Name: 2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-16T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶ、ヒト多能性幹細胞から膵臓ベータ細胞前駆体を効率的に誘導する2D培養法。PDX1とNKX6.1の共発現を高め、糖尿病の細胞治療や膵臓発生の分子機構研究に応用可能です。

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この研究は、カタール国立研究基金(QNRF)からの助成金によって資金提供されました(助成金番号。NPRP10-1221-160041)。

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<li>Memon, B., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+diabetes%3A+Beta+cells+versus+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for diabetes: Beta cells versus pancreatic progenitors.</a> Cells. 9 (2), 283(2020).</li>
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<li>Gaertner, B., Carrano, A. C., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell+models%3A+Lessons+for+pancreatic+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Human stem cell models: Lessons for pancreatic development and disease.</a> Genes & Development. 33 (21-22), 1475-1490 (2019).</li>
<li>Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+as+a+potential+tool+for+disease+modelling+and+cell+therapy+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).</li>
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<li>Pagliuca, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+pancreatic+beta+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro.</a> Cell. 159 (2), 428-439 (2014).</li>
<li>Nair, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+endocrine+cell+clustering+in+culture+promotes+maturation+of+human+stem-cell-derived+%CE%B2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating endocrine cell clustering in culture promotes maturation of human stem-cell-derived β cells.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 263-274 (2019).</li>
<li>Russ, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+induction+of+human+pancreatic+progenitors+produces+functional+beta-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro.</a> EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).</li>
<li>Veres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charting+cellular+identity+during+human+in+vitro+%CE%B2-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation.</a> Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+human+stem+cells+resemble+fetal%2C+not+adult%2C+%CE%B2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3038-3043 (2014).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61 (8), 2016-2029 (2012).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+embryonic+stem+cell-derived+NKX6.1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+accelerates+the+maturation+of+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Journal%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo.</a> Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+human+embryonic+stem+cell-derived+NKX6.1-expressing+pancreatic+progenitor+cells+accelerates+the+maturation+of+insulin-secreting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Journal%22%5BJournal%5D)">Enrichment of human embryonic stem cell-derived NKX6.1-expressing pancreatic progenitor cells accelerates the maturation of insulin-secreting cells in vivo.</a> Stem Cells Journal. 31 (11), 2432-2442 (2013).</li>
<li>Bruin, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polyhormonal+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of polyhormonal insulin-producing cells derived in vitro from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 12 (1), 194-208 (2014).</li>
<li>Toyoda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+aggregation+optimizes+the+differentiation+of+human+ESCs+and+iPSCs+into+pancreatic+bud-like+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells.</a> Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).</li>
<li>Memon, B., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+pancreatic+progenitors+co-expressing+PDX1+and+NKX6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1.</a> Methods in Molecular Biology. , (2020).</li>
<li>Memon, B., Karam, M., Al-Khawaga, S., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+pancreatic+progenitors+co-expressing+PDX1+and+NKX6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhanced differentiation of human pluripotent stem cells into pancreatic progenitors co-expressing PDX1 and NKX6.1.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 15(2018).</li>
<li>Aigha, I. I., Memon, B., Elsayed, A. K., Abdelalim, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+two+distinct+NKX6.1+populations+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into two distinct NKX6.1 populations of pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 83(2018).</li>
<li>Ali, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+derived+from+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+recapitulate+the+genetic+signature+of+psoriasis+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes derived from patient-specific induced pluripotent stem cells recapitulate the genetic signature of psoriasis disease.</a> Stem Cells and Development. 29 (7), 383-400 (2020).</li>
<li>Elsayed, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+human+induced+pluripotent+stem+cell+line+%28QBRIi009-A%29+from+a+patient+with+a+heterozygous+deletion+of+FOXA2%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of a human induced pluripotent stem cell line (QBRIi009-A) from a patient with a heterozygous deletion of FOXA2.</a> Stem Cell Research. 42, 101705(2020).</li>
<li>Davenport, C., Diekmann, U., Budde, I., Detering, N., Naujok, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior-posterior+patterning+of+definitive+endoderm+generated+from+human+embryonic+stem+cells+depends+on+the+differential+signaling+of+retinoic+acid%2C+Wnt-%2C+and+BMP-signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Anterior-posterior patterning of definitive endoderm generated from human embryonic stem cells depends on the differential signaling of retinoic acid, Wnt-, and BMP-signaling.</a> Stem Cells. 34 (11), 2635-2647 (2016).</li>
<li>Schroeder, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+selection+of+Sox17-expressing+endoderm+cells+generated+from+murine+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Induction and selection of Sox17-expressing endoderm cells generated from murine embryonic stem cells.</a> Cells Tissues Organs. 195 (6), 507-523 (2012).</li>
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<li>Mfopou, J. K., Chen, B., Mateizel, I., Sermon, K., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin%2C+retinoids%2C+and+fibroblast+growth+factor+regulate+hepatic+or+pancreatic+fate+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Noggin, retinoids, and fibroblast growth factor regulate hepatic or pancreatic fate of human embryonic stem cells.</a> Gastroenterology. 138 (7), 1-14 (2010).</li>
<li>Mfopou, J. K., De Groote, V., Xu, X., Heimberg, H., Bouwens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+and+other+soluble+factors+from+differentiating+embryoid+bodies+inhibit+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog and other soluble factors from differentiating embryoid bodies inhibit pancreas development.</a> Stem Cells. 25 (5), 1156-1165 (2007).</li>
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<li>Shih, H. P., Panlasigui, D., Cirulli, V., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+signaling+regulates+collective+cellular+dynamics+to+control+pancreas+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ECM signaling regulates collective cellular dynamics to control pancreas branching morphogenesis.</a> Cell Reports. 14 (2), 169-179 (2016).</li>
<li>Raza, A., Ki, C. S., Lin, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+matrix+properties+on+growth+and+morphogenesis+of+human+pancreatic+ductal+epithelial+cells+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of matrix properties on growth and morphogenesis of human pancreatic ductal epithelial cells in 3D.</a> Biomaterials. 34 (21), 5117-5127 (2013).</li>
<li>Lin, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+and+laminin+promote+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells+into+insulin+producing+cells+through+activating+Akt+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Fibronectin and laminin promote differentiation of human mesenchymal stem cells into insulin producing cells through activating Akt and ERK.</a> Journal of Biomedical Science. 17, 56(2010).</li>
<li>Boretti, M. I., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+extracellular+matrix+and+3D+morphogenesis+on+islet+hormone+gene+expression+by+Ngn3-infected+mouse+pancreatic+ductal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Effect of extracellular matrix and 3D morphogenesis on islet hormone gene expression by Ngn3-infected mouse pancreatic ductal epithelial cells.</a> Tissue Engineering Part A. 14 (12), 1927-1937 (2008).</li>
<li>Boretti, M. I., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+cell+clustering+enhances+islet+beta+cell+formation+from+human+cultures+enriched+for+pancreatic+ductal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Induced cell clustering enhances islet beta cell formation from human cultures enriched for pancreatic ductal epithelial cells.</a> Tissue Engineering. 12 (4), 939-948 (2006).</li>
<li>Beattie, G. M., Rubin, J. S., Mally, M. I., Otonkoski, T., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+proliferation+and+differentiation+of+human+fetal+pancreatic+islet+cells+by+extracellular+matrix%2C+hepatocyte+growth+factor%2C+and+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulation of proliferation and differentiation of human fetal pancreatic islet cells by extracellular matrix, hepatocyte growth factor, and cell-cell contact.</a> Diabetes. 45 (9), 1223-1228 (1996).</li>
<li>Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+cell+seeding+density+influences+pancreatic+endocrine+development+during+in+vitro+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 8 (12), 82076(2013).</li>
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著者は開示するものは何もありません。

この研究では、PDX1とNKX6.1の高い共発現を持つhPSCから膵臓前駆細胞を生成するための強化されたプロトコルについて説明します。新鮮なマトリックス上での半密度でのhPSC由来内胚葉の解離および再メッキは、hPSC由来膵臓前駆細胞においてより高いPDX1およびNKX6.1をもたらした。
各ステージの成長因子カクテルはP1-ND27と非常に類似していますが、FGFとレチノイドシグナル伝達、BMPとヘッジホッグの阻害を含むより拡張されたステージ3の治療はNKX6.1の発現を増加させることが示されています。胚発生中の膵臓におけるPDX1発現は、FGFおよびレチノイドシグナル伝達ならびにBMPおよびヘッジホッグ阻害によって正に調節されるが27、29、30、本結果は、このシグナル伝達カクテルの伸長がNKX6....

糖尿病は、世界中の何百万人もの人々に影響を与える複雑な代謝障害です。インスリンの補給は、糖尿病の唯一の治療選択肢と考えられています。より進行した症例は、死体膵臓全体または膵島のいずれかの移植によって達成されるベータ細胞補充療法で治療されます1,2。免疫抑制剤の継続的な必要性に加えて、組織の入手可能性と質の制限、移植手順の侵襲性など、移植療法を取り巻くいくつかの問題。これには、ベータ細胞補充療法のための新規かつ代替的な選択肢を発見する必要性が必要です2,3。ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、最近、ヒト膵臓の生物学を理解するための有望なツールとして、また移植治療のための非網羅的で潜在的によりパーソナライズされた供給源として浮上しています4,5,6,7。ヒト胚性幹細胞(hESC)やヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)などのhPSCは、自己複製能力が高く、あらゆる組織型の人体を生じさせます。hESCは胚の内部細胞塊に由来し、hiPS細胞は任意の体細胞から再プログラムされます4,8。
指向性分化プロトコルは、hPSCから膵臓ベータ細胞を生成するように最適化されており、hPSCを膵臓発生段階までinvitroで順次指示します。これらのプロトコルは、hPSC由来の膵島オルガノイドを生成します。それらはその中の膵臓ベータ細胞の割合を増加させることで大幅に改善されましたが、プロトコルの効率は非常に変動します。NKX6.1+/インスリン+またはC-ペプチド+細胞の~40%以上に増加しない5、9、10、11、12、13。しかしながら、生成されたベータ細胞は、それらの転写および代謝プロファイルならびにグルコースに対するそれらの応答の点で、成体ヒトベータ細胞と完全に同一ではない4,5,14。hPSC由来のベータ細胞は、成体ヒト膵島と比較して、PCSK2、PAX6、UCN3、MAFA、G6PC2、およびKCNK3などの主要なベータ細胞マーカーの遺伝子発現を欠いています5。さらに、hPSC由来のベータ細胞は、グルコースに応答してカルシウムシグナル伝達を低下させています。それらは、グルコースレベルの上昇に応答して適切な量のインスリンを分泌しない共生成多ホルモン細胞で汚染されています5。一方、膵島の前駆体であるhPSC由来の膵臓前駆細胞は、ベータ細胞と比較してin vitroでより効率的に生成でき、in vivoに移植すると、機能的なインスリン分泌ベータ細胞に成熟する可能性があります15,16。臨床試験は現在、T1D被験者における移植時の安全性と有効性を実証することに焦点を当てています。
特に、同じ膵臓前駆細胞内での転写因子PDX1(膵臓および十二指腸ホメオボックス1)およびNKX6.1(NKX6ホメオボックス1)の発現は、ベータ細胞系譜5へのコミットメントにとって非常に重要です。NKX6.1を発現しない膵臓前駆細胞は、多ホルモン性内分泌細胞または非機能性ベータ細胞を生じさせる17,18。したがって、膵臓前駆細胞期におけるPDX1とNKX6.1の高い共発現は、最終的に多数の機能的ベータ細胞を生成するために不可欠である。研究によると、胚様体または3D培養は、分化細胞が凝集している膵臓前駆細胞のPDX1およびNKX6.1を増強し、PDX1 + / NKX6.1 +集団の40%〜80%の間で変動することが示されています12,19。しかし、浮遊培養と比較して、2D分化培養は、複数の細胞株への適用において、より費用効果が高く、実現可能で、便利です5。我々は最近、単層分化培養により、PDX1+/NKX6.1+を共発現するhPSC由来の膵臓前駆細胞を最大90%以上生成することを示しました20,21,22。報告された方法は、生成された膵臓前駆細胞に高い複製能力を与え、肝系統21などの代替運命仕様を防止しました。したがって、本明細書において、このプロトコルは、PDX1およびNKX6.1を共発現する膵臓ベータ細胞前駆体へのhPSCの分化のための非常に効率的な方法を実証する。この方法は、hPSC由来の内胚葉を解離して細胞密度を操作する技術を利用し、その後、FGFとレチノイドのシグナル伝達を拡張し、ヘッジホッグを阻害してPDX1とNKX6.1の共発現を促進します(図1)。この方法は、移植治療および疾患モデリングのためのhPSC由来膵臓ベータ細胞前駆体のスケーラブルな生成を促進することができる。

<table><tbody><tr><td>15 mL、円錐形、遠心チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>20X TBS Tween 20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル培養プレート、平底、蓋付き</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>50 mL、円錐形、遠心チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル培養プレート、マルチディッシュ</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>140685 Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>0-7920</td><td></td></tr><tr><td>アクチビンA</td><td>R&D</td><td>338-AC</td><td>4 mM HCl</td></tr><tr><td>抗 NKX6.1 抗体、マウスモノクローナル</td><td>DSHB</td><td>F55A12-C</td><td>に希釈 フローサイトメトリー用 1:100、免疫染色用 1:2000</td></tr><tr><td>に希釈 抗 PDX1 抗体、モルモット ポリクローナル</td><td>Abcam</td><td>ab47308</td><td>フローサイトメトリー用 1:100、免疫染色用 1:1000 に希釈</td></tr><tr><td>B27 マイナス Vit A</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、熱ショック画分、脂肪酸フリー</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>DMSO DMEMで再構成</td></tr><tr><td>、高グルコース</td><td>ThermoFisher</td><td>41965047</td><td></td></tr><tr><td>Donkey抗マウスIgG(H + L) 高交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>ロバ抗ウサギIgG(H + L)高度に交差吸着された二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td></td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>ThermoFisher</td><td>PHG0313</td><td>PBS</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>R&D</td><td>345-FG</td><td>PBSで再構成</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>23491-45-4</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12 (1X)</td><td>Gibco</td><td>12660-012</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR serum replacement</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸(ビタミンC)</td><td>シグマ</td><td>A92902</td>蒸留<td>水で再構成</td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子還元(GFR)基底膜マトリックス</td><td>コーニング</td><td>354230</td><td>解凍したストックを分量し、-20°Cで凍結します。</td></tr><tr><td>MCDB131</td><td>ThermoFisher</td><td>10372019</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-SOX17</td><td>ORIGENE</td><td>CF500096</td><td>フローサイトメトリーでは1:100、免疫染色では1:2000に希釈</td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85850</td><td>基礎培地をサプリメントと混合します。アリコートと-20°Cで保管します。Cは長時間または4°Cです。C</td></tr><tr><td>Nalgene フィルターユニット、0.2 &micro;m PES</td><td>ThermoFisher</td><td>566-0020</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>Σ</td><td>72340</td><td>蒸留水で再構成</td></tr><tr><td>NOGGIN</td><td>R&D</td><td>6057-NG</td> PBS パラホルムアルデヒド溶液 4% に <td>0.1% BSA で再構成</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ChemCruz</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td> <td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ポータブル真空吸引器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウサギ 抗 FOXA2</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>3143</td><td>フローサイトメトリーでは 1:100、フローサイトメトリーでは 1:500 に希釈免疫染色</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>岩石阻害剤 (Y-27632)</td> で再構成<td>ReproCell</td><td>04-0012-02</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 丸底ポリスチレン FACS チューブで再構成 キャップ付き、滅菌済み</td><td>Stellar Scientific</td><td>FSC-9010</td><td></td></tr><tr><td>SANT-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4572</td><td>DMSO ナトリウムで再構成</td></tr><tr><td>重炭酸塩</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>StemFlex</td><td>ThermoFisher</td><td>A3349401</td><td>基礎培地にサプリメントを混ぜます。アリコートと-20°Cで保管します。Cは長時間または4°Cです。C インスタントユース</td></tr><tr><td>TALI 細胞解析スライド</td><td>Invitrogen</td><td>T10794</td><td></td></tr><tr><td>Tali 画像処理サイトメーター 自動セルカウンター</td><td>Invitrogen</td><td>T10796</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE 100 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>12563011</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA,pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr></tbody></table>

2d培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells Into Pancreatic Beta-Cell Precursors in a 2D Culture System

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、初期の膵臓発生を研究し、糖尿病の遺伝的寄与因子を調査するための優れたツールです。しかし、hPSC由来のインスリン分泌細胞は、細胞治療や疾患モデリングのために生成することができますが、効率と機能特性は限られています。ベータ細胞および他の内分泌細胞の前駆体であるhPSC由来の膵臓前駆細胞は、2つの転写因子PDX1およびNKX6.1を共発現すると、in vitro および in vivoの両方で機能的なインスリン分泌ベータ細胞への前駆細胞を指定する。hPSC由来の膵臓前駆細胞は現在、臨床試験の一環として1型糖尿病患者の細胞療法に使用されています。しかし、現在の手順では、NKX6.1および膵臓前駆細胞の割合が高くないため、機能しない内分泌細胞の共生成と、グルコース応答性のインスリン分泌細胞がほとんど発生しません。したがって、この研究は、2D単層でPDX1とNKX6.1の共発現を最大化するhPSC由来の膵臓前駆細胞を生成するための強化されたプロトコルを開発しました。細胞密度、新鮮なマトリックスの利用可能性、hPSC由来の内胚葉細胞の解離などの要因が調節され、生成された膵臓前駆細胞のPDX1およびNKX6.1レベルが上昇し、代替肝系統への関与が最小限に抑えられます。今回の研究は、 in vitro 分化中に細胞の物理的環境を操作すると、系統の仕様と遺伝子発現に影響を与える可能性があることを強調している。したがって、現在最適化されたプロトコルは、細胞治療および疾患モデリングのためのPDX1およびNKX6.1共発現前駆細胞のスケーラブルな生成を容易にする。

結果は、最適化されたプロトコルP2-D(図1A)がPDX1とNKX6.1の共発現をアップレギュレートすることによって膵臓前駆細胞分化効率を高めることを示しています(図2A、B、および図3A)。特に、結果は、以前に発表された研究から変更された非解離プロトコル(P1-ND)と比較して、ステージ3のより長い期間とともに、内胚葉細胞の解離と新鮮な膜マトリックス上での再メッキがhPSC由来の膵臓前駆細胞(最適化されたプロトコル、P2-D)(図2および図3A)におけるNKX6.1発現を増強したことを示しました27。.また、本拡張プロトコルは、「P1-D」(プロトコル1、S3=2日、解離)および「P2-ND」(プロトコル2、S3=4日、非解離...

本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are an excellent tool for studying early pancreatic development and investigating the genetic contributors to ...

この最適化されたプロトコルは、ヒト多能性幹細胞からの膵臓ベータ細胞前駆体の生成を促進し、糖尿病の細胞治療および糖尿病生合成の基礎となる分子メカニズムの調査に使用できます。これは、2D単層培養に使用されるため、実行可能な手法です。適用が容易であり、複数の対照および患者由来の多能性幹細胞株にわたって一貫しています。これらのベータ細胞前駆体は、糖尿病患者に移植されると、インスリン分泌ベータ細胞に成熟することができ、潜在的に高血糖を逆転させることができる。したがって、私たちのプロトコルを使用して生成された膵臓前駆細胞の割合の増加は、糖尿病の細胞療法に使用できます。この強化されたプロトコルは、組織サンプルが不足しているために困難な糖尿病患者だけでなく、健康な個人における初期のヒト膵臓発生の研究に使用できます。ヒト多能性幹細胞またはhPSCコロニーが70〜80%コンフルエントに達したら、組織培養フード内で温かいPBSで2回洗浄します。次に、ポータブル真空吸引器を使用してバッファーを吸引します。次に、CHIR-99021を含むステージ1の分化培地をコロニーに加え、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、使用済み培地をCHIR-99021を含まないステージ1の分化培地と交換します。使用済みの培地を吸引し、おける内胚葉細胞を温かいPBSで2回洗浄した後、プレートを回転させて細胞の破片を取り除きます。次に、4%パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、プレートを2次元シェーカーに置きます。固定後、0.5%Tweenを含むTRIS緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、プレートをシェーカーに置きます。次に、0.5%Triton X-100を含むPBSをたっぷりと加えて固定セルを透過処理し、プレートをシェーカーに戻します。次に、新たに調製したブロッキングバッファーを透過処理細胞に加え、プレートをシェーカー上で1時間インキュベートします。次に、ブロックされた細胞に希釈した一次抗体を加え、穏やかに振とうしながら摂氏4度のシェーカーにプレートを置きます。翌日、一次抗体溶液を吸引した後、ウェルをTBSTで3回、振とう機上でそれぞれ10分間洗浄する。次に、二次抗体を添加する。光から保護するためにプレートをアルミホイルで覆い、プレートをシェーカーに室温で1時間置きます。その後、二次抗体溶液を吸引し、プレートをホイルで覆ったまま、染色したウェルを振とう機上でTBSTで10分間洗浄します。次に、核を染色するために、Hoechst溶液をウェルに加え、プレートをシェーカーの上に置きます。2〜3分後、ヘキスト溶液を吸引し、PBSでウェルを2回すすぎます。最後に、染色した細胞にPBSを加え、暗所で倒立蛍光顕微鏡を使用してイメージングします。ステージ2の1日目に、最初に温かいPBSで洗浄し、次に6ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルの温かい酵素溶液を加えて、hPSC由来の内胚葉細胞を解離します。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素に3〜5分間、または細胞が互いに剥離し始めるまで置きます。剥離したシートまたは単層の細胞をウェル内で解離し、基礎段階のハーフ培地を用いて、剥離した細胞を15ミリリットルのポリプロピレンチューブにまとめて回収します。次に、細胞をスピンダウンし、上清を廃棄し、1ミリリットルの滅菌PBSを使用してペレットを再懸濁します。自動カウンターを使用して細胞をカウントした後、細胞を再度回転させ、上清を廃棄します。次いで、ペレットをRock阻害剤を含有するステージ2の分化培地の適切な容量に再懸濁する。再懸濁した細胞を1〜50個のメンブレンマトリックスコーティングプレートにプレートし、摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。24時間後、培地をRock阻害剤を含まないステージ2の分化培地と交換します。ステージ4の終わりに、前に示したように細胞を剥離し、15ミリリットルのチューブに集めます。次に、細胞を回転させ、上清を廃棄し、細胞をPBSで洗浄し、それらを単一細胞に解離させます。自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした後、細胞を再度回転させ、ペレットを200マイクロリットルのチルドPBSに再懸濁します。次に、2ミリリットルの冷やした80%エタノールを、低速から中速に設定された渦にチューブで滴下します。キャップをしっかりと閉め、チューブをシェーカーに少し傾けて摂氏4度で一晩置きます。翌日、細胞を回転させ、ペレットをPBSで洗浄して、固定細胞の塊を解離させます。次に、固定セルを室温で少なくとも1時間、またはシェーカーで一晩摂氏4度でブロックします。次に、膵臓前駆マーカーを染色するために、適切なアイソタイプコントロール、染色なし、および二次抗体コントロールを含む条件ごとに200, 000個の細胞を96ウェルV底板に分配します。次に、プレートを短時間回転させ、素早い動きでプレートを裏返して、ペレットを失うことなく上清を廃棄します。次に、一次抗体中の細胞を、穏やかな振とうしながら振とう機上で室温で少なくとも2時間インキュベートします。次に、染色した細胞をTBSTでウェル内で上下にピペッティングして3回洗浄します。細胞を再度遠心分離し、上清を捨てて、細胞に二次抗体を加えます。室温で30分間インキュベートした後、染色した細胞をTBSTで2回洗浄します。次に、プレートを回転させ、染色した細胞を光で保護されたファックスチューブ内の100マイクロリットルのPBSに集め、フローサイトメトリーマシンでサンプルを実行します。最適化されていない方法と比較して、最適化されたプロトコルは、PDX 1とNKX 6.1の共発現をアップレギュレートすることにより、膵臓前駆細胞の分化効率を高めました。特に、内胚葉細胞の解離および新鮮な膜マトリックス上でのそれらの再播種は、ステージ3のより長い持続時間とともに、非解離プロトコルと比較してhPSC由来膵臓前駆細胞におけるNKX 6.1発現を増強した。最適化されたプロトコルを使用して生成された膵臓前駆細胞も、非解離法と比較してSOX9陽性細胞の数を増加させました。さらに、最適化された方法はまた、増殖マーカーKi67を共発現する増殖性NKX 6.1陽性細胞のより高い割合を生成した。効率を高めるためには、HbA1由来の内胚葉を解離し、FGFアミロイドシグナル伝達とヘッジホッグ阻害によるステージ3の治療期間を延長することが重要です。この強化されたプロトコルを使用した膵臓前駆細胞のスケーラブルな生成は、ヒト多能性幹細胞由来の膵臓ベータ細胞の効率と成熟の改善に関する研究を促進し、さまざまな種類の糖尿病のモデリングを可能にしました。

differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into-pancreatic-beta

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

現在の研究では、ヒト胚性幹細胞の膵臓の分化誘導の指示分化のアプローチについて説明します。大きな意義のインスリン発現する細胞に膵臓の前駆細胞由来のヒト胚性幹細胞の発見、その内皮細胞の共培養を仲介する成熟である。...

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。...

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

ここでは、下流のアプリケーション、さらに分化の改善のための胚体内胚葉に向けてコミットしている分化したヒト胚性幹細胞を精製するための方法を説明します。...

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

ここでは、in vitroで NKX6-1 +膵臓前駆細胞にヒト胚性幹細胞を区別するために4段階のプロトコルを記述します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞株の多様に適用することができます。...

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

iCRISPRプラットフォームを使用HPSC変異株を作製し、グルコース応答性β様細胞にhPSCsを区別するためのプロトコルが記載されています。 HPSC指向分化にゲノム編集技術を組み合わせることにより、人間開発と疾患の進行中の系譜決定因子の役割の体系的な分析のための強力なプラットフォームを提供します。...

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC...

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

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インビトロ 膵臓系統に向けたヒト歯髄幹細胞の誘導

幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。...

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この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。...

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マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

学ぶ、ヒト多能性幹細胞から膵臓ベータ細胞前駆体を効率的に誘導する2D培養法。PDX1とNKX6.1の共発現を高め、糖尿病の細胞治療や膵臓発生の分子機構研究に応用可能です。

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

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