トリパノソーマ・クルジまたは他の病原性生物由来のDNAを検出するためのすぐに使用できるqPCR
January 20th, 2022
本研究では、反応容器にプリロードして冷蔵庫に数ヶ月間保存できる 、T. cruzi DNA検出用のすぐに使用できるqPCRを製造するための手順について説明します。
ゲル化プロトコルは、すぐに使用できるqPCR反応を生成し、実行を開始するために必要な時間とステップを削減します。このプロトコルにより、qPCR反応を一度に生成および制御して品質と量を測定できるため、レシピ計算中またはウェルへの分注中にオペレーターエラーが発生する可能性が低くなります。この方法は、従来の凍結フォーマットですでに完全に最適化されているすべてのqPCRに適用できます。
2つの主要な品質管理ステップが視覚的であるため、この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。メレジトース溶液を調製するには、15ミリリットルのプラスチックチューブに4グラムのメレジトースを秤量し、6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、粉末が可溶になるまで最高速度でボルテックスします。ヌクレアーゼを含まない水で最終容量を10ミリリットルにし、溶液にラベルを付けて摂氏2〜8度で最大6か月間保管します。
トレハロース溶液を調製するには、15ミリリットルのプラスチックチューブに4グラムのトレハロースを秤量し、粉末が可溶化するまで6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水とボルテックスを最高速度で加えます。次に、ヌクレアーゼを含まない水で容量を10ミリリットルに構成し、0.2ミクロンのフィルターで溶液をろ過します。溶液にラベルを付け、摂氏2〜8度で最大6か月間保管します。
グリコーゲン溶液を調製するには、15ミリリットルのチューブに2グラムのグリコーゲンを秤量し、6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、粉末が可溶になるまでボルテックスします。グリコーゲンの可溶化により大量の気泡が発生するため、溶液を摂氏2〜8度に8〜12時間保ちます。翌日、インキュベーションから溶液を取り出し、ヌクレアーゼを含まない水で容量を10ミリリットルに構成し、標識した溶液を摂氏2〜8度で最大6か月間保存します。
リジン溶液を調製するには、15ミリリットルのチューブに7.5ミリグラムのリジンを量り、6ミリリットルのヌクレアーゼ遊離水を加え、粉末が可溶になるまでボルテックスします。ヌクレアーゼを含まない水で容量を10ミリリットルに構成します。溶液を0.2ミクロンのフィルターでろ過し、摂氏2〜8度で最大6か月間保管します。
ゲル化混合物を調製するには、50ミリリットルのプラスチックチューブに適切な量のストック溶液を混合します。チューブを10回反転させて試薬を混合し、標識した溶液を摂氏2〜8度で最大3か月間保管します。ゲル化用のqPCRマスターミックスを調製するには、冷蔵容器で試薬を解凍します。
次に、1.5ミリリットルのチューブで適切な量の試薬を混合して、8本のチューブストリップまたは96ウェルプレートに十分なマスターミックスを調製します。次にピペット18.5マイクロリットルのゲル化マスターを各反応ウェルに混合し、チューブまたはプレートを真空オーブン内の熱伝導性支持体に入れます。96ウェルプレートを使用する場合は、吸水のために2つの96ウェルプレートごとに1つのベントナイトクレイバッグをオーブンに入れます。
サイクルが完了したら、容量が目に見えて約5マイクロリットルに減少し、チューブまたはプレートを指で叩いても液体が動かないことを確認して、試薬の適切なゲル化についてチューブまたはプレートをチェックします。使用前に、チューブまたはプレートを摂氏2〜8度で8〜12時間密封して保管してください。ゲル化したqPCRを使用するには、チューブストリップまたはプレートを冷蔵庫から取り出し、ワークステーションで開いてサンプル操作を行います。
15マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水と5マイクロリットルのDNAサンプルを各反応容器に加えます。チューブまたはプレートを密封し、目的の実験を実行し、定期的なデータ分析を実行します。現在のプロトコルでは、チャンバー内の温度は摂氏30度で一定に保たれますが、圧力は910〜930ミリバールと真空近くで変化します。
真空サイクルの後、チューブ内のマスターミックスは体積が減少し、底部でゲル化し、チューブを叩いても壁に飛び散ることはありません。ゲル化が不完全な場合、チューブを叩いたときに液体がチューブ壁に飛び散ります。公開されたオリゴヌクレオチド配列を用いたトリパノソーマcruzi-DNA検出をここに示す。
ゲル化が正しく実行されなかったときに同じサンプルを検出すると、感度が低下しました。最も重要なステップは、ゲル化前の試薬量の計算です。水はプロセス中に除去されるため、オペレーターは水を追加しないように注意する必要があります。
プロトコルの手順に厳密に従えば、基本的な実験室および分子生物学のスキルを持つオペレーターは、ゲル化プロセスを実行するのに問題はありません。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この研究は、T. cruzi DNA検出のためのqPCR反応を即座に使用できるようにするゲル化プロトコルを提示します。この方法は、品質管理された大規模生産を可能にすることで、準備時間を短縮し、オペレーターのエラーを最小限に抑えます。
主要な研究要素
科学の分野
- バイオテクノロジー
- 分子生物学
- 診断学
背景
- qPCRはDNA検出に広く使用されている技術です。
- 従来の方法は時間がかかり、エラーが発生しやすいです。
- 準備プロセスを最適化することで効率を高めることができます。
- qPCRの準備において、視覚的な品質管理が重要です。
研究の目的
- qPCR反応の準備プロセスを合理化する。
- 品質と一貫性を確保する手法を示す。
- 長期間保存できるプロトコルを提供する。
使用した方法
- qPCR反応用のメレチトース溶液の準備。
- ヌクレアーゼフリー水中でのメレチトースの渦巻きと溶解。
- 視覚的な検査による品質管理。
- 調製した溶液の管理温度での保存。
主な結果
- 即座に使用できるqPCR反応の成功的な生産。
- qPCR実行を開始するために必要な時間と手順の削減。
- 準備におけるオペレーターのエラーの可能性の減少。
- 準備した反応の長期保存を可能にするプロトコル。
結論
- ゲル化プロトコルはqPCR準備の効率を向上させます。
- 品質管理措置はプロセスに不可欠です。
- この方法は、完全に最適化された任意のqPCRに適用可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Gelification of qPCR master mix enables production of ready-to-use reactions that reduce setup time and minimize operator error in routine pathogen detection workflows. This approach supports scalable, quality-controlled reagent preparation for high-throughput screening applications in infectious disease research and diagnostic assay development. By stabilizing reactions for extended storage, the method enhances reproducibility and reduces variability in target detection across discovery and translational pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables consistent detection of low-abundance DNA targets such as T. cruzi satellite DNA, supporting therapeutic hypothesis interrogation in parasite research.
- Operational Value: Reduces reagent preparation steps, decreasing hands-on time and variability in early-stage target validation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized qPCR reactions with visual quality control, ensuring reliable amplification for pathogen detection assays.
- Operational Value: Allows batch production of gelified reactions, improving throughput and reducing errors in reagent dispensing for 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuous monitoring of pathogen load in preclinical models through stable, long-term storage of detection reagents.
- Operational Value: Enables reuse of validated qPCR formats across study phases, maintaining assay consistency from discovery to translational validation.
Pipeline & Workflow Integration
The gelification method integrates into discovery workflows by providing a stable, pre-aliquoted qPCR format that reduces technical variability in nucleic acid detection assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through reliable detection of pathogen DNA in complex biological samples.
- Screening: Enhances assay readiness by eliminating daily master mix preparation and reducing pipetting errors.
- Analytics: Generates quantitative Ct values for comparing pathogen burden across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates longitudinal monitoring in disease models through reagent stability and consistent performance.
- Enterprise Reuse: Creates a platform-ready qPCR format applicable to multiple targets beyond T. cruzi, maximizing reagent utility across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target detection confidence by minimizing pre-analytical variables in qPCR workflows.
- Operational Value: Increases reagent preparation efficiency and reduces operator-dependent errors in high-volume settings.
- Strategic Value: Lowers technical failure risk in pathogen screening campaigns, supporting better resource allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted progression of infectious disease targets through reliable, reproducible detection data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR optimization and vacuum-based gelification techniques.
- Needs access to vacuum oven and heat-conductive support for proper gelation.
- Demands standardized training for visual quality control assessment of gelled reactions.
- Involves careful reagent volume calculation to avoid incomplete gelation due to residual water.
- Limited to nucleic acid detection applications where qPCR is already validated for the target organism.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Preparation of Stock Solutions and Gelification Mixture
2:53
Preparation of qPCR Master Mix, Gelification of the Reagents in the Reaction Vessels, and Gelified qPCR
4:22
Results: Ready to Use Gelified qPCR for Trypanosoma cruzi Epimastigotes DNA Detection
5:11
Conclusion
