共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録
2021年12月1日
プロトコルは、切断された神経を通してマウス運動神経終末に蛍光カルシウム色素をロードする方法を説明しています。さらに、共焦点顕微鏡を使用して末梢神経終末の高速カルシウム過渡現象を記録するためのユニークな方法が提示されます。
シナプス前カルシウムレベルの推定は、シナプス伝達を研究する上で重要なタスクです。カルシウムシグナル伝達の研究は、神経変性疾患の治療方法を見つけるためにも重要です。提示されたローディング技術の主な利点は、染色が目的の細胞に対してのみ行われたことである。
カルシウムの非過渡性を記録する方法は、非常に優れた時空間分解能を提供します。提示された登録方法は、共焦点顕微鏡を使用して高速周期プロセスを登録する必要がある神経生理学者にとって有用であり得る。ローディング技術で最も難しいステップは、ピペット内に神経を保持することです。
ピペットの直径は完全にフィットしていなければならないので、いくつかのものを作ります。プロトコルのすべてのステップを知ることは複雑であり、それらのそれぞれを示すことは大いに役立ちます。エラストマーでコーティングされたペトリ皿に細いステンレス鋼のピンでわずかに伸ばして長挙筋組織を固定することから始め、筋肉が完全に覆われるまでリンゲル溶液を皿に追加します。
次に、マイクロピペットプーラーを使用して、細胞内記録用の微細な鋭利な先端を持つマイクロピペットを準備します。内部フィラメントのない毛細血管を使用してください。テーパーを研磨剤で刻んだ後、マイクロピペットチップを切り離し、チップを直径約100マイクロメートルまで開いたままにします。
次に、内径が80マイクロメートルから12マイクロメートルに縮小するまでチップをファイアポリッシュします。完了したら、シリコンチューブを片側に取り付け、針のないシリンジを充填ピペットの反対側に取り付けます。実体顕微鏡で、神経幹が別々の神経枝に変わる場所を見つけます。
ワックスを使用して充填ピペットをペトリ皿に置き、ピペットチップを神経の上になるまで動かします。細かいハサミで筋線維に近い神経を切り、長さ約1ミリメートルの神経断端の小片を残します。次に、神経をつまむことなく、リンゲル溶液で神経断端を充填ピペットの先端に吸引します。
完了したら、充填ピペットからシリコンチューブを取り外します。その後、長いフィラメントを備えたシリンジを使用して、色素装填溶液を描画します。次に、ローディング溶液を含むフィラメントチップを充填ピペットに挿入し、混合物を神経断端に放出し、続いて神経製剤を室温で暗所で30分間インキュベートします。
インキュベーション後、神経製剤を新鮮なリンゲル溶液ですすぎ、ガラスビーカー中の50ミリリットルのリンゲル溶液で摂氏25度で2時間処理します。共焦点顕微鏡では、神経製剤をシリコンエラストマーコーティングされた実験チャンバーに取り付け、わずかに伸ばしてスチール製のマイクロニードルのセットで固定します。次に、リンゲル溶液で製剤を広範囲にすすぎます。
チャンバーに吸引電極を取り付けます。準備チャンバーを顕微鏡ステージに取り付けた後、入口と出口の継手をチャンバーに配置します。重力流駆動システムの電源を入れて、調製物から余分な溶液を取り除きます。
完了したら、刺激吸引電極を電気刺激装置に接続し、刺激後に筋肉の収縮が発生することを確認します。次に、灌流システムに10マイクロモルのd-ツボクラリンを含むリンゲル溶液を満たし、灌流吸引ポンプをオンにして灌流を開始します。レーザー走査型共焦点顕微鏡またはLSCMソフトウェアで、電気生理学および取得モードを選択してイメージングパラメータを設定します。
ジョブメニュー設定で、顕微鏡同期パルスで刺激装置をトリガーするトリガー設定を選択し、トリガーアウトオンフレームフィールドをOUT1チャンネルに設定します。スキャンモードを1, 400ヘルツのスキャン周波数でXYTに切り替えます。ズーム係数は、ピンホールが完全に開いた状態で6.1である必要があります。
シーケンシャル、トランスパス、双方向 X モードがオンになっていることを確認してから、フレームを形成するための最小時間を 52 ミリ秒に設定し、生のビデオのフレームを 20 フレームで収集します。アルゴンレーザーの励起波長を488ナノメートルに設定し、出力電力を8%に設定します。パラメータが設定されたら、ライブモードボタンを押して、色素がロードされた神経終末のライブプレビューを取得します。
ライブモードでは、関心領域またはROIを検索して、最適なフォーカスを取得します。次に、刺激装置の遅延を前の値に対して2ミリ秒少なくシフトし、データ収集ソフトウェアを実行して、各シーケンスを前のシーケンスから2ミリ秒シフトして26シーケンスを取得します。キャプチャしたビデオを処理するには、Leica Application Suite XまたはLAS Xソフトウェアを実行し、作成したプロジェクトを開きます。
次に、[エクスポート]をクリックして名前を付けて保存し、フレームをTIF形式で宛先フォルダーに保存します。次に、ImageJソフトウェアを実行し、ファイル、インポート、および画像シーケンスをクリックします。開いている画像シーケンスウィンドウで、宛先フォルダーを選択し、最初のフレームを開きます。
シーケンスオプションから、開始画像フィールドに移動し、最初のフレームのフレーム番号を1に設定します。次に、インクリメントフィールドで、OKをクリックする前に、最初の信号記録のフレーム数と同じ値を設定します。ステッチされた最初のフレームの生成されたファイルを別のフォルダーに保存するには、ファイル、保存、およびフォルダータブを順番にクリックします。
開始画像フィールドに対応するフレーム番号を設定して、19フレームの手順を繰り返します。すべての画像が取得されたら、ファイル、インポート、および画像シーケンスをクリックして、開始画像フィールドと増分フィールドで1つを選択します。すべてのフレームが時間分解能を上げてつなぎ合わされた最終的なビデオを見ることができます。
次に、ビデオファイルをTIF形式で保存します。ステッチされたビデオを分析するには、画像、スタック、ツール、スタックソーターをクリックします。次に、分析、ツール、ROIマネージャーに移動します。
以前に保存したTIFファイルをImageJウィンドウにドラッグアンドドロップし、画像を展開して見やすくします。画像の視覚化を改善するには、画像をクリックして調整し、明るさのコントラストを自動に切り替えます。ROIを描画し、ROIマネージャーに付加価値を与えることで、背景を神経終末の近くに設定します。
次に、詳細とマルチメジャーをクリックして背景を計算します。平均値をコピーしてスプレッドシート プログラムに貼り付けます。次に、平均値を計算します。
次に、計算された平均値をスタックから減算し、処理、メイン、および減算をクリックします。取得した値を入力し、神経終末の周囲に多角形の線でROIを描画してから、ROIマネージャーに追加します。神経終末の過渡強度を測定するには、詳細タブとマルチ測定タブをクリックします。
次に、平均強度値をコピーしてスプレッドシートプログラムに貼り付け、信号の平均オフセットを計算します。信号値を平均オフセット値で割ります。得られた値から1を引き、次に100%を掛け、続いてカルシウム過渡グラフをプロットして振幅を決定します。
神経調製物に染料を装填した後、シナプスの大部分は神経断端の近くに位置し、十分なレベルの蛍光を示した。画像処理後、所望の空間的および時間的分解能を有するカルシウム過渡性が得られた。このプロトコルの最も重要なステップの1つは、神経を切断した後の最初の数分で、神経断端を色素含有溶液に入れる必要があることです。
この方法は、さまざまな染料や薬物を運動ニューロンにロードするために使用できます。登録のプロトコルは、CNS製剤中の樹状突起および棘中のカルシウムを評価するのに有用であり得る。私たちの技術は、優れた空間的および時間的分解能でカルシウムシグナルを登録することを可能にします。
カルシウム過渡現象の研究は、神経伝達物質の放出とシナプス可塑性の調節を研究する上で強力なツールです。
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概要
本記事では、マウスの運動神経終末に蛍光カルシウム染料を導入する方法と、共焦点顕微鏡を用いて末梢神経終末における高速なカルシウム・トランジェントを記録する独自の手法について解説します。本研究は、シナプス伝達の理解を深めるためにシナプス前カルシウムレベルを推定することに焦点を当てており、これは神経変性疾患の治療法を開発する上で極めて重要です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経生理学
- カルシウムシグナリング
- シナプス伝達
背景
- シナプス伝達の研究において、シナプス前カルシウム濃度を推定する必要性。
- 神経変性疾患の治療におけるカルシウムシグナリングの役割。
- マウス運動神経終末から精密な細胞内記録を行う際の課題。
研究目的
- 神経終末におけるカルシウム染料の効率的な細胞内導入法を示す。
- 高い時空間分解能でカルシウム・トランジェントを記録する手法を提示する。
使用された手法
- イメージングデータの記録には、主に共焦点顕微鏡を使用します。
- 生物学的モデルとして、マウスの運動神経終末に焦点を当てています。
- 精密な作製および神経周囲での操作を伴うマイクロピペット技術が重要なステップとなります。
- 神経標本の作製には、リンゲル液の投与やインキュベーションを含む、特定の取り扱い手順が含まれます。
主要な結果
- このローディング手法により、目的の細胞のみを効果的に染色することが可能になります。
- 神経終末からのカルシウム過渡現象の記録において、高い時空間解像度が達成されました。
- 本手法は、神経生理学に関連する高速な周期的プロセスの記録における有用性を示しています。
結論
- 本研究は、シナプス前カルシウム動態を理解するための有用なプロトコルを提示しています。
- これらの知見はニューロンのメカニズムに影響を及ぼし、シナプス伝達プロセスに新たな洞察を提供します。
よくある質問
業界における重要性
神経筋接合部におけるシナプス前カルシウム・トランジェントの高解像度記録は、シナプス伝達メカニズムの精密な解析を可能にし、神経生物学における初期段階のターゲットバリデーションを支援します。この機能により、パスウェイ解析における予測の信頼性が向上し、神経変性疾患研究ポートフォリオにおけるリスク調整後の意思決定に有用な情報が提供されます。本手法の時空間的な忠実度は、メカニズム解明によるリスク低減およびトランスレーショナルな継続性を実現するための再利用可能な資産として位置付けられます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 神経伝達標的の検証に不可欠な、シナプス前カルシウムダイナミクスの定量的な評価を可能にします。
- カルシウム依存性シナプスイベントの時間的順序を明確にすることで、メカニズム的なリスク低減をサポートします。
- 刺激誘発性カルシウム流入を直接測定することにより、機能的な標的検証を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 特定のニューロン集団におけるカルシウム過渡現象の高解像度イメージングのための、検証済みシステムを提供します。
- カルシウム応答の再現性のある定量化を可能にし、アッセイの標準化および後続のスクリーニングワークフローをサポートします。
- 薬理学的または遺伝的な摂動の比較解析に適した定量的な出力を提供します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 神経変性に関与するシナプス可塑性のメカニズムの評価を可能にすることで、疾患関連モデルとの整合性を図ります。
- 機能的なシナプスのエンドポイントを直接測定することで、トランスレーショナルなバイオマーカーの開発を支援します。
- 堅牢で定量的なリードアウトを提供することにより、創薬研究から前臨床検証への継続性を促進します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この共焦点顕微鏡ベースのカルシウムイメージング法は、発見から前臨床に至る連続的なプロセスに統合され、神経生物学におけるメカニズム研究とトランスレーショナルリサーチを橋渡しします。
- 探索生物学：シナプス前カルシウム調節および神経伝達物質放出メカニズムに関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：化合物または遺伝的スクリーニングに向けて、アッセイ可能な再現性のあるカルシウム一過性変化のイメージングを提供します。
- 解析：堅牢な統計的比較のために、振幅、キネティクス、およびベースラインカルシウムレベルの定量的な抽出を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：メカニズム的な知見を、疾患に関連するシナプス機能不全モデルへと結びつけます。
- エンタープライズ再利用：さまざまなニューロン調製法や実験的な疑問に適応可能な標準化されたワークフローを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： シナプス標的のバリデーションおよびメカニズム研究における予測信頼性を向上させる。
- 運用的価値： チーム間で導入可能な、標準化され再現性のある、拡張可能なイメージングワークフローを提供する。
- 戦略的価値： 神経変性疾患ポートフォリオにおけるgo/no-go判断の質を向上させ、後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響： 推進すべきシナプス標的およびパスウェイのリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 共焦点顕微鏡法および精密な神経操作技術に関する専門知識が必要です。
- 高速イメージングプラットフォームおよび高度な画像解析ソフトウェアへのアクセスが求められます。
- 染料のローディングおよびイメージングパラメータについて、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- 組織および染料の適合性に合わせたプロトコルの最適化を行うことで、他の神経系にも適応可能です。
- 神経の生存維持と、染料塗布およびイメージングにおける正確なタイミングの管理に依存します。
