Name: ヒトα-シヌクレインをコードするアデノ随伴ウイルスベクターにより誘導されるパーキンソン病マウスモデルの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: 学ぶパーキンソン病マウスモデルの構築法。ヒトα-シヌクレインをコードするアデノ随伴ウイルスベクターを黒質にステレオタクシック投与し、神経炎症、神経変性、運動障害を再現する方法を解説します。

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私たちは、セバスチャン・バレンズエラ博士とミカエラ・リッカ博士に、私たちの動物施設における貴重な獣医の援助に感謝します。この研究は、"Financiamiento Basal para Centros Científicos y Tecnológicos de Excelencia de ANID" Centro Ciencia & Vida, FB210008 (to Fundación Ciencia & Vida)、およびGeroscience Center for Brain Health and Metabolism, FONDAP-15150012の支援を受けた。この研究はまた、"Agencia Nacional de Investigación y Desarrollo de Chile (ANID)"からのFONDECYT-1210013(R.P.へ)とFONDECYT-1150766(FCへ)と、マイケル・J・フォックス・パーキンソン病研究財団からのMJFF-10332.01(R.P.へ)とMJFF-17303(FCへ)の助成金によっても資金提供されました。

著者らは、この研究は、金銭的または非財務的な競合する利益が存在しない状態で実施されたと宣言している。

ここで解析した神経変性のマウスモデルは、αSyn病態およびミクログリア活性化に関与するメカニズム、神経炎症の調節における末梢免疫系の関与、および神経変性のメカニズムを含む、パーキンソン病の病態生理学に関与する多くの重要な側面を研究するのに役立つ可能性がある。αSyn病態に関与する機序の中には、SN2のドーパミン作動性ニューロンにおけるαSynの過剰な負荷の存在下でのミトコンドリア、リソソーム、またはプロテアソーム機能不全に関連する細胞内機序がある。AAV媒介性形質導入によって誘導されるhαSyn発現に加えて、内因性マウスαSynも総αSyn発現の負荷に寄与することを考慮することが重要です。αSynを過剰発現するトランスジェニックマウスは、hαSyn32の過剰発現に基づくこれらのマウスモデルと同様のシヌクレイン病理、神経病理学、および運動障害を発症する。ミクログリア活性化に関して、本マウスモデルは、サイトカイン、神経伝達物質、アストロサイト、ニューロン、血液脳関門、およびT細胞などの異なる分子および細胞プレーヤーが、炎症促進性または抗炎症性機能表現型の獲得をどのように調節するかを研究するために用いられる可能性がある8,10,111。.このモデルはまた、T細胞だけでなく、マクロファージ、単球、および好中球を含む末梢免疫系が、黒質ニューロンの神経炎症および神経変性の過程に及ぼす役割を研究するための重要なツールを構成する11,33,34。最後に、このマウスモデルはまた、酸化ストレス、エネルギー欠損、および損傷した細胞小器官2などの内部細胞プロセスによって誘導されるもの、またはミクログリア細胞、アストロサイト、および細胞傷害性T細胞8によって産生される神経毒性因子などの外部プレーヤーによって発揮されるものを含む、インビボでの神経変性の細胞および分子メカニズムを研究するための貴重なシステムを表し、28,29,35。
このマウスモデルの限界は、脳外におけるαSynの病理学的凝集がパーキンソン病の発症の初期段階をどのように構成するかの研究である36。これに関して、黒質ニューロンの神経変性および運動障害の前に、αSyn病理が腸粘膜および嗅上皮36 において、そしておそらくαSyn特異的T細胞応答において同様に始まることを示す証拠が増えている12。その後、αSyn凝集体は迷走神経を通って脳幹に移動し、ドーパミン作動性ニューロン12の神経炎症および神経変性を引き起こす。AAV-hαSynモデルはパーキンソン病のほとんどの側面を反復しているが、このモデルでは大脳外位置におけるαSynの病理学的凝集の明らかな関与はない。パーキンソン病のこれらの側面を研究するのに適したhαSyn病理を含む代替モデルは、Thy1プロモーターの制御下でhαSynを過剰発現するトランスジェニックマウスであるThy1-SNCA モデル37であり、疾患の発症は腸内微生物叢に依存し、明らかな胃腸障害38を伴う。
パーキンソン病の病態生理学に関連する多様なプロセスの研究には有用であるが、現在のマウスモデルは、対応する空間座標におけるウイルスベクターの正しい送達、ニューロンにおけるhαSynの選択的発現(AAV血清型およびベクター構築物に依存する)を含む、細かくチェックされるべき重要なステップを含む、 パーキンソン病表現型を分析する前の適切なAAV用量およびタイミング。針が完全にまっすぐでない場合、SNの正しい空間座標の使用が十分でない場合があり、時には人間の目には知覚できないため、SNにおけるウイルスベクターの適切な送達の分析が必要である。さらに、AAVベクターの拡散は、AAV血清型39に依存する。これらの理由から、SNの領域を含む脳切片におけるGFPの観察に続いて、注入されたAAV−GFPベクターの正しい送達および拡散をチェックする定期的な品質管理を行う必要がある。
ニューロンにおけるhαSynの選択的発現に関しては、原則として、hαSynの発現は、ニューロンに選択的なプロモーターによって制御されるように、またはさらに正確には、ドーパミン作動性ニューロンにおける遺伝子の選択的発現を誘導するためのAAVベクターにおけるTHプロモーターの使用など、ドーパミン作動性ニューロンに対して選択的に制御されるように操作することができる40.しかし、この戦略は、求められているのが目的の遺伝子の過剰発現である場合には機能しません。このため、本モデルでは、神経指向性を有する強力なプロモーター(下流遺伝子の高発現を誘導するプロモーター)やAAV血清型を用いることが必須である。本研究では、hαSynの過剰発現を誘導する強力なプロモーターとしてCBAプロモーターを用い、ウイルスベクターにはAAV5血清型を用いた。この血清型は、マウスおよびラットのニューロン41、42を形質導入するために以前に使用されてきた。ここで、この結果は、マウスのSNにおけるAAV5−GFPの送達の12週間後に、緑色蛍光がSNおよび線条体の両方の同側側に選択的に存在していたことを実証し(図1)、黒質線条体経路のニューロンの効率的な形質導入を示す。
パーキンソン病のこのマウスモデルのもう一つの重要な側面は、手術後の特定のプロセスを分析するために必要な時点である。この点で、この研究は、病理学に関与する異なるプロセスの動態学的研究を示している。マウス1匹当たりに与えられたウイルスゲノムの用量、使用されるAAVの血清型、または使用されたAAVのバッチでさえも重要な時点が変化するので、TH+ニューロンの有意な喪失および運動障害を誘導するために必要なAAV-αSynの量についての用量反応分析が最初に行われた。以前の研究では、マウス16,17,30,31匹あたり6 x 10 8-3 x 10 10ウイルスゲノムの範囲の用量で、マウスにAAV-αSyn注射を12週間行った後、有意な運動障害および黒質線条体経路のTH+ニューロンの喪失が示されている。したがって、マウスにおける黒質線条体経路におけるhαSyn発現、TH+ニューロンの喪失、および運動障害を誘導するために使用されるAAV-hαSynの用量は、マウス当たり1 x108–1 x1010ウイルスゲノムの範囲であった。また、TH+ニューロンの消失および運動障害がSNにおけるhαSynの過剰発現によって誘導され、SNのニューロンのAAV感染によって誘導されることを制御するために、レポーター遺伝子(AAV-eGFP)をコードするAAVをマウスのSNに一方的に送達し、神経変性および運動障害を決定した対照群を包含した。その結果、定位手術の12週間後、マウス1匹あたり1 x1010個のウイルスゲノムが適切な用量のAAV5-hαSynであり、このウイルス負荷を受けたマウスは黒質線条体経路において有意なhαSynを示し(図2および図3)、TH+ニューロンの喪失(図4)、および運動障害(図5)を示した。対照的に、低用量のAAV5-hαSyn(マウスあたり1 x108ウイルスゲノム、マウスあたり1 x109ウイルスゲノム)は、これらすべてのパラメータを一緒に有意に変化させるのに十分強くありませんでした(図2-4)。注目すべきは、マウス1匹当たり1 x1010個のウイルスゲノムでのAAV−GFPの投与は、低い(〜20%)が、黒質ドーパミン作動性ニューロンのTH+ニューロンの有意な程度の損失を誘導した(図4A、B)。この結果は、このモデル41を用いた以前の観察と一致し、おそらくSNにおけるAAVベクターの投与によって誘導される低レベルの神経炎症の結果である。それにもかかわらず、TH+ニューロンの喪失の程度は、同じ用量のAAV−GFPを投与されたマウスと比較して、AAV5−hαSynを投与されたマウスにおいて有意に高かった(図4C)。注目すべきは、hαSyn発現の動態は、形質導入の効率だけでなく、AAV拡散の程度にも依存する39。AAV拡散はAAV血清型に依存するので、この動物モデルにおける正確な重要な時点は、AAV5とは異なる別のAAV血清型を使用する場合に変化し得る。
その後、マウス1匹あたり1 x 1010個のウイルスゲノムを使用して速度論的解析を行い、このマウスモデルの主要な時点を決定しました。現在の証拠は、パーキンソン病43,44の早期診断を可能にする運動障害の前に現れるいくつかの初期症状を示しているので、これらの実験は、hαSyn発現がすでに明らかであったが、運動障害がない場合に、hαSyn発現が明らかであった時点を見つけようとした。結果は、SNにおけるhαSyn発現の発症がAAV-hαSynの定位送達後5週間であったことを示す(図6)。この時点は、神経炎症および神経変性プロセスを停止するように調整された治療法の投与を開始するための興味深い時間的点を構成する。ここで決定された他の重要な時点は、神経炎症プロセスに関連する2つの重要な事象のピーク時間、すなわちミクログリアが最大活性化度に達する時間とSNへの最大T細胞浸潤時間であった。結果は、最大ミクログリア活性化の2つの波に達する傾向を示す曲線を示し、最初の波は手術後10週目、2番目は手術後15週目であった(図7)。T細胞浸潤の動態解析は、定位手術後11週間におけるSNへのTreg浸潤のピーク時間を示した(図8)。驚くべきことに、分析された時間枠(手術後8〜13週目)の間にSNに浸潤するエフェクターT細胞(CD4+ Foxp3-)は検出されなかった。全体として、これらの結果は、手術後5週目(hαSyn過剰発現の発症)から手術後10週目(神経炎症およびT細胞浸潤の第1波)の間のこの前臨床モデルを用いて、神経炎症の過程を停止し、SNへのT細胞浸潤を減弱させることを目的とした治療の投与を開始するための適切な時間枠を示唆している(図9)。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig09.jpg"> 図 9: この動物モデルで見つかった重要な時点の概要。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig09large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

アルツハイマー病に次いで、パーキンソン病は世界で2番目に流行している神経変性疾患です。パーキンソン病に罹患した主要なニューロンは、ドーパミンを産生し、随意運動を制御する黒質線条体経路のニューロンである。結果として、この障害に関連する最も特徴的な症状は運動障害である。この病理はまた、シナプス前末端に関連する細胞質ゾルタンパク質であるα-シヌクレイン(αSyn)1を主成分とする脳内のタンパク質凝集体の沈着を伴う。αSynの病原性封入体の生成は、ミスフォールディングまたはこのタンパク質のいくつかの翻訳後修飾によって誘発されるという証拠が示されている2。
特に、αSyn病理とヒトパーキンソン病および動物モデルにおける黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンの喪失との間に密接な関係が確立されている3,4。αSyn凝集体がどのように生成され、どのようにニューロンの死を誘発するかを理解することは、この分野で大きな課題を表しています。増え続ける研究グループは、酸化ストレスを増加させることによって、ミトコンドリア機能不全がαSyn凝集体2の生成の主要な原因の1つであることを示している。実際、パーキンソン病リスクに関連するいくつかの遺伝子は、ミトコンドリア機能、形態、およびダイナミクスに関与するタンパク質をコードする5,6。加えて、機能不全ミトコンドリアおよびミスフォールディングαSynの蓄積をもたらすリソソーム機能障害は、αSyn凝集体7の生成を促進する別の主要な事象を構成する。
新たな証拠は、αSyn凝集体が脳内に沈着すると、これらの病原性タンパク質がミクログリア上のトール様受容体(TLR)を刺激し、ミクログリア活性化および黒質(SN)における初期炎症環境を引き起こすことを示している8,9。さらに、この証拠は、αSyn凝集体が抗原提示細胞によって捕捉され、T細胞に提示され、αSyn10、11に特異的な適応免疫応答を誘導することを示している。これらのαSyn特異的T細胞は、その後脳に浸潤し、活性化ミクログリアによって再刺激され、したがってニューロン死を誘発する神経毒性因子の分泌を促進する9,10。興味深いことに、いくつかの証拠は、αSyn凝集体が最初に腸神経系で生成され、次いで迷走神経を通って脳幹12に輸送されることを示唆している。
神経毒性物質(すなわち、6-ヒドロキシドーパミン、パラコート、ロテノン、1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジン)の投与によって誘導されるものおよび遺伝的条件を伴うもの(すなわち、変異型α-シヌクレイン、変異型ロイシンリッチリピートキナーゼ2)13の投与によって誘導されるものを含む、パーキンソン病のいくつかの動物モデルが長年にわたって使用されてきた13.神経毒誘発性神経変性を含むモデルがパーキンソン病のいくつかの側面を複製しているにもかかわらず、それらのどれもが疾患のすべての本質的な側面を反復していないか、または進行性ではない13。一方、ロイシンリッチリピートキナーゼ2の変異バージョンの発現を含む遺伝子マウスモデルであるが、α-シヌクレインの変異バージョン、またはヒト野生型α-シヌクレインの過剰発現は運動障害をもたらし、場合によっては、シヌクレイノパシーの発症も、パーキンソン病の本質的な側面である黒質ドーパミン作動性ニューロンの顕著な神経変性を再現しない13、14。神経変性の第3の種の動物モデルは、パーキンソン病の本質的な側面のほとんどを満たすことに成功した、ヒトα−シヌクレイン(AAV−hαSyn)をコードするアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)の定位送達である14,15。重要なことに、AAVは、哺乳類の成体脳において、高い有効性を有するニューロンの形質導入を長期的に可能にする。さらに、SNにおけるAAV−hαSynの定位送達は、αSyn病理、ミクログリア活性化、神経変性、および運動障害を含む疾患の本質的な側面の多くを再現することが示されている16、17、18、19、20。本研究は、ウイルスベクターの用量およびウイルスベクター送達後の時間が、黒質線条体経路におけるhαSyn発現、神経変性、および神経炎症の程度にどのように影響するか、ならびにSNにおけるhαSynの一方的定位送達のマウスモデルにおける運動障害の程度の分析を提示する。

<table><tbody><tr><td>動物および動物用食品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foxp3-GFP C57BL/6マウス</td><td>ジャクソン研究所(バーハーバー、メイン州)</td><td>品番:&nbsp;023800</td><td></td></tr><tr><td>実験室げっ歯類ダイエット</td><td>ラボダイエットげ</td><td>っ歯類ダイエット5001</td><td>標準げっ歯類ダイエット</td></tr><tr><td>野生型C57BL / 6マウス</td><td>ジャクソン研究所(バーハーバー、メイン州)</td><td>在庫番号:000664</td><td></td></tr><tr><td>VIRAL VECTORS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV5-CBA-&alpha;Syn</td><td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td><td>N/A</td><td>Stock concentration at 10E13 vg/mL</td></tr><tr><td>AAV5-CBA-eGFP</td><td>University of Iowa Viral Vector Core Facility</td><td>N/A</td><td>Stock concentration at 9.5 x 10E12 vg</td></tr><tr><td>/>mL<Anesthetics AND ANALGESICS</Strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>218082</td><td>1% for stereotaxic</td></tr><tr><td>surgery ケタミン</td><td>Drag Pharma</td><td>CHE30</td><td>70 mg/Kg&nbsp; 脳定位固定装置手術用</td></tr><tr><td>セボフルラン</td><td>Baxter</td><td>VE2L9117</td><td>経心灌流前用</td></tr><tr><td>トラマドール</td><td>Drag Pharma</td><td>DPH134</td><td>30 mg/Kg 24 時間ごと</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Centrovet</td><td>EHL40</td><td>9 mg/kg 脳定位固定装置</td></tr><tr><td>< >EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ビームテストホーム</td><td>メイド</td><td>N / A</td><td>水平ビーム25cm、幅3cm。ビーム表面は金属グリッド(1 cm2)で覆われていました。</td></tr><tr><td>クライオステート</td><td>ライカ</td><td>CM1520</td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ニコン</td><td>S2800 Coolpix</td><td>ビーム試験性能の記録用</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51</td><td>IHC分析に使用(セクション4.4)顕微鏡</td></tr> <tr><td></td><td>オリンパス</td><td>IX71</td><td>IF分析に使用(セクション5.3)</td></tr>顕微鏡 <tr><td></td><td>ライカ</td><td>DMI8</td><td>IF分析に使用(セクション5.7)</td></tr><tr><td>ニュースタンダード 定位固定装置、マウス</td><td>Stoelting、ウッドデール、イリノイ州、米国</td><td>手術用51500</td><td>定位固定装置フレーム</td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Masterflex</td><td>C-flex L/S16</td><td></td></tr><tr><td>電源ユニット</td><td>オリンパス</td><td>U-RFL-T</td><td>IF分析に使用(セクション5.3)</td></tr>外科<tr><td>用縫合</td>糸 <td>Sylkam&reg;, B Braun</td><td>C0760171</td><td></td></tr><tr><td>Syringe 100 U</td><td>BD</td><td>324918</td><td>経心灌流前の麻酔用、29G ニードル</td></tr><tr><td>シリンジ RN 5uL SYR W/O ニードル</td><td>ハミルトン</td><td>HA-7641-01</td><td>ウイルスベクターの無菌化</td></tr><tr><td>バッファーおよび試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aviden, ペルオキシダーゼ結合体</td><td>メルク, ダルムシュタット, ドイツ</td><td>189728</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>メルク, ダルムシュタット, ドイツ</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Cryotrotection buffer</td><td>自家製</td><td>N/A</td><td>20% グリセリンと 2% DMSO in PBS</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab228549</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount -G T</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>5000121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>104005</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>自家製</td><td>N/A</td><td>0.125 M, pH 7.4</td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ不活性化緩衝液</td><td>自家製</td><td>N/A</td><td>0.03% H2O2 メタノール</td></tr><tr><td>Triton X-100</td> <td>中Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Hydrochloride</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>1185-53-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>822184</td><td></td></tr><tr><td>ANTIBODIES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>111065003</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H + L)&nbsp;Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H + L)&nbsp;Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21244</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG(H + L)&nbsp;Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11081</td><td></td></tr><tr><td>ウサギモノクローナル抗α-Synuclein</td><td>Abcam</td><td>ab138501</td><td></td></tr>ウサギ<tr><td>モノクローナル抗Iba-1</td><td>Abcam</td><td>EPR16588</td><td></td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗チロシンヒドロキシラーゼ</td><td>ミリポア</td><td>AB152</td><td></td></tr>ラット<tr><td>モノクローナル抗CD4</td><td>バイオレジェンド</td><td></td>100402<td></td></tr><tr><td>SOFTWARES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>6.0</td><td>Fos stats analysis</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td>N/A</td><td>画像解析用</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td>ライカ顕微鏡による画像キャプチャ用</td></tr><tr><td>ProgRes Capture Pro</td><td>Jenoptik</td><td>N/A</td><td>オリンパスの顕微鏡</td></tr><tr>による画像キャプチャ用<td>VLCメディア</td><td>プレーヤーVideoLAN組織</td><td>N / A</td><td>行動テストの分析用</td></tr></tbody></table>

ヒトα-シヌクレインをコードするアデノ随伴ウイルスベクターにより誘導されるパーキンソン病マウスモデルの解析

Analyzing the Parkinson's Disease Mouse Model Induced by Adeno-associated Viral Vectors Encoding Human &#945;-Synuclein

パーキンソン病は、黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンの死、およびその結果、随意運動の制御の進行性の喪失を伴う神経変性障害である。この神経変性プロセスは、主にα-シヌクレインで構成される脳内のタンパク質凝集体の沈着によって引き起こされる。いくつかの研究は、神経炎症がパーキンソン病に関連する神経変性を発症するために必要であることを示した。特に、神経炎症過程は、ミクログリア活性化ならびに末梢T細胞の黒質(SN)への浸潤を含む。本研究では、ミクログリアの活性化、SNへのT細胞浸潤、黒質ドーパミン作動性ニューロンの神経変性、運動障害を再現するパーキンソン病のマウスモデルを解析する。パーキンソン病のこのマウスモデルは、ヒト野生型α−シヌクレイン(AAV−hαSyn)をコードするアデノ随伴ウイルスベクターのSNへの定位送達によって誘導される。SNへのウイルスベクターの正しい送達を、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする対照ベクターを用いて確認した。その後、SNに投与されたAAV-hαSynの投与量がhαSyn発現の程度、黒質ドーパミン作動性ニューロンの喪失、および運動障害にどのように影響するかを評価した。さらに、hαSyn発現、ミクログリア活性化、およびT細胞浸潤の動態は、疾患発症の経時変化を通して決定された。したがって、この研究は、パーキンソン病のこの前臨床モデルにおけるシヌクレイン病理および神経炎症を標的とするために有用であり得る重要な時点を提供する。

黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンにおけるAAVベクターの正しい送達の検証 シヌクレイン病理によって促進される神経炎症、神経変性、および運動障害のプロセスを研究するために、SN16、17、30、31におけるhαSynをコードするAAVの一方的定位送達によって誘発されるパーキンソン病のマウスモデルを使用した(補足図1の実験デザインを参照のこと).黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンにおけるAAVベクターの正しい送達を検証するために、GFP(AAV−GFP)をコードするAAVをSNに注射し、そして12週間後に、GFP蛍光およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH)免疫蛍光によるSNおよび線条体における免疫反応性を分析した。GFP関連蛍光はもっぱら同側側で観察され、SNおよび線条体の両方でTH免疫反応性との有意な共局在が見られ、黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンにおけるAAVベクターの正しい送達が示された(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig01.jpg"> 図1:黒質線条体経路におけるAAV−GFPの送達の分析。AAV-GFP(1 x 1010 vg/マウス)を投与し、12週間後に屠殺し、THを(A)SN(スケールバーは118μm)および(B)線条体(スケールバーは100μm)で免疫染色した。TH−およびGFP関連蛍光を、落射蛍光顕微鏡によって分析した。核はDAPIで染色した。TH(赤)、GFP(緑)、およびDAPI(青)のマージまたは単一染色の代表的な画像が示されている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
AAV-hαSynにより誘導されるパーキンソン病のマウスモデルにおける神経変性および運動障害を誘導するために投与されるウイルスベクターの用量の設定 黒質ドーパミン作動性ニューロンの神経変性を促進するhαSynの有意な過剰発現を誘導するために必要なAAV-hαSynの用量を試験するために、異なる用量(1 x108ウイルスゲノム[vg]/マウス、1 x109 vg/マウス、または1 x 1010 vg/マウス)のAAV-hαSynを注射し、12週間後に、hαSyn免疫反応性およびTH免疫反応性の程度を黒質線条体経路で評価した。hαSyn免疫反応性はSNで試験されたすべての用量で明らかであったが(図2)、1 x 1010 vg/マウスを投与されたマウスのみが線条体において明らかなhαSyn免疫反応性を示した(図3)。さらに、AAV-hαSynを1 x1010 vg/マウス投与したマウスでは、SNにおけるドーパミン作動性ニューロンの有意な喪失が示された(図4A、B)。AAV-GFPを1 x1010 vg/マウス投与されたマウスは、低度(〜20%)のニューロン喪失を示したが(図4A、B)、同じ用量のAAV-hαSynを投与されたマウスは、ニグラルドーパミン作動性ニューロンの神経変性の有意に高い程度を示した(図4C)。したがって、AAV-hαSynの1 x10 10 vg/マウスを用いてさらなる実験を行った。さらに、運動障害の程度は、前述のように、ビーム試験(図5A)を用いて異なる用量のAAV−hαSynを投与されたマウスにおいて決定された(図5A)。ビーム試験において、AAV-hαSynの1 x 10 10 vg/マウスでのみ、左右のパッドによる誤差の数を比較した場合(図5B)、およびAAV-hαSynを投与されたマウスの総誤差数を対照ベクターAAV-GFPを投与したマウスと比較した場合(図5C)において、運動性能の有意な低下が排他的に検出された。したがって、AAV-hαSynの1 x10 10 vg/マウスを用いてさらなる実験を行った。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig02.jpg"> 図2:異なる用量のAAV−hαSynで処置したマウスのSNにおけるヒトα−シヌクレイン発現の分析。(A)1 x 1010 vg/マウス、(B)1 x109 vg/マウス、または(C)1 x108 vg/マウスでAAV-hαSynを投与し、12週間後に屠殺し、蛍光模倣を用いてSN中の免疫蛍光によりhαSyn発現を解析した。核はDAPIで染色した。hαSyn(赤)またはDAPI(青)のマージまたは単一染色の代表的な画像が示されている。スケール バーは 118 μm です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig03.jpg"> 図3:異なる用量のAAV-hαSynで処置したマウスの線条体におけるヒトα-シヌクレイン発現の分析。(A)1 x 10 10 vg/マウス、(B)1 x 109 vg/マウス、または(C)1 x 108 vg/マウス)でAAV-hαSynを投与したマウスを屠殺し、12週間後に屠殺し、線条体における免疫蛍光を落射蛍光顕微鏡を用いてhαSyn発現を解析した。核はDAPIで染色した。hαSyn(赤)またはDAPI(青)のマージまたは単一染色の代表的な画像が示されている。スケールバーは100μmです。結合された画像の右上隅にあるインサートは、より高い倍率で関心のある領域を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig04.jpg"> 図4:異なる用量のAAV−hαSynまたは対照ベクターで処置したマウスにおけるSNのドーパミン作動性ニューロンの喪失。マウスはAAV-hαSyn(1 x 10 10 vg/マウス、1 x109 vg/マウス、または1 x108 vg/マウス)またはAAV-GFP(1 x10 10 vg/マウス)を投与され、12週間後に屠殺され、THは免疫組織化学によってSNpcで分析された。(A) 代表的な画像。スケールバー、100μm(B,C)ニューロンの密度は、TH+ニューロン数/mm2として定量化した。データはSEM±平均を表す。(B)両側と対側との同側比較を、両側ペアのスチューデントのt検定を用いて行った。(C) AAV-hαSynまたはAAV-GFPを1 x1010 vg/マウス投与したマウスの同側側の比較を行った。(B,C)白いバーはAAV-hαSyを投与されたマウスの同側側のTH+ニューロンの定量を示すのに対し、緑色のバーはAAV-GFPを投与されたマウスの同側側のTH+ニューロンの定量を示す。灰色のバーは、対応する群の対側側のTH+ニューロンの定量を示す。比較は、両側非対のスチューデントのt検定によって実施した。*p &lt; 0.05;**p &lt; 0.01.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig05.jpg"> 図5:異なる用量のAAV−hαSynで処置したマウスにおける運動性能の分析。マウスは、AAV-hαSynまたはAAV-GFPの異なる用量(1 x 10 10 vg/マウス、1 x109 vg/マウス、または1 x108 vg/マウス)を受け、12週間後、ビーム試験によって運動性能を評価した。(A)梁の上を歩くネズミの画像。(b)左肢(対側)対右肢(同側)によって行われたエラーの数を、AAV−hαSyを投与されたマウス群において定量化した。(c)同じ用量のAAV−hαSynまたはAAV−GFPを受けた異なる実験群間で総誤差数を比較した。データはSEM±平均を表す。比較は、(B)対応のある両側スチューデントのt検定または(C)不対応の両側スチューデントのt検定によって実施された。*p &lt; 0.05;**p &lt; 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
AAV-αSynによるパーキンソン病モデルの動態解明 有意なレベルの神経変性および運動障害を誘導するために使用される適切なAAV−hαSyn用量を決定した後、hαSyn過剰発現の発症を定義するための実験が行われた。この目的のために、マウスをAAV-hαSynまたは偽手術の1 x 1010 vg/マウスで処置した。hαSyn発現の程度を、定位手術後2~5週目に週に1回SNで解析した( 補足図2の実験計画を参照)。結果は、hαSyn発現が術後2週間という早い時期に低レベルで検出されたにもかかわらず、hαSynクラスターが定位手術後5週目に出現したことを示している(図6)。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig06.jpg"> 図6:AAV−hαSynで処置したマウスのSNにおけるヒトα−シヌクレイン発現の経時変化の解析。 マウスはAAV-hαSyn(1 x1010 vg/マウス)または偽の定位手術のみを受け、SNにおけるhαSynの発現を(A)2週間、(B)3週間、(C)4週間、または(D)5週間後に落射蛍光顕微鏡を用いた免疫蛍光で解析した。核はDAPIで染色した。hαSyn(赤)またはDAPI(青)のマージまたは単一染色の代表的な画像が示されている。スケールバー、100μm。結合された画像の右上隅にあるインサートは、より高い倍率で関心のある領域を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
その後、AAV-hαSynの定位送達後の中枢神経系(CNS)における神経炎症およびT細胞浸潤を分析するのに適した時点を決定するための実験を行った。AAV−hαSynでマウスを処置した後のミクログリア活性化のピークを決定するために、線条体において高レベルのIba1を発現する細胞の程度を、定位手術後2〜15週の間に週に1回評価した。結果は、AAV−hαSyn処置の15週間後のマウスの対側側と比較して、同側側のミクログリア活性化の有意な増加を示す(図7)。SNpcに浸潤したTreg(CD4+ Foxp3+)細胞の数も、共焦点顕微鏡観察に続く免疫蛍光によるAAV−hαSynの定位送達後の異なる時点で評価した。その結果、SNpcへのTreg浸潤のピークは術後11週目であったのに対し、Tregが脳のこの領域に浸潤する程度は術後8週目または13週目には低かった(図8)。線条体に浸潤するCD4+ T細胞は検出されなかった(データは示さず)。全体として、これらの結果は、AAV-hαSynの1 x1010 vg/マウスを使用して、神経炎症を分析するのに最も適した時点は定位手術後15週であり、CNSへのT細胞浸潤を分析するのに適切な時点はAAV-hαSyn治療後11週であると思われることを示している。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig07.jpg"> 図7:AAV-hαSynを接種したマウスにおけるミクログリア活性化の経時変化の解析。 マウスはAAV-hαSyn(1 x1010 vg/マウス)を投与し、手術後の異なる時点での線条体中のIba1の免疫組織化学的分析によってミクログリア活性化を評価した。(a)AAV-hαSynの接種後5週間、10週間、または15週間に屠殺したマウスからのIba1の免疫組織化学的分析の代表的な概要画像が示されている。(B)活性化ミクログリアの密度を、面積当たりの高レベルのIba1およびアメバ様形状を発現する細胞の数として定量した。データはSEM±平均を表す。両側ペアのスチューデントのt検定を用いて、各群における同側および対側Iba1間の統計的差異を決定した。*p &lt; 0.05 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63313/63313fig08.jpg"> 図8:AAV-hαSynを接種したマウスのSNへのCD4+ T細胞浸潤の経時変化の解析。Foxp3gfpレポーターマウスはAAV-hαSyn(1 x 1010 vg/マウス)を受けた。Foxp3を発現するCD4+ T細胞の存在およびTH+ニューロンの存在を、免疫蛍光によってSN中の異なる時点(手術後8週目、11週目、および13週目)で分析した。(a)単一免疫染色またはマージのための代表的な画像が示されている。(B)SN中の面積当たりのCD4+Foxp3+ T細胞の数を定量した。データは、1群あたり3匹のマウスからのSEM±平均を表す。*p&lt;0.05、両側スチューデントのt検定による同側対対対外CD4+ Foxp3+ T細胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/63313fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:シヌクレイン病理、神経変性、および運動障害に対する異なる用量のAAVベクターの効果を評価するための実験計画。野生型雄性C57BL/6マウスを麻酔し、CBAプロモーターの制御下でヒトα-シヌクレイン(AAV-hαSyn)またはeGFP(AAV-GFP)をコードするAAVの異なる用量(1 x 10 10 vg/マウス、1 x109 vg/マウス、または1 x108 vg/マウス)の立体接種を右黒質(SN)に受けた。12週間後、SNおよび線条体(Str)におけるGFPおよびhαSynの発現を免疫蛍光(IF)により評価し、チロシンヒドロキシラーゼ陽性(TH+)細胞をSNにおける免疫組織化学(IHC)により定量し、運動性能をビーム試験により評価した。各実験群におけるマウスの数を括弧内に示している。*は、解析前に1匹のマウスが死亡したグループを示します。各分析は、対応する結果が示されている論文の本文からの図の番号を括弧内に示している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:T細胞浸潤、神経炎症、およびhαSyn発現の動態を決定するための実験計画。 Foxp3gfp レポーターマウスを麻酔し、CBAプロモーターの制御下でヒトα-シヌクレイン(AAV-hαSyn)をコードするAAV(1 x 1010vg /マウス)の右黒質(SN)または偽手術(PBS)への定位接種を受けた。異なる時点でマウスを屠殺し、SNおよび線条体におけるhαSynの発現を免疫蛍光(IF)によって評価し、GFP(Foxp3)、CD4、およびチロシンヒドロキシラーゼ陽性(TH+)細胞をSNにおけるIFによって定量し、線条体(Str)における免疫組織化学(IHC)によってIba1発現を解析した。各実験群におけるマウスの数が示される。各分析に含まれる時点の範囲が示される。各分析は、対応する結果が示されている論文の本文からの図の番号を括弧内に示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63313/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

この研究は、パーキンソン病の前臨床モデルにおける神経炎症、神経変性、および運動障害を誘発するのに必要なベクター用量および曝露時間を解析する。ヒトα−シヌクレインをコードするこれらのベクターは、パーキンソン病に関連するシヌクレイン病理を再現するために黒質に送達される。

Parkinson&#39;s disease is a neurodegenerative disorder that involves the death of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway and, ...

この手順の全体的な目標は、パーキンソン病の本質的な側面のほとんどを動物モデルで再現することである。アデノ随伴ウイルスベクターの定位送達では、黒質中のヒトシヌクレインをコードする。パーキンソン病は、黒質線条体経路におけるドーパミン作動性ニューロンの死、および結果として随意運動の制御喪失の進行を伴う神経変性障害である。この神経変性プロセスは、主にシヌクレインによって構成されている脳内のタンパク質凝集体の沈着によって伴われる。新たな証拠は、シヌクレイン凝集体がミクログリア上のトール様受容体を刺激し、したがって黒質における神経炎症を引き起こす可能性があることを示している。さらに、証拠は、シヌクレイン凝集体を捕捉および提示することができ、T細胞に抗原提示細胞によって、シヌクレインに特異的な適応免疫応答を誘導することができることを示す。黒質におけるヒトシヌクレインをコードするアデノ随伴ウイルスベクターの定位送達は、シヌクレイン病理、ミクログリア活性化、T細胞活性化、神経変性、および運動障害を含む疾患の多くの本質的な側面を再現することが示されている。本研究は、ウイルスベクターおよびウイルスベクター送達後の時間が、黒質線条体経路におけるヒトシヌクレイン発現、神経変性および神経炎症の程度、ならびに黒質におけるヒトシヌクレインの一方的定位送達のマウスモデルにおける運動障害の程度にどのように影響するかの分析を提示する。無菌環境を維持するために、手術中は、靴カバー、手術用マスク、衛生バリア、手袋、手術帽など、適切な手術用服を着用してください。マウスおよびすべての手術材料にエタノールを噴霧し、無菌環境を維持する。鎮痛を誘発するには、カルプロフェンを12時間ごとに皮下注射し、手術の1時間前から、手術後3日まで続けます。マウスを麻酔するには、動物を誘導チャンバーに入れます。イソフルランの流れを0.5%の割合で開き、マウスが右反射を失うまで約5分間かけてゆっくりと5%まで増加させます。誘導チャンバーから動物を取り外します。直ちに動物を適切な大きさの鼻円錐形を備えた非再呼吸回路に移す。手術の全時間を通してイソフルラン1%でマウス麻酔を維持する。マウスの尾と足をつまんで完全に麻酔をかけていることを確認します。尻尾と足をつまんでもマウスが反応しない場合は、マウスが完全に麻酔をかけられていることを意味します。はさみを使ってマウスの頭を剃ります。クロルヘキシジン2%の綿棒を使用してマウスの皮膚をきれいにし、すべての髪を取り除きます。マウスヘッドを定位フレームに固定します。角膜保護剤をマウスの両眼に置き、綿棒を用いた。他のげっ歯類のストレス誘発を防ぐために、手術室に他のマウスがいないことを避けてください。クロルヘキシジン2%に続いてエタノール70%の3ラウンドでマウスの頭をきれいにし、外科用材料を使用して頭蓋骨を露出させ、内側線に対して前後座標2.8mm、および中側1.4mmのドリルで細い穴を開ける。10マイクロリットルの注射器の針を穴に入れ、硬膜に対して7.2mmの背腹側に到達するまで、脳内の針をゆっくりと動かす。組織が少し落ち着くように針を最終位置に2分間放置し、次いで30秒ごとに0.2マイクロリットルの割合で、1マイクロリットルのウイルスベクターを右黒質に注入する。ウイルスベクターの送達後5分間針を同じ位置に放置し、その後ゆっくりと引き抜く。滅菌シルク縫合糸を用いて創傷を閉じる。マウスを家庭用ケージに入れ、電気式暖かいマットレスの上に置いて事前に温めます。定位手術の12週間後、前に説明したビーム試験の簡略化されたバージョンを使用して、運動性能を評価する。このためには、長さ25cm、幅3cmの水平ビームを使用してください。ビーム表面は、1センチメートルの正方形の金属グリッドで覆われ、ビームから1センチメートル高くなければなりません。グリッドサーフェスビームを横断しながら、ホームケージがあるビームの一方の端から反対側の端まで、マウスのビデオを作成します。運動性能の決定の前に、マウスを2日間訓練する。初日に、グリッドなしでビームを5回歩くようにマウスを訓練します。2日目に、グリッドの存在下でビームを5回歩くようにマウスを訓練します。3日目に、運動性能を評価する。これを行うには、スローモーションモードでビデオを見ることによって、左足または右足によって別々に実行されたエラーの数を定量化します。マウスを麻酔するには、ケタミンとキシラジンの混合物を腹腔内に注射する。マウスが完全に麻酔されたら、手術材料で胸郭を開き、心臓を露出させる。次に、心臓の左心室に平らな先端の針を挿入します。針をパイプに結合することにより、蠕動ポンプを用いて、毎分9.5ミリリットルの速度で、50ミリリットルのリン酸緩衝液生理食塩水を灌流する。はさみとピンセットを使用して脳を取り除き、リン酸緩衝液生理食塩水に5ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドを浸漬して固定します。その後、固定された脳を30%スクロースの15ミリリットルに48時間入れる。その後、脳を4ミリリットルの凍結保護溶液に入れ、脳を80度で保存するか、次のステップですぐに使用してください。線条体スライスを得るには、脳を厚さ40マイクロメートルのセクションに切断し、1.34mmから始まり、0.26mmで仕上げる。各スライスを2ミリリットルのクライオチューブで収穫し、前後の順序に従います。線条体における免疫組織化学的および免疫蛍光学的分析を行うには、核の吻側尾部全体をカバーする5つの冠状線条体切片を均一な間隔で採取する。黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンにおけるウイルスベクターの正しい送達を検証するために、GFPをコードするベクターを注射し、黒質において、および12週間後に、GFP蛍光およびチロシンヒドロキシラーゼの免疫蛍光による黒質および線条体における免疫反応性を分析した。GFP関連蛍光は、もっぱら同側部位に位置し、黒質および線条体の両方で免疫反応性のチロシンヒドロキシラーゼとの有意な共局在が観察され、黒質線条体経路のドーパミン作動性ニューロンにおけるウイルスベクターの正しい送達を示す。必要なシヌクレインをコードするベクターの用量を試験するために、ニグラルドーパミン作動性ニューロンの神経変性を促進するヒトシヌクレインの有意な過剰発現を誘導するために、異なる用量のベクターを注入した。そして12週間後、ヒトシヌクレイン免疫反応性、およびチロシンヒドロキシラーゼ免疫反応性の程度を、黒質線条体経路において試験した。ヒトシヌクレインの免疫反応性は明らかであり、すべての用量を黒質で試験した。しかしながら、マウス当たり10〜10個のウイルスゲノムを受けたマウスのみが、線条体において明らかなヒトシヌクレイン免疫反応性を示した。ヒトシヌクレインをコードするベクターのマウス当たり10〜10個のウイルスゲノムを受容したマウスは、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの有意な喪失を示した。GFPをコードするベクターの同じ用量を受けたマウスは、低程度のニューロン喪失を示したが、これらのマウスは、ヒトシヌクレインをコードするベクターを受容したマウスと比較して、有意に低い程度の神経変性を示した。ビーム試験を用いて、ヒトシヌクレインをコードするベクターのマウス当たり10〜10個のウイルスゲノムを受容し、右足と左足によってなされたエラーの数を比較するとき、またはエラーの総数を比較するとき、ヒトシヌクレインをコードするベクターを受容したマウスにおいて、運動性能の有意な低下が排他的に検出され、 それらのマウスが制御ベクターを受け取る。ヒトシヌクレイン発現の発症を定義するために、マウスを、マウス1匹当たり10〜10個のウイルスゲノム、ヒトシヌクレインをコードするベクター、または偽手術で処置し、ヒトシヌクレイン発現の程度を、週1回、定位手術後2〜5週間の間に黒質で分析した。結果は、ヒトのシヌクレイン発現が定位手術後の5週目に明らかになり始めたことを示している。ミクログリア活性化のピークを決定するために、高レベルのIba1を発現する細胞の程度を、マウスの線条体において、手術後2〜15週の間に定量した。結果は、ウイルス接種後15週間のマウスの対側側と比較して、同側側のミクログリア活性化の有意な増加を示す。実質的な黒質に浸潤した制御性T細胞の数を異なる時点で分析し、免疫蛍光による定位手術を行った後、共焦点顕微鏡観察を行った。黒質への制御性T細胞浸潤のピークは、手術後11週目に観察された。ここで解析した神経変性のマウスモデルは、パーキンソン病の病態生理学における多数の重要な側面関与を研究するのに有用なモデルを表す。シヌクレイン病態に関与するメカニズム、ミクログリア活性化、末梢免疫系の関与、神経炎症、および神経変性のメカニズムに関与するアデノ随伴ウイルスベクターの適切な用量であって、神経変性、神経炎症、T細胞浸潤、および運動障害を誘導するヒトシヌクレインをコードするサブタイプ5種は、マウス1匹あたり10~10個のウイルスゲノムである。この研究は、定位手術の5週間後に、ヒトシヌクレイン発現がすでに明らかであったが、この動物モデルに運動障害がない場合に、重要な時点を構成することを示している。これにより、この時点は、興味深い時間的点を表し、神経炎症および神経変性の進行を止めるように調整された実験的療法の投与を開始する。この動物モデルにおける神経炎症を分析するのに最も適した時点は、定位手術後の15週目である。中枢神経系へのT細胞浸潤を分析するのに適切な時点でありながら。ウイルスベクター接種後11週目にあると思われる。

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ここでは、ラットの実質的なニグラ・パルス・コンパクでのドーパミン作動性ニューロン数の半定量的決定のための自動化された方法を提示する。...

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マウス中枢神経系の組織学的解析のための重力供給経心筋灌流法

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アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

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ヒトα-シヌクレインをコードするアデノ随伴ウイルスベクターにより誘導されるパーキンソン病マウスモデルの解析

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