Name: 共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶマウス運動神経終末におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能記録法。共焦点顕微鏡を用いてシナプス前カルシウム動態を解析し、神経変性疾患治療への新たな知見を提供する神経生理学的手法です。

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この研究の蛍光研究は、ロシア科学財団助成金(プロジェクト番号19-15-00329)の財政的支援を受けて実施されました。この方法は、RAS АААА-А18-118022790083-9のFRCカザン科学センターの政府割り当てからの資金提供を受けて開発されました。研究は、連邦研究センター「RASのカザン科学センター」の機器を使用して開発されました。著者は、この原稿を批判的に読んでくれたVictor I. Ilyin博士に感謝したいと思います。

著者は開示するものは何もありません。

本稿では、Ca2+感受性色素を神経断端を介してマウスの神経終末に装填する方法、および共焦点顕微鏡を使用して高速カルシウム過渡現象を記録する方法について説明します。この負荷法の実施の結果として、神経断端の近くに位置するシナプスのほとんどは、運動神経の低周波刺激に応答して神経終末へのカルシウムの侵入の登録を可能にするのに十分なレベルの蛍光を有していた。
切り株を通してカルシウム色素をロードするための以前に提示されたプロトコルとは異なり、このプロトコルは哺乳類シナプスで使用するように設計されています。冷血動物調製物で使用されていた以前のプロトコルでは、一晩のインキュベーションが必要でした43。このプロトコルでは、染料との必要なインキュベーションはわずか2時間です。切断後に残った神経セグメントの長さに応じて、染料の装填速度、および装填された末端の数は変わり得る。より短い神経断端のための色素溶液でさらにインキュベーション時間を短縮することができた。同様の方法が、ハエシナプス18,19</...

興奮性細胞における高速カルシウム波を測定する問題は、中枢神経系および末梢神経系におけるシグナル伝達を研究する上で最も重要かつ困難な側面の1つです。カルシウムイオンは、神経伝達物質の放出、シナプス可塑性、およびさまざまな細胞内タンパク質の活性の調節を引き起こすのに重要な役割を果たします1,2,3,4,5。カルシウムシグナル伝達の研究は、神経変性疾患の治療方法を見つけるためにも重要です6。カルシウムレベルの変化を測定するために、蛍光カルシウム感受性色素が一般的に使用され、それらの蛍光レベルの変化が分析されます7、8、9。
カルシウム色素の細胞への装填は、さまざまな方法で達成できます。主に、細胞透過性染料が使用される10,11。しかし、このような場合、細胞内の色素の濃度を制御することが難しいだけでなく、ロードする標的細胞を選択することも困難である。この方法は、色素がシナプス後細胞に入るため、末梢神経終末の研究には適用できません。代わりに、細胞不透過性染料がそのような調製物により適している。この場合、色素は、マイクロインジェクションによって、またはパッチピペット12、13、14を介して細胞に送達される。神経断端を通して負荷をかける方法もあります。後者の方法は、神経筋接合部調製物15、16、17、18、19、20に最も適している。目的の細胞に対してのみ染色を行うことができます。この方法では、標的細胞中の色素の濃度を正確に評価することはできませんが、濃度は、溶液中の安静細胞の蛍光レベルを既知の濃度のカルシウム21と比較することによっておおよそ推定できます。本研究では、哺乳類のシナプスに適用されるこの方法の修正を提示する。
活動電位の脱分極期におけるカルシウムの侵入は、特に神経筋接合部において速いプロセスである。したがって、その登録には、適切な機器が必要です1。電位感受性蛍光色素を用いた最近の研究では、マウスの末梢シナプスにおける活動電位の持続時間は約300μsであることが実証された22。カエルの末梢シナプスでカルシウム感受性染料を使用して評価されたカルシウム過渡性は、より長い持続時間を有する:上昇時間は約2〜6ミリ秒であり、崩壊時間は約30〜90ミリ秒である23,24。蛍光色素を使用して高速プロセスを測定するには、CCDまたはCMOSカメラが一般的に使用され、高速で感度の高いCCDマトリックスが使用されます。しかしながら、これらのカメラは、マトリックス25、26、27、28の敏感な要素のサイズによって制限される低解像度の欠点を有する。細胞の低周波刺激に応答して活動電位とカルシウム過渡現象の両方を記録するのに十分な感度を有する最速のカメラは、2,000Hzのスキャン周波数を有し、80×80の寸法を有するマトリックスを有する29。より高い空間分解能を有する信号を得るために、特に信号30、31、32におけるいくらかの体積変化を評価する必要がある場合には、共焦点顕微鏡が使用される。しかし、共焦点顕微鏡はラインスキャンモードでは高いスキャン速度を有するが、空間画像33を構築する際の高速プロセスの記録速度には依然として大きな制限があることに留意すべきである。回転するニプコウディスクをベースにした共焦点顕微鏡(スリット走査顕微鏡)や、より高速なスキャン速度を持つマルチポイントアレイスキャナーがあります。同時に、それらは共焦点画像フィルタリング(ニポウディスクを備えた顕微鏡のピンホールクロストーク)において古典的な共焦点顕微鏡より劣っています32,34,35。共鳴スキャンによる共焦点画像化はまた、高時間測定に必要な高い時空間分解能を提供することができる36。しかしながら、共鳴スキャナを使用する場合、高速走査速度での弱い蛍光応答の登録には、ハイブリッド検出器36などの高感度検出器が必要であることを考慮する。
本稿では、空間分解能を維持しながら、レーザー走査型共焦点顕微鏡(LSCM)で記録された信号の時間分解能を高める方法を紹介します37。現在の方法は、前述の方法のさらなる発展であり、LSCMプラットフォーム38、39、40に転送される。このアプローチは、顕微鏡ハードウェアの変更を必要とせず、刺激の瞬間に対する時間シフトで周期的に誘発される蛍光シグナルを記録するためのアルゴリズムの適用に基づいています。

<table><tbody><tr><td>キャピラリーガラス</td><td>クラーク 電気医療機器、英国</td><td>GC150-10</td><td></td></tr><tr><td>共焦点および多光子顕微鏡システム ライカ TCS SP5 MP</td><td>ライカマイクロシステムズ 、ハイデルベルク、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー P 97</td><td>サッター機器、米国</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>フローレギュレータ</td><td>KD Medical GmbH Hospital Products、ドイツ</td><td>KD REG</td><td>フローレギュレーター付きディスポーザブル輸液セット</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H0887</td><td>100mL</td></tr><tr><td>照明システム Leica CLS 150X</td><td>Leica Microsystems, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Las AF software</td><td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Las X software</td><td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germany</td><td></td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td></tr> <tr><td>Magnetic Holder with Suction Tubing</td><td>BIOSCIENCE TOOLS, USA</td><td>MTH-S</td><td></td></tr><tr><td>Microspin FV 2400</td><td>Biosan, Latvia</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine science tools, Canada</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>マルチスピンMSC 3000</td><td>Biosan、ラトビア</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>オレゴングリーン 488 BAPTA-1 ペンタカリウム塩</td><td>分子プローブ、米国</td><td>O6806</td><td>500 &mu;g</td></tr><tr><td>ピペット</td><td>Biohit, Russia</td><td>720210</td><td>0.5-10 & マイクロ;L</td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>Biohit, Russia</td><td>781349</td><td>10 & micro;L</td></tr><tr><td>粘土</td><td>地元の生産者</td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨て皮下注射針</td><td>Bbraun</td><td>100 Sterican</td><td>0.4&times;40 mm</td></tr><tr><td>Spreadsheet program</td><td>Microsoft, USA</td><td>Microsoft Office Excel</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope, Leica M80</td><td>Leica Microsystems, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸引電極</td><td>Kazakov A. Simple Suction electrode for electric stimulation of biological objects / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal.&nbsp;- 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16.</td><td></td><td>http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/</td></tr> <tr><td>Sylgard 184エラストマー</td><td>ダウ・コーニング社 米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>現地産0.5</td><td></td><td>mL</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>60</td><td></td><td>mL</td></tr></tbody></table>

共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

シナプス前細胞へのカルシウムの侵入は神経伝達物質の放出につながる一連の事象を引き起こすため、シナプス前カルシウムレベルの推定はシナプス伝達を研究する上で重要な課題である。さらに、シナプス前カルシウムレベルの変化は、多くの細胞内タンパク質の活性を媒介し、シナプス可塑性において重要な役割を果たす。カルシウムシグナル伝達の研究は、神経変性疾患の治療方法を見つけるためにも重要です。神経筋接合部は、神経伝達物質の種類が1つしかないため、シナプス可塑性の研究に適したモデルです。この記事では、切断された神経束を通してマウスの運動神経終末にカルシウム感受性色素をロードする方法について説明します。この方法は、基礎カルシウムレベルおよびカルシウム一過性などの細胞内カルシウム変化に関連する全てのパラメータの推定を可能にする。細胞外から神経終末へのカルシウムの流入とカルシウム感受性色素への結合/脱離は数ミリ秒以内に起こるため、これらの事象を記録するには迅速なイメージングシステムが必要です。実際、高速カメラはカルシウムの速い変化の登録に一般的に使用されていますが、画像解像度パラメータは低くなっています。カルシウム過渡を記録するためにここに提示されたプロトコルは、共焦点顕微鏡によって提供される非常に優れた空間的-時間分解能を可能にします。

提示された技術に従って調製物に色素をロードした後、神経断端の近くに位置するシナプスのほとんどは十分なレベルの蛍光を有していた( 図2を参照)。色素をロード調製し、記載されたレジストレーションと画像処理の方法を適用した後、所望の空間的および時間的分解能を有するカルシウム過渡現象が得られました( 図4を参照)。カルシウム過渡現象は提案手法により回収した( 図3参照)。
回収された信号の振幅および時間パラメータも解析した。平均データを 表1に示す。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63308/63308fig04.jpg"> ...

プロトコルは、切断された神経を通してマウス運動神経終末に蛍光カルシウム色素をロードする方法を説明しています。さらに、共焦点顕微鏡を使用して末梢神経終末の高速カルシウム過渡現象を記録するためのユニークな方法が提示されます。

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

シナプス前カルシウムレベルの推定は、シナプス伝達を研究する上で重要なタスクです。カルシウムシグナル伝達の研究は、神経変性疾患の治療方法を見つけるためにも重要です。提示されたローディング技術の主な利点は、染色が目的の細胞に対してのみ行われたことである。カルシウムの非過渡性を記録する方法は、非常に優れた時空間分解能を提供します。提示された登録方法は、共焦点顕微鏡を使用して高速周期プロセスを登録する必要がある神経生理学者にとって有用であり得る。ローディング技術で最も難しいステップは、ピペット内に神経を保持することです。ピペットの直径は完全にフィットしていなければならないので、いくつかのものを作ります。プロトコルのすべてのステップを知ることは複雑であり、それらのそれぞれを示すことは大いに役立ちます。エラストマーでコーティングされたペトリ皿に細いステンレス鋼のピンでわずかに伸ばして長挙筋組織を固定することから始め、筋肉が完全に覆われるまでリンゲル溶液を皿に追加します。次に、マイクロピペットプーラーを使用して、細胞内記録用の微細な鋭利な先端を持つマイクロピペットを準備します。内部フィラメントのない毛細血管を使用してください。テーパーを研磨剤で刻んだ後、マイクロピペットチップを切り離し、チップを直径約100マイクロメートルまで開いたままにします。次に、内径が80マイクロメートルから12マイクロメートルに縮小するまでチップをファイアポリッシュします。完了したら、シリコンチューブを片側に取り付け、針のないシリンジを充填ピペットの反対側に取り付けます。実体顕微鏡で、神経幹が別々の神経枝に変わる場所を見つけます。ワックスを使用して充填ピペットをペトリ皿に置き、ピペットチップを神経の上になるまで動かします。細かいハサミで筋線維に近い神経を切り、長さ約1ミリメートルの神経断端の小片を残します。次に、神経をつまむことなく、リンゲル溶液で神経断端を充填ピペットの先端に吸引します。完了したら、充填ピペットからシリコンチューブを取り外します。その後、長いフィラメントを備えたシリンジを使用して、色素装填溶液を描画します。次に、ローディング溶液を含むフィラメントチップを充填ピペットに挿入し、混合物を神経断端に放出し、続いて神経製剤を室温で暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、神経製剤を新鮮なリンゲル溶液ですすぎ、ガラスビーカー中の50ミリリットルのリンゲル溶液で摂氏25度で2時間処理します。共焦点顕微鏡では、神経製剤をシリコンエラストマーコーティングされた実験チャンバーに取り付け、わずかに伸ばしてスチール製のマイクロニードルのセットで固定します。次に、リンゲル溶液で製剤を広範囲にすすぎます。チャンバーに吸引電極を取り付けます。準備チャンバーを顕微鏡ステージに取り付けた後、入口と出口の継手をチャンバーに配置します。重力流駆動システムの電源を入れて、調製物から余分な溶液を取り除きます。完了したら、刺激吸引電極を電気刺激装置に接続し、刺激後に筋肉の収縮が発生することを確認します。次に、灌流システムに10マイクロモルのd-ツボクラリンを含むリンゲル溶液を満たし、灌流吸引ポンプをオンにして灌流を開始します。レーザー走査型共焦点顕微鏡またはLSCMソフトウェアで、電気生理学および取得モードを選択してイメージングパラメータを設定します。ジョブメニュー設定で、顕微鏡同期パルスで刺激装置をトリガーするトリガー設定を選択し、トリガーアウトオンフレームフィールドをOUT1チャンネルに設定します。スキャンモードを1, 400ヘルツのスキャン周波数でXYTに切り替えます。ズーム係数は、ピンホールが完全に開いた状態で6.1である必要があります。シーケンシャル、トランスパス、双方向 X モードがオンになっていることを確認してから、フレームを形成するための最小時間を 52 ミリ秒に設定し、生のビデオのフレームを 20 フレームで収集します。アルゴンレーザーの励起波長を488ナノメートルに設定し、出力電力を8%に設定します。パラメータが設定されたら、ライブモードボタンを押して、色素がロードされた神経終末のライブプレビューを取得します。ライブモードでは、関心領域またはROIを検索して、最適なフォーカスを取得します。次に、刺激装置の遅延を前の値に対して2ミリ秒少なくシフトし、データ収集ソフトウェアを実行して、各シーケンスを前のシーケンスから2ミリ秒シフトして26シーケンスを取得します。キャプチャしたビデオを処理するには、Leica Application Suite XまたはLAS Xソフトウェアを実行し、作成したプロジェクトを開きます。次に、[エクスポート]をクリックして名前を付けて保存し、フレームをTIF形式で宛先フォルダーに保存します。次に、ImageJソフトウェアを実行し、ファイル、インポート、および画像シーケンスをクリックします。開いている画像シーケンスウィンドウで、宛先フォルダーを選択し、最初のフレームを開きます。シーケンスオプションから、開始画像フィールドに移動し、最初のフレームのフレーム番号を1に設定します。次に、インクリメントフィールドで、OKをクリックする前に、最初の信号記録のフレーム数と同じ値を設定します。ステッチされた最初のフレームの生成されたファイルを別のフォルダーに保存するには、ファイル、保存、およびフォルダータブを順番にクリックします。開始画像フィールドに対応するフレーム番号を設定して、19フレームの手順を繰り返します。すべての画像が取得されたら、ファイル、インポート、および画像シーケンスをクリックして、開始画像フィールドと増分フィールドで1つを選択します。すべてのフレームが時間分解能を上げてつなぎ合わされた最終的なビデオを見ることができます。次に、ビデオファイルをTIF形式で保存します。ステッチされたビデオを分析するには、画像、スタック、ツール、スタックソーターをクリックします。次に、分析、ツール、ROIマネージャーに移動します。以前に保存したTIFファイルをImageJウィンドウにドラッグアンドドロップし、画像を展開して見やすくします。画像の視覚化を改善するには、画像をクリックして調整し、明るさのコントラストを自動に切り替えます。ROIを描画し、ROIマネージャーに付加価値を与えることで、背景を神経終末の近くに設定します。次に、詳細とマルチメジャーをクリックして背景を計算します。平均値をコピーしてスプレッドシート プログラムに貼り付けます。次に、平均値を計算します。次に、計算された平均値をスタックから減算し、処理、メイン、および減算をクリックします。取得した値を入力し、神経終末の周囲に多角形の線でROIを描画してから、ROIマネージャーに追加します。神経終末の過渡強度を測定するには、詳細タブとマルチ測定タブをクリックします。次に、平均強度値をコピーしてスプレッドシートプログラムに貼り付け、信号の平均オフセットを計算します。信号値を平均オフセット値で割ります。得られた値から1を引き、次に100%を掛け、続いてカルシウム過渡グラフをプロットして振幅を決定します。神経調製物に染料を装填した後、シナプスの大部分は神経断端の近くに位置し、十分なレベルの蛍光を示した。画像処理後、所望の空間的および時間的分解能を有するカルシウム過渡性が得られた。このプロトコルの最も重要なステップの1つは、神経を切断した後の最初の数分で、神経断端を色素含有溶液に入れる必要があることです。この方法は、さまざまな染料や薬物を運動ニューロンにロードするために使用できます。登録のプロトコルは、CNS製剤中の樹状突起および棘中のカルシウムを評価するのに有用であり得る。私たちの技術は、優れた空間的および時間的分解能でカルシウムシグナルを登録することを可能にします。カルシウム過渡現象の研究は、神経伝達物質の放出とシナプス可塑性の調節を研究する上で強力なツールです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

出典: Heredia, D. J., et.al. マウスダイアフラムの三者シナプスにおける細胞特異的カルシウムシグナル伝達のex vivoイメージング. J. Vis. Exp. (2018)...

トランスジェニックマウスの横隔膜の神経筋接合部におけるカルシウム動態の蛍光イメージング

出典:Fried, D. E., Gulbransen, B. D.In Situ Ca2+ 腸神経系のイメージング J. Vis. Exp.

マウス大腸筋神経叢における腸内ニューロンとグリア活性のカルシウムイメージング

Source: バンクロフト、E. A., et al.自発的なCa style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'2+ &gt; Fluxes and their downstream effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (2020)...

マウス胚由来の腹側中脳ニューロンにおけるカルシウム流入の可視化

出典:Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina.J. Vis. Exp.

マウス網膜錐体光受容体におけるカルシウム動態モニタリングのための2光子顕微鏡法

出典: Zhilyakov, N. V. et al., 共焦点顕微鏡を使用した高時間分解能によるマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の登録。J. Vis.

共焦点顕微鏡を使用したマウス神経終末の高速カルシウム過渡現象のイメージング

現在、ほとんどの利用可能なカルシウム指標は、培養平滑筋細胞の筋小胞体から放出されるカルシウムの間接的な測定値として、細胞質のカルシウム過渡現象を定量化するために使用されています。このプロトコルは、筋小胞体内腔内のカルシウムシグナルの直接測定を可能にする特定のFRETベースのインジケーターの使用を説明しています。...

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

ここでは、カエルの神経切開部から神経終末にカルシウム感受性色素を充填する方法について説明します。末梢神経終末における速いカルシウム過渡状態の記録および分析のためのプロトコルも提示する。...

カエルの神経筋終末へのカルシウム色素の神経切片への積載：カエル神経筋接合部におけるカルシウムの一時的な位置合わせ

マウスの神経筋接合部で個々 のセル型の集団のイメージ...

Ex Vivoセル固有カルシウム マウス ダイヤフラムの三者のシナプスでシグナル伝達のイメージング

この方法は、光遺伝学と遺伝的にコード化されたカルシウムセンサーを画像ベースラインサイトソリックカルシウムレベルおよびモデル生物C.エレガンスの体壁筋肉における誘発カルシウム過渡の変化に組み合わせる方法を提供する。...

C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

このプロトコルは野生型マウスの皮質をそのまま残している間2光子の顕微鏡検査との単一ニューロンの活動をイメージ投射すること、および部分皮質の突然変異体のマウスの広視野顕微鏡検査が付いている全体のSCをイメージ投射することを含む目がさめているマウスの優秀なcolliculus (SC)のカルシウム応答を、イメージ投射するためのプロシージャを詳述する。...

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

学ぶマウス運動神経終末におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能記録法。共焦点顕微鏡を用いてシナプス前カルシウム動態を解析し、神経変性疾患治療への新たな知見を提供する神経生理学的手法です。

共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録

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