炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

白血球-内皮細胞相互作用は、敗血症などの炎症性疾患において重要な役割を果たす。炎症調節不全は、しばしば血管内皮バリア機能の変化および過剰な白血球輸送を引き起こし、臓器損傷をもたらし得る。bMFAと呼ばれる生体模倣マイクロ流体アッセイは、生体内微小血管ネットワークの地形および流動状態を再現し、好中球の組織区画への転がり、強固な接着、拡散、および移動のリアルタイム評価を可能にする。

バイオミメティックマイクロ流体アッセイの強みは、初代ヒト細胞および臨床的に関連する患者サンプルを使用して臨床翻訳を増やし、潜在的な治療法を迅速にスクリーニングできることです。手順を実演するのは、私の研究室の大学院研究助手であるQingliang Yang氏です。1つの入口ポートを除いて、細かい鉗子を使用してポート内に長さ約1インチのチューブを挿入し始めます。

ジョークランプを使用して、2つの出口ポートとティッシュコンパートメントを一緒にクランプします。フィブロネクチンストック溶液をPBSで1ミリリットルあたり100マイクログラムに希釈する。希釈したフィブロネクチン溶液で24ゲージの鈍い針に接続された1ミリリットルのシリンジをロードし、シリンジを4インチの長さのチューブに接続します。

チューブを開放入口ポートに挿入し、ヒトフィブロネクチンが別の入口ポートから放出されるまでプランジャーを押し込み、クランプします。すべてのチャネル、組織コンパートメント、およびチューブがヒトフィブロネクチン溶液で満たされるまで、残りのポートについてこのプロセスを繰り返します。針を外しますが、長さ 4 インチのチューブを挿入し、クランプを外したままにしておきます。

脱気を行うには、クランプされていないチューブを、圧縮窒素タンクに接続された空気圧プライマーに1平方インチあたり5ポンドの圧力で15分間接続します。顕微鏡下で、チャネルまたは組織コンパートメント内に気泡が閉じ込められていないことを確認し、気泡が存在する場合はデバイスを再接続します。空気圧プライマーから装置を取り出し、摂氏37度で1時間インキュベートする。

予め加温したヒト肺微小血管内皮細胞培養培地を用いて、全てのチャネルおよび組織区画をフラッシュする。本文原稿に記載されているように内皮細胞を採取した後、プログラム可能なシリンジポンプ G.In 150倍で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、1ミリリットルのシリンジを取り付け、チューブを鈍い針に取り付ける。約20マイクロリットルの細胞懸濁液をシリンジバレルに入れずにチューブに引き込みます。

デバイスのコンセントポートからクランプを取り外します。チューブを入口ポートに接続し、チャネルに気泡を導入せずに接続します。毎分4~8マイクロリットルの流量でポンプを停止し、顕微鏡下で観察する。

チャンネルがセルで満たされたらポンプを停止します。出口をクランプし、入口チューブを切断する。デバイスをインキュベーター内に5%の二酸化炭素と摂氏37度で4時間置きます。

4時間のインキュベーション後、別のシリンジを準備し、新鮮な細胞培養培地で満たします。シリンジをシリンジポンプに取り付け、入口ポートに接続します。出口ポートからクランプを取り外します。

新鮮な培地を毎分4〜8マイクロリットルで約5分間装置に通し、浮遊または未接続の細胞を除去する。新鮮な細胞培養培地を充填してシリンジを調製する。シリンジをシリンジポンプに取り付け、出口ポートを開いたまま1つの入口ポートに接続します。

デバイスを摂氏37度と二酸化炭素5%のインキュベーターに入れます。テキスト原稿に記載されているように、フロー下で内皮細胞を培養するためのシリンジポンプをプログラムする。顕微鏡を用いて、フロー下での培養の48時間後にbMFAを確認する。

共焦点顕微鏡は、血管チャネルのすべての表面が内皮細胞によって覆われ、bMFAにおいて完全な3D内腔を形成することを示した。3つの異なるbMFA装置を調製した後、3つの1ミリリットルシリンジに細胞培養培地またはPKCデルタ阻害剤と組み合わせたTNF−αまたはTNF−αをそれぞれロードし、TNF−αおよび炎症性サイトカインを使用して内皮細胞および好中球を刺激する。PKCデルタ阻害剤は、新規な抗炎症阻害剤である。

3 つの装填済みシリンジを 3 つの bMFA デバイスに接続します。緩衝液TNF−αまたはTNF−α阻害剤を添加して使用して、ヒト肺微小血管内皮細胞を毎分0.1マイクロリットルで4時間処置する。本文原稿に記載されているようにヒト好中球を単離した後、好中球を999マイクロリットルのHEPES緩衝液に再懸濁し、1マイクロリットルの10ミリモルCFDA SE色素ストック溶液を懸濁液に加え、CFDA SEの10マイクロモルの作用溶液を得て、室温で10分間インキュベートする。

細胞を計数した後、細胞培養培地またはPKCデルタ阻害剤を添加したTNF-αまたはTNF-αに1ミリリットルあたり200万個の好中球で再懸濁し、室温で15分間インキュベートすることにより、溶液を315倍G.Theseで5分間遠心分離して細胞をHEPES緩衝液で2回洗浄する。細胞培養培地中で調製した1マイクロモルの化学誘引剤fMLPでシリンジを充填する。bMFA の入口ポートと出口ポートを 1 つ開きます。

ポートチューブをティッシュコンパートメントから取り外し、fMLPチューブを挿入します。約20マイクロリットルのfMLPをすべてのbMFAの組織区画に注入し、細胞培養培地で処理したものを残す。チューブを切断し、クランプします。

シリンジに約200マイクロリットルの好中球懸濁液を充填し、シリンジをシリンジポンプに取り付けます。装置を倒立顕微鏡ステージ上に設置した後、流量を毎分1マイクロリットルに設定し、ポンプを始動する。好中球懸濁液の小さな滴がチューブから出てくるまで待ってから、チューブを入口ポートに挿入します。

蛍光標識された好中球は血管チャネルに流れ込み、内皮細胞および生理学的に関連する流れ条件と相互作用する。実験開始から10分後、画像解析ソフトを開き、対物レンズを10倍に切り替え、ステージジョイスティックで顕微鏡下にデバイスを中央に配置します。接着マップを取得するには、[取得] に移動し、[大きな画像のスキャン] をクリックします。

新しいウィンドウがポップアップ表示されます。「10x 対物レンズ」を選択し、フィールドオプションを設定します (例: 5 x 3)。[スキャン] をクリックし、[ファイル] をクリックして、接着マップを保存します。

移行解析用の移行マップを取得するには、ステージジョイスティックを使用してデバイスを顕微鏡の下に集中させます。「表示」、「集録制御」、「ND集録」の順にクリックします。新しいウィンドウがポップアップ表示されます。

ファイルを保存するパスを設定し、ファイル名を入力します。[大画像]機能を確認し、[スキャン領域]を5×3などに設定します。[時間] 機能を確認し、[間隔] を 5 分、[期間] を 60 分に設定します。

組織コンパートメントのタイムラプス画像を撮影し、次の1時間に5分ごとに1枚の画像を撮影します。CFDシミュレーションは、流れパターンが乱れる分岐領域を除いて、血管チャネルにおける層流パターンを示す。生体模倣マイクロ流体アッセイを実施した後、位相差画像は、血管チャネルの表面が内皮細胞で覆われ、培養48時間後に剪断流の方向に整列していることを明らかにした。

共焦点顕微鏡を用いて蛍光イメージングを行い、bMFAにおいて内皮細胞が完全な三次元内腔を形成することを示す好中球接着マップが得られ、bMFAにおいて内皮細胞への好中球の有意な接着があることが明らかとなった。bMFAにおける好中球遊走マップは、TNF−α活性化時に、好中球のかなりの遊走が組織区画内で起こることを明らかにしたが、TNF−α活性化なしにはそのような遊走は観察されなかった。好中球の空間分布と剪断速度を相関させる接着マップは、好中球接着が剪断速度が低く分岐領域付近の血管で優先的に起こることを実証した。

また、TNF−α処理は接着性を有意に増加させ、これはPKCデルタ阻害剤で阻害された。タイムラプス画像を分析すると、内皮細胞のTNF活性化はfMLPに応答して好中球遊走を増加させるが、PKCデルタ阻害剤による治療はTNF-α処理細胞と比較して遊走を減少させることが示された。したがって、bMFAは、炎症性疾患を治療するための新規治療の有効性を試験するために使用することができる。

bMFAは、透過性および内皮経管電気抵抗、TEERと呼ばれるもの、および炎症中の接着分子発現などの変数を測定することによって、内皮完全性を研究するためにも使用することができる。生体模倣マイクロ流体アッセイは、異なる器官の微小環境を模倣することができ、単一の細胞タイプまたは種に限定されず、器官機能および異なる疾患のモデリングに不可欠な細胞/細胞通信をモデル化することもできる。