Name: 微粒子濃度のための空気圧駆動マイクロ流体プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学ぶ空気圧駆動マイクロ流体プラットフォームによる微粒子濃縮法。PDMS構造体とSU8モールドを用いて、詰まりを防ぎながら多数の微小粒子を効率的に濃縮し、細胞損傷を最小限に抑える技術を解説します。

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この研究は、韓国政府(科学情報通信部)の資金提供を受けた韓国国立研究財団(NRF)の助成金によって支援されました。(いいえ。NRF-2021R1A2C1011380)。

1. 粒子濃縮のためのマイクロ流体プラットフォームの設計
<ol><li>3Dフローネットワーク内の流体フロー用の1つの空気圧バルブと、ふるい(Vs)、流体(Vf)、および粒子(Vp)バルブ操作用の3つの空気圧バルブで構成される空気圧マイクロ流体プラットフォームを設計します(図1)。 注:Vsブロックは液体から粒子を濃縮し、VfおよびVpは濃縮後に流体および粒子放出を可能にする。3つの空気圧ポートは、流体/空気圧供給層(ノーマルオープン)と空気圧バルブライト出口から圧縮空気を供給し、バルブを作動させます。マイクロ流体チャネルネットワークは、CADプログラム18、19を用いて設計されている。</li>
	<li>チャンネルを空気圧供給層と3Dチャンネルネットワーク層として設計します(図2)。 注:流体ネットワークは、前部の湾曲したチャネルおよび後部の長方形のチャンバと相互接続されている。Vsは入口を塞ぎ、粒子は湾曲した流体チャネルの収集領域に蓄積する。粒子を含まない流体(粒子を含まない液体)はQf出口を通って出され、濃縮粒子はQp出口を通って出ます(図3)。</li>
	<li>上記条件に従って、4種類のSU-8金型を作製した。 メモ:4つの金型には、空気圧でバルブを制御できる金型、流体チャネルを作成する2つの金型、形状のないクリーンな金型が含まれています(図4と表1)。上記の4種類のモールドは、標準的なフォトリソグラフィープロセスを使用して製造されています。この金型製作は、以前に発表されたレポート18,19に従って、シリコンウェーハ上のSU-8金型で構成されています。図5は、デバイスチップを示しています。</li>
</ol>2. 粒子濃縮用マイクロ流体プラットフォームの作製
注: 図6 は、粒子を濃縮するマイクロ流体プラットフォームの作製を示しています。
<ol><li>バルブを空気圧制御するために準備された空気圧バルブチャネルSU-8金型(ステップ1.3)を使用してPDMS層を複製します。<ol>
<li>10mLの液体PDMSおよび1mLの硬化剤( 材料表を参照)を調製した空気圧バルブチャネルモールドに注ぎ(ステップ1.3)、90°Cで30分間熱活性化する。</li>
		<li>PDMS構造が硬化したら、ステップ2.1.1のSU-8金型を分離します。</li>
		<li>1.5 mm の穿刺を使用して、ステップ 2.1.2 に従って製造された空気圧バルブ チャネルに 3 つの 1.5 mm 空気圧ポート (Vs、Vf、および Vp) を打ち抜きます ( 材料表を参照)。</li>
		<li>ステップ1.3で調製したクリーンなSU-8モールドに液体PDMS10mLおよび硬化剤1mLを注ぎ、スピンコーターを用いて1,500rpmで15秒間スピンコートする( 材料表を参照)。その後、90°Cで30分間加熱活性化する。</li>
		<li>PDMS構造が硬化したら、ステップ2.1.4のSU-8金型を分離します。 メモ:バルブダイヤフラム層は、空気圧に応じて流体の流れを制御します。</li>
		<li>大気プラズマ( 材料表を参照)を、ステップ2.1.3および2.1.5で準備したPDMS構造に20秒間処理する。</li>
		<li>ステップ2.1.6からプラズマ処理したPDMS構造を、顕微鏡で確認して流路構造に合わせて直接整列させます。</li>
		<li>ステップ2.1.7で調製した整列PDMS構造体を90°Cで30分間加熱して結合させる。</li>
		<li>1.5 mmの穿刺を使用して、薄いダイヤフラム層が接着されている空気圧チャネル部分内の流体チャネル入口(Qfp)および流体チャネル出口(QfおよびQp)に直径1.5mmの穴を開けます。</li>
	</ol></li>
	<li>2つのSU-8金型を使用してPDMS層の両面を複製し、マイクロ流体チャネルを作成します。前面に湾曲した長方形のマイクロ流体チャネルモールドを使用し、背面にマイクロ流体相互接続チャネルモールドを使用します。<ol>
<li>10 mL の液体 PDMS と 1 mL の硬化剤を湾曲した長方形のマイクロ流体流路モールドに注ぎ、1,200 rpm で 15 秒間スピンコートします。次に、90°Cで30分間熱活性化することにより、湾曲した流体チャンバおよび流体チャネル用の金型を作成します(図6A)。</li>
		<li>マイクロ流体流路が形成されたPDMS層を分離し、大気プラズマを20秒間処理してガラスウェハに貼り合わせて密閉された通気壁を覆う熱活性化型を作る(図6B)。</li>
		<li>3 mL の液体 PDMS を SU-8 金型の相互接続チャネルに注ぎます (図 6C)。</li>
		<li>ステップ2.2.2で作製した構造体を液状PDMSで配線流路金型でマイクロ流体相互接続流路金型上に配置して、重ね合わせた構造体を130°Cで30分間乾燥させます(図6D)。 注:背面構造を硬化させている間、ステップ2.2.2で作製したPDMSモールドは空気層の熱圧によって膨張し、変形したPDMS層は熱的に活性化される(図6E)16。</li>
		<li>硬化後、マイクロ流体チャネル網層から前面SU-8金型を取り外し、背面PDMS金型を慎重に剥離します(図6F)。 注:3D流体ネットワーク層は、前方湾曲した流体チャンバおよびマイクロ流体チャネルの作成を可能にする。</li>
		<li>10 mL の液体 PDMS と 1 mL の硬化剤を清潔な SU-8 金型に注ぎます。その後、90°Cで30分間加熱活性化する。</li>
		<li>PDMS構造が硬化したら、SU-8金型を分離します。 メモ: この手順では、追加のシーリング層を作成します。</li>
		<li>ステップ2.2.3および2.2.7で準備したPDMS構造に大気プラズマを20秒間処理する。</li>
		<li>プラズマ処理したPDMS構造をチャンネル構造に合わせて直接整列させ、顕微鏡で確認します。</li>
		<li>整列したPDMS構造体を90°Cで30分間加熱して結合させる。</li>
	</ol></li>
	<li>ステップ2.1、2.2で作成したPDMS構造をチャネル構造に合わせて整列させ、大気プラズマを20秒間処理して接合します。</li>
</ol>3. デバイスのセットアップ
注: 図7は 、粒子を濃縮するマイクロ流体プラットフォームの作製を示しています。
<ol><li>マイクロ流体流路に、10mLシリンジを使用して気泡のない脱塩水を手動で充填する。</li>
	<li>マイクロビードの流れを制御するP_Qfpと3つの空気圧バルブ(P_Vs、P_Vf、およびP_Vp)を制御するには、作動流体(Qfp)用の4つ以上の出力チャネル( 材料表を参照)を備えた精密圧力コントローラをマイクロ流体プラットフォームに挿入します。 メモ:4つの出力チャンネルを備えた精密圧力コントローラは、複数の高精度圧力コントローラと交換できます。本実験では、P_Qfpの運転圧力は10kPa、P_Vsは15kPa、P_Vf及びP_Vpは共に18kPaであった(図8 及び 表2)。 図8 は、15kPaのP_Vsを有するマイクロ流体プラットフォームによって粒子が濃縮されるときの経時的な作動流体流量を示し、 表2 は空気圧バルブによる作動結果を示す。</li>
	<li>蒸留水中で様々なサイズのカルボキシルポリスチレン試験粒子を調製する( 材料表参照)。 注:この実験で使用された粒子サイズは、24.9、8.49、および4.16μmであった。P_Vsの圧力に応じて様々なサイズの粒子を使用することができる。</li>
	<li>作動流体の流量を制御するには、ガラス瓶に水(作動流体)を半分充填し、ガラス瓶キャップをコントローラ出力チャネルとマイクロバルブに接続します。 メモ: 一方のチューブをマイクロバルブに接続してコントローラから圧縮空気を受け取り、もう一方のチューブを接続して水を注入します。</li>
	<li>すべてのプラットフォーム操作について倒立顕微鏡でプラットフォームの動作を観察し、液体流量計で出口での経時的な動作流量を測定します( 材料表を参照)。</li>
</ol>4. 装置の動作
<ol><li>粒子/流体混合物をVpで注入口(Qfp)に圧力下で注入します(図9A)。 メモ:相互接続されたチャネルを通る出口からの粒子および清浄な流体の流れは、それぞれVpおよびVf を介して 制御される(表2)。</li>
	<li>Vs に 15 kPa で、Vp に 18 kPa で圧力を加えてバルブを作動させます。 注:このとき、ダイヤフラムが変形し、流体Qfpの粒子が湾曲流体チャネルと湾曲流体カンチレバーとの間の接触空間で遮断され、不要なQfp流体が開放Qfを介して放出される(図9B、C)。</li>
	<li>粒子が濃縮されたら、Vfにのみ圧力をかけます。 注:この時点で、Vfにのみ圧力が加えられると、詰まった粒子はQpを介して放出されます(図9D)。</li>
</ol>

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<li>Yoon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clogging-free+microfluidics+for+continuous+size-based+separation+of+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Clogging-free microfluidics for continuous size-based separation of microparticles.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-18 (2016).</li>
<li>Beattie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clog-free+cell+filtration+using+resettable+cell+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Clog-free cell filtration using resettable cell traps.</a> Lab on a Chip. 14 (15), 2657-2665 (2014).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bubble-+and+clogging-free+microfluidic+particle+separation+platform+with+multi-filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A bubble- and clogging-free microfluidic particle separation platform with multi-filtration.</a> Lab on a Chip. 16 (23), 4517-4526 (2016).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

このプラットフォームは、さまざまなサイズの粒子を精製および濃縮する簡単な方法を提供します。空気圧バルブ制御により粒子が蓄積・放出され、パッシブ構造がないため目詰まりは観察されません。この装置を用いて、3つのサイズの粒子の濃度が提示される。しかしながら、動作圧力、濃縮に要する時間、および速度は、装置寸法、粒径倍率、およびVs18、20、21における圧力に応じて変化し得る。
ステップ3.1を実行すると、気泡がチャネルの曲面に残ることがあります。気泡が残ると流路内の環境が変化するため、操作前に顕微鏡で流路を非常に注意深く確認する必要があります。
以前の研究と比較して、このプラットフォームにはいくつかの長所と短所があります。誘電泳動法では、より少ない標的粒子が使用される22。粒子と外力との間の物理的相互...

生物学的分析の重要性のために、マイクロ流体および生物医学的マイクロエレクトロメカニカルシステム(BioMEMS)技術1,2は、マイクロマテリアル2,3,4の精製および収集のための装置の開発および研究に使用される。パーティクル キャプチャは、アクティブまたはパッシブに分類されます。アクティブトラップは、独立した粒子に作用する外部誘電体5、磁束6、聴覚7、視覚8、または熱9の力に使用され、それらの動きの正確な制御を可能にした。ただし、粒子と外力の間の相互作用が必要です。したがって、スループットは低くなります。マイクロ流体システムでは、外力がターゲット粒子に伝達されるため、流量を制御することは非常に重要です。
一般に、受動マイクロ流体デバイスは、マイクロチャネル10、11内にマイクロピラーを有する。粒子は流れる流体との相互作用によって濾過され、これらの装置は設計が容易で製造が安価である。しかし、それらはマイクロピラーの粒子詰まりを引き起こすので、粒子の目詰まりを防ぐためにより複雑な装置が開発されている12。複雑な構造を有するマイクロ流体デバイスは、一般に、限られた数の粒子13、14、15、16、17、18を管理するのに適している。
この記事では、上記のように欠点18を克服する大きな粒子濃度のための空気圧駆動マイクロ流体プラットフォームを製作および操作する方法を説明する。このプラットフォームは、湾曲したマイクロ流体チャネルに蓄積するふるいバルブ(Vs)プレートの薄いダイヤフラム層の変形および作動によって粒子をブロックし、濃縮することができる。粒子は湾曲したマイクロ流体チャネルに蓄積し、濃縮粒子は、2つのPDMSシールオン/オフバルブ18の作動を介して作動流体を排出することによって分離することができる。この方法は、限られた数の粒子を処理するか、または多数の小さな粒子を濃縮することを可能にする。流量の大きさや圧縮空気圧などの動作条件は、不要なセルの損傷を防ぎ、セルトラップ効率を高めることができます。

<table><tbody><tr><td>1.5 mmパンク</td><td>自己導入</td><td>自己導入</td><td>このパンクは、Miltex&reg;プランジャー付き生検パンチ(15110-15)製品。</td></tr><tr><td>4インチシリコンウェーハ/ SU-8金型</td><td>4science</td><td>29-03573-01</td><td>4インチ(100)Ptypeシリコンウェーハ/ SU-8金型</td></tr><tr><td>カルボキシルポリスチレン架橋粒子(24.9 &mu;m)</td><td>Spherotech</td><td>CPX-200-10</td><td>濃縮ビーズ試料1</td></tr><tr><td>流量計</td><td>センシリオン</td><td>SLI-1000</td><td>流量測定</td></tr><tr><td>ハイスピードカメラ</td><td>フォトロン</td><td>FASTCAM ミニ</td><td>濃度観察</td></tr><tr><td>ホットプレート</td> 液体硬化用<td>HI-1000</td>加熱プレート<td>1個として</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>KOVAX-SYRINGE 10mL/シリンジ</td><td>韓国ワクチン</td><td>22G-10ML</td><td>マイクロ流体チャネルに気泡のない脱塩水を入れます。</td></tr><tr><td>実験室用コノナ処理装置/大気圧プラズマ</td><td>電装</td><td>BD-20AC</td><td>チップボンディング/大気圧プラズマ</td></tr><tr><td>液体ポリジメチルシロキサン, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>チップ顕微鏡のコンポーネント</td></tr><tr><td></td><td>オリンパス</td><td>IX-81</td><td>濃度の観察</td></tr><tr><td>PEEKチューブ</td><td>SAINT-GOBAIN PPL CORP.</td><td>AAD04103</td><td>粒子を注入または収集する</td></tr><tr><td>ポリスチレン粒子(4.16 &mu;m)</td><td>Spherotech</td><td>PP-40-10</td><td>濃縮ビーズ試料3</td></tr><tr><td>ポリスチレン粒子(8.49 &mu;m)</td><td>Spherotech</td><td>PP-100-10</td><td>濃縮ビーズサンプル2</td></tr><tr><td>圧力コントローラーフルコン</td><td>AMED&</td><td>mu;flucon</td><td>スピン</td></tr><tr><td>コーター</td><td>iNexus</td><td>ACE-200</td><td>SU-8金型に液体PDMSを散布</td></tr></tbody></table>

微粒子濃度のための空気圧駆動マイクロ流体プラットフォーム

Pneumatically Driven Microfluidic Platform for Micro-Particle Concentration

本稿では、マイクロ流体プラットフォームを用いて粒子濃度を制御する空気圧バルブを製造・運用する方法を紹介する。このプラットフォームには、湾曲した流体チャネルと3つの空気圧バルブを備えた3次元(3D)ネットワークがあり、ポリジメチルシロキサン(PDMS)による二重複製を介してネットワーク、チャネル、および空間を作成します。このデバイスは、空気圧バルブによって制御される流体流量の過渡応答に基づいて、(1)サンプルローディング、(2)サンプルブロッキング、(3)サンプル濃度、および(4)サンプルリリースの順序で動作します。粒子は、ふるいバルブ(Vs)プレートの薄いダイヤフラム層変形によってブロックされ、湾曲したマイクロ流体チャネルに蓄積する。作動流体は、2つのオン/オフバルブの作動によって排出されます。操作の結果、様々な倍率のすべての粒子が首尾よく傍受され、噛み合わなくなった。この技術を適用する場合、動作圧力、濃縮に要する時間、および濃縮速度は、装置寸法および粒径倍率に応じて変化し得る。

図8 は、 表2で述べたように、4段階のプラットフォーム動作のための流体速度の流量を示す。第1段階は、ローディング状態(状態)である。プラットフォームには、すべてのバルブを開いた状態で流体が供給され、作動流体(Qf)と粒子(Qp)は、マイクロ流体チャネルネットワークが構造対称性を示すのとほぼ同じです。2段目(b状態)では、圧縮空気をVsに輸送して粒子をブロックし、Vsダイヤフラムが変形するにつれて流路が狭くなり、出口ポートで測定した流量が油圧抵抗によって低下した。QfとQpの流量はほぼ同じで、その差は2.67%未満でした。第3段階(c状態)では、圧縮空気を粒子濃縮のためにVsおよびVpに送達し、VsおよびVpを閉じ、Vfを開放した。測定されたQpはゼロに近く、Qfはb状態の約1.42倍であった。ほとんどの場合、両方の散逸チャネルが動作しているときに流量は2倍になりますが、プラットフォームはメイン流体チャネルとVsで異なるタイプの油圧抵抗を持つため、作動流体の総流量が減少します。最後に(d状態)、圧縮空気をVfのみに送出して濃縮粒子を回収し、Qf...

本プロトコルは、効率的な微粒子濃縮に使用できる空気圧マイクロ流体プラットフォームを記述している。

The present article introduces a method for fabricating and operating a pneumatic valve to control particle concentration using a microfluidic platform. ...

このプロトコルは、粒子の目詰まりや複雑な構造などの欠点を克服する多粒子濃度のための空気圧駆動マイクロ流体プラットフォーム上で製造および操作する当社の方法を説明しています。この方法により、無制限の数の粒子を処理し、多数の小さな粒子に集中し、不要な細胞損傷を防ぎ、エントロピー効率を高めることができます。生物学的分析の重要性のために、マイクロ流体および生物医学的マイクロエレクトロメカニカルシステム技術は、マイクロ材料の精製および収集のための装置を開発および研究するために使用される。まず、事前に準備された空気圧バルブチャンネルSU8金型を使用して、バルブを空気圧制御するためのPDMS層を複製します。10ミリリットルの液体PDMSと1ミリリットルの硬化剤を調製した空気圧バルブ流路型に注ぎ、摂氏90度で30分間熱活性化する。PDMS構造が硬化したら、SU8金型を分離します。1.5ミリメートルの穿刺を使用して、3つの1.5ミリメートルの空気圧ポートを空気圧バルブチャネルにパンチします。10ミリリットルの液体PDMSと1ミリリットルの硬化剤を清潔なSU8金型に注ぎます。スピンコーターを用いて毎分1500回転で15秒間スピンコートし、その後、摂氏90度で30分間熱活性化する。PDMS構造が硬化した後、SU8金型を分離します。PDMS構造物を大気プラズマで20秒間処理する。顕微鏡を用いて、プラズマ処理したPDMS構造体をチャネル構造に従って位置合わせする。整列したPDMS構造を90°Cで30分間加熱して接着する。1.5ミリメートルの穿刺を使用して、薄いダイヤフラム層に接着された空気圧チャネル部分内の流体チャネル入口および出口に直径1.5ミリメートルの穴を開ける。2つのSU8金型を使用してPDMS層の両側を複製し、マイクロ流体チャネルを作成します。前面に湾曲した長方形のマイクロ流体チャネルモールドを使用し、背面にマイクロ流体相互接続チャネルモールドを使用します。10ミリリットルの液体PDMSと1ミリリットルの硬化剤を湾曲した長方形のマイクロ流体流路型に注ぎ、毎分1200回転で15秒間スピンコートした後、摂氏90度で30分間熱活性化することにより、湾曲した流体チャンバと流体チャネル用の型を作成します。マイクロ流体チャネルが形成されるPDMS層を分離する。その後、大気プラズマで20秒間処理し、ガラスウェハに貼り合わせて密閉された通気壁を覆う熱活性化型を作ります。3ミリリットルの液体PDMSをSU8金型の相互接続チャネルに注ぎます。相互接続流路金型で作製した構造体を、マイクロ流体相互接続流路金型上に液体PDMSで配置する。その後、重ね合わせた構造体を摂氏130度で30分間乾燥させた。硬化後、マイクロ流体チャネル網層から前面SU8金型を取り外し、背面PDMS金型を慎重に剥離します。10ミリリットルの液体PDMSと1ミリリットルの硬化剤をきれいなSU8金型に注ぎ、摂氏90度で30分間加熱活性化します。PDMS構造が硬化した後、SU8金型を分離します。PDMSマイクロ流体相互接続チャネルモールドを大気プラズマで20秒間処理します。顕微鏡を用いて、チャネル構造に従ってプラズマ処理したPDMS構造を位置合わせする。整列したPDMS構造を90°Cで30分間加熱して接着する。このプロセス中に作製したPDMS構造をチャネル構造に従って整列させ、大気プラズマで20秒間処理して接合する。10ミリリットルのシリンジを使用して、マイクロ流体チャネルを気泡のない脱塩水で満たします。作動流体の圧力とマイクロビーズの流れを制御する3つの空気圧バルブを制御するには、作動流体用の4つ以上の出口チャネルを備えた精密圧力コントローラをマイクロ流体プラットフォームに挿入します。蒸留水中で様々なサイズのカルボキシルポリスチレン試験粒子を調製する。作動流体の流量を制御するには、ガラス瓶の半分に水を満たし、ガラス瓶キャップをコントローラ出力チャネルとマイクロバルブに接続します。倒立顕微鏡を使用して、すべてのプラットフォームの動作を観察し、液体流量計によって出口での経時的な動作流量を測定します。粒子または流体混合物を、粒子バルブを備えた入口で圧力下で注入する。CIVバルブに15キロパスカルで圧力をかけ、パーティクルバルブに18キロパスカルで圧力を加えてバルブを作動させます。粒子が濃縮されたら、流体バルブにのみ圧力をかけます。流体の流量を4段階のプラットホーム操作に分割した。第1段階は装填状態であった。作動流体および粒子は、マイクロ流体チャネルネットワークが構造対称性を示したのとほぼ同じであった。第2段階はブロッキング状態であった。流路が狭くなり、出口ポートで測定された流量は油圧抵抗によって減少した。第3段階は濃縮状態であった。測定されたQPはゼロに近く、QFはブロッキング状態の約1.42倍であった。最終段階はリリース状態でした。結果として得られた流量と集中速度は、空気圧バルブでプログラムされたシーケンシャル作動が流量変化のためにうまく機能することを証明しました。CIVバルブおよびパーティクルバルブを閉じたときに粒子を濃縮して収集領域に蓄積し、流体バルブのみを閉じたときに4秒以内に収集された濃縮粒子をすべて放出した。この手順の重要な部分は、PDMS層が空気層のもう少しの圧力によって移植される背面構造を硬化させることである。そして、変形した膜層が突然活性化される。このプラットフォームは、操作が物理的粒子の特性の影響を受けないため、非常に濃縮された直鎖および懸濁した生体粒子の自動前処理に使用することができる。

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微粒子濃度のための空気圧駆動マイクロ流体プラットフォーム

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