蛍光タンパク質中のプロリン類似体によるプロリンの残基特異的交換:骨格の「分子手術」が折り畳みと安定性にどのように影響するか

ほとんどの場合、従来の部位特異的変異誘発は、タンパク質におけるプロリンの機能的役割を研究するのには適切ではない。ここでは、プロリン類似体を非正準アミノ酸としてリボソーム合成タンパク質に組み込む方法を提示し、タンパク質の折り畳みと機能に対するプロリン残基の役割を調べる。標準アミノ酸によるプロリンの置換は危険なアプローチです。

プロリン類似体の組み込みは、一種の分子手術を可能にする。言い換えれば、タンパク質の性質に合理的に影響を与え、操作するために微妙な分子変化を導入する。プロリン残基はタンパク質足場の安定性に不可欠な役割を果たすため、我々の技術は、ヒトの特定の病理学的状態の根底にあるタンパク質フォールディング欠損の背後にある理由を理解するのに役立つ可能性がある。

プロリン置換によって誘導されるタンパク質変化は、酵素のバイオテクノロジー工学に影響を及ぼし、リボソームタンパク質の翻訳またはフォールディングの増強の機会を提供する。この方法は、特別な装置や高価な計装を必要としません。プロリン類似体を添加する前に、天然のプロリンが大腸菌培養物から枯渇するプロトコルステップには特別な注意が払われるべきである。

天然プロリンによる蛍光タンパク質の産生を開始するには、2リットルの三角フラスコに200ミリリットルの新鮮なNMM培地を2ミリリットルの一晩培養で接種する。細胞を摂氏37度で220RPMのオービタルシェーカーで約3.5時間インキュベートする。インキュベーション中、30分ごとに分光光度計で600ナノメートルでの光学密度を測定する。

光学濃度が0.7に達したら、細胞懸濁液をスピンダウンし、上清をゆっくりと老廃物にデカントします。次いで、アミノ酸を含まない50ミリリットルの氷冷NMMまたはプロリンを含まないNMMに再懸濁することによって細胞を洗浄する。細胞を再び回転させ、上清を廃棄物にデカントする。

次に、プロリンを含まない200ミリリットルのNMMに穏やかなピペッティングによって細胞ペレットを再懸濁し、2リットルの三角フラスコにアンピシリンを補充し、細胞をオービタルシェーカーで30分間インキュベートしてプロリンの完全な枯渇を可能にする。インキュベーション後、50ミリモルのストック溶液からL−プロリンまたはプロリン類似体のいずれかの適切な体積を加え、細胞懸濁液中の1ミリモルの最終濃度を得る。次に、1モルのストック溶液から500マイクロモルのIPTGを添加して目的タンパク質発現を誘導する。

目的タンパク質をオービタルシェーカーで摂氏37度で一晩発現させ、翌日に光学密度を測定する。遠心分離により菌体を回収し、上清を廃液にデカントする。次いで、10%グリセロールを含む50ミリリットルの結合緩衝液中で注意深くピペッティングすることによって細胞を洗浄する。

細胞を再び回転させ、上清をデカントし、さらに使用するまで、細胞ペレットをマイナス20度または80°Cの50ミリリットルチューブに保存する。蛍光発光を評価する前に、SDS-PAGEを実行してサンプル純度が95%以上であることを確認し、次に、各精製タンパク質変異体のサンプルを0.3マイクロモルの濃度に調整し、適切な波長で計算された吸光度値を基準として取る。おおよその最終サンプル量が 200 マイクロリットルであることを確認します。

希釈したサンプルを室温で平衡化させます。1時間後、サンプルを1センチメートルの石英キュベットに移し、蛍光分光計を用いてサンプルの蛍光発光スペクトルを測定する。変性を誘導するために、8.89モル尿素および5.56ミリモルDTTを含む18マイクロリットルの1.11X PBS緩衝液に2マイクロリットルの300マイクロモルサンプルを加えて、各タンパク質変異体のサンプルを20倍希釈する。

サンプルを摂氏95度で5分間インキュベートする。次いで、5ミリモルDTTを含むPBSを1,980マイクロリットル加えて100倍に希釈して再生を誘導し、直ちに200マイクロリットルのサンプルを1センチメートルの石英キュベットに移す。石英キュベットを適切な蛍光分析計に挿入し、30分間にわたって3秒ごとに蛍光スペクトルを取得してタンパク質のリフォールディングを監視します。

リフォールディングサンプルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、蓋を閉じ、EGFP変異体の完全なリフォールディングを可能にするために、室温で暗所にサンプルを保管する。24時間後、以前と同じ励起波長を用いてリフォールディングタンパク質サンプルの蛍光発光を測定し、蛍光回復の時間的エンドポイントを捕捉した。天然タンパク質を発現する細胞からのペレットおよびS-フルオロプロリンおよびデヒドロプロリンを有する変異体は、無傷の発色団のために典型的な明るい色を有していた。

対照的に、R-フルオロプロリンおよびジフルオロプロリンを含む変異体は無色のままであり、封入体における折り畳まれていないタンパク質のミスフォールディングおよび沈着を示す。SDS-PAGE解析により、不溶性R-フルオロプロリン含有タンパク質の存在が検証された。対照的に、天然タンパク質ならびにS−フルオロプロリンおよびデヒドロプロリン含有変異体が可溶性画分中に見出された。

液体クロマトグラフィー/質量分析分析では、プロリンをS-フルオロプロリンに置き換えると、プロリン残基あたり正の18ダルトンシフトが得られ、デヒドロプロリンで置換されると、残基あたり2ダルトンの負のシフトが生じた。光吸収スペクトルおよび発光スペクトルにおいて、発色団吸光度は、EGFPについて488ナノメートル、およびNowGFPについて493ナノメートルで見出された。KillerOrangeにおいて、発色団吸光度領域は、複雑な発色団の2つの可能な構成状態および電荷状態に対応する2つのバンドから構成されていた。

さらに、対応する最大吸光度波長での励起時に記録された蛍光スペクトルは、類似体が発色団の化学的環境を変化させなかったことを暗示していた。リフォールディング実験では、天然EGFP発色団蛍光は部分的に回復したが、トリプトファン特異的蛍光は再生後に大きかった。同様の挙動が、デヒドロプロリンを含有する変異体についても観察された。

EGFP含有S-フルオロプロリンでは、295ナノメートルの励起で同様の結果が観察されたが、蛍光は488ナノメートルではるかに高い程度に回復した。EGFP変異体のみが高速リフォールディング動態を示し、トリプトファン放出回復は発色団放出と比較して2倍速であった。適切な増殖培地を有する新鮮な細菌培養物を使用しなければならない。

無菌技術および培養増殖の定期的なモニタリングも、実験の成功のための重要な前提条件である。この方法は、他の標準的なアミノ酸の役割を研究することを可能にするので、タンパク質工学に適用可能である。このために、適切な栄養要求性大腸菌株およびアミノ酸類似体が必要とされる。

タンパク質全体の質量分析は、非正準アミノ酸類似体の取り込みを確認するための分析的証拠として必要である。プロリン類似体を組み込むためのSPI法は、タンパク質骨格を直接操作することを可能にし、リボソーム翻訳またはフォールディングのグローバルな安定化および改善を通じて、合理的な設計およびタンパク質の促進された生産のための利点を提供する。