために、使用したNK-92細胞株の最適濃度範囲は、ミリリットルあたり0.3〜120万細胞であり、倍加時間は約2〜3日でした。SMG治療群の増殖は、対照群と治療群でほぼ同等でした。.これらのパラメータは、下流の実験の成功に不可欠であり、2つの対照群から得られた細胞は、下流の実験アッセイで同様に実行されました。治療の過程を通して、特にシミュレートされた微小重力にさらされている細胞培養において、気泡の形成を監視し、考慮することが重要です。大きな気泡の形成は、容器内の流体力学に混乱を引き起こす可能性があり、これは本質的にシミュレートされた微小重力状態を無効にします。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

上皮細胞が3-D細胞凝集体の形成をもたらす生理的条件下で成長することができ、回転細胞培養システムが記載されています。凝集体は、ディスプレイを生成...

回転壁容器バイオリアクター由来3D上皮細胞モデルの培養とその応用

三次元（3-D）環境中で増殖する細胞は、2-D環境（ 例えば 、フラスコまたはディッシュ）で細胞培養上顕著な改善を示します。ここでは、回転-壁容器（RWV）バイオリアクターが提供する微小重力下で培養ヒト腸粘膜の多細胞3次元器官モデルの開発について説明します。...

微小重力下で増殖させたヒト腸粘膜の多細胞三次元器官型モデルの開発

マイクロタイタープレートからの培地の不均一な損失は、均一な多細胞腫瘍スフェロイド形成の再現性に影響を与えます。重要な媒体の損失を低減するために培養条件を改善するスフェロイド形成の再現性及び液体オーバーレイ技術を使用して回転楕円体に基づくアッセイの結果を改善します。...

蒸発低減文化条件は、マイクロタイタープレートに多細胞スフェロイド形成の再現性を高め

模擬微小重力状態での培養細胞には行列を使用して組織を生成するための非常に有望な技術を構築します。卵胞の成長と卵成熟卵胞生存、形態、成長、そして模擬微小重力条件下で卵母細胞機能の面で回転式培養システムを使用する調べたと思う。...

体外模擬微小重力下でのマウス前胞状卵胞の成長

ここで軌道振動の細胞凝集体の培養に特化した O 状の容器を使用するためのプロトコルを提案する.このバッグで育った HEK293...

哺乳類細胞培養を均一な骨材を生産する O の形をした船で揺れ、軌道

細胞回転楕円体を培養できるモータ駆動遠心マイクロ流体装置を紹介する。この装置を使用して、単一または複数の細胞タイプの回転楕円体は、高い重力条件下で容易に共培養することができる。...

多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンCDプラットフォーム

免疫療法と単一細胞ゲノムプロファイリングの時代において、がん生物学は、適切な時空間コンテキストで腫瘍と免疫のインターフェースを研究するための新しいin...

in vitro腫瘍微小環境における免疫応答を解剖するためのマイクロ流体共培養モデル

このプロトコルは、微小重力下でのアメロブラスト様細胞の培養と3D増殖を行い、細長い偏光形状とエナメル質特異的タンパク質発現を維持する方法を提示します。微小重力下での歯周工学コンストラクトや肺器官の培養のための培養条件についても記載する。...

微小重力下での歯科および呼吸器細胞および臓器の増殖

ここでは、2つのゼブラフィッシュ(ダニオレリオ)細胞株、ZEM2S(胚)とZFL(正常肝細胞)のスフェロイドを形成するための効果的で簡単かつ高速な3D培養プロトコルを紹介します。...

ゼブラフィッシュ胚および肝臓細胞株のスフェロイドの3D培養法

再現性の高いスフェロイドを増殖させるためのプロトコルと、画像キャプチャとプロテオミクスを用いた表現型特性評価について紹介します。...

機能的3Dスフェロイド細胞培養の半自動表現型解析(英語)

本稿では、光ピンセットを用いたハイブリッドスフェロイド製造のプロトコールを提案する。この方法により、他の方法では達成できないスフェロイド形成プロセスの初期段階を正確に制御することができます。...

ハイブリッドスフェロイドの生成のための光ピンセットの使用

学ぶ回転細胞培養システムを用いた模擬微小重力下でのリンパ球培養法。免疫細胞の挙動変化を地上で再現し、宇宙環境が人体生理に与える影響を分子レベルで解明する実用的アプローチです。

回転細胞培養システムを用いた模擬微小重力下でのリンパ球の培養

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