Name: 蛍光タンパク質中のプロリン類似体によるプロリンの残基特異的交換:骨格の「分子手術」が折り畳みと安定性にどのように影響するか (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学ぶ、蛍光タンパク質へのプロリン類似体導入法により、プロリン残基がタンパク質の折り畳みと機能に与える影響を調査する手法です。分子手術による骨格の微細な改変により、タンパク質の安定性と特性を制御できます。

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この研究は、ドイツ研究財団(クラスター・オブ・エクセレンス「触媒における統一システム」)からT.F.とNBに、連邦教育科学省(BMBFプログラム「HSP 2020」、TU-WIMIplusプロジェクトSynTUBio)からF.-J.S.に支援されました。とT.M.T.T.

著者は、すべての利益相反を開示します。

自然界では、タンパク質の構造および機能を有する操作は、典型的には、突然変異、すなわちタンパク質配列中の特定の位置におけるアミノ酸同一性の交換をもたらす現象のために起こる。この自然なメカニズムは、突然変異誘発の形でタンパク質工学のバイオテクノロジー的方法として広く適用されており、プロセスに関与する20の正準アミノ酸のレパートリーに依存しています。しかし、プロリン残基の交換は問題である。その特殊な骨格グループアーキテクチャのために、置換72のための残りの19残基とはほとんど交換できない。例えば、プロリンは、最も一般的な二次構造、すなわちαヘリックスおよびβ鎖との適合性が悪いため、ポリペプチド配列における二次構造ブレーカーとして典型的に知られている。このプロリンの特徴は、残基が共通のレパートリーから別のアミノ酸に変異すると容易に失われる。プロリンをその化学的類似体で置き換えることは、その特定の立体配座遷移にバイアスを課したり、分子体積および極性の変調を生じさせながら、親プロリン残基の基本的な骨格特徴を維持することを可能にする代替アプローチを提供する。例えば、ヒドロキシ−、フルオロ−、アルキル−、デヒドロプロリン、可変環サイズおよびそれ以上を有する構造などの類似体構造を有する細菌培養物を供給することができ、したがって、特定のプロリン残基変化を含むタンパク質の産生を容易にする。
この研究で記載された選択圧取り込み(SPI)法は、標的タンパク質中のすべてのプロリンを関連する化学的類似体でグローバルに、すなわち残基特異的に置換することを可能にする。この方法の重要性は、SPIが一般的な突然変異誘発技術ではアクセスできない配列変化を作り出すことを可能にするという事実によって反映される。例えば、この研究で実証されているように、典型的には1つまたは2つの原子置換/欠失/付加を超えないかなり小さな構造変化を含む標的タンパク質の産生を可能にする。このようなタンパク質修飾は、「原子変異」73,74と呼ばれる。GFPのような蛍光タンパク質において、この分子侵入の結果は、フォールディングの速度、局所極性、タンパク質パッキング、関与する構造的特徴の安定性に見ることができる。吸光度および蛍光特性の変化は、タンパク質の折り畳みおよび残基微小環境への影響のために間接的に生じる。SPIによって行われる分子変化の精度は、プロリンの他の正準残基への変異と比較して、典型的にははるかに高く、後者は典型的にはタンパク質の折り畳み、産生、および単離に有害である。
製造方法として、SPIアプローチは、天然アミノ酸の化学的類似体に対するアミノアシル−tRNA合成酵素ポケットの基質耐性を使用する。合成酵素はアミノ酸構造の正しい同定を担当し、タンパク質への取り込みは翻訳プロセスの下流で行われます。装置的には、SPIにおけるタンパク質産生、単離、および精製は、他の組換えタンパク質発現技術に典型的な方法で行われる。しかし、以下のようにプロトコルにいくつかの追加があります:置換のためにバインドされているプロリンは、細胞が成長し、それらの無傷の細胞機構を発達させることができるように、発酵プロセスの開始時に提供される。しかしながら、細胞培養は、最大光学濃度に達することを許されず、細胞をタンパク質発現に最適な対数段階に保つ。この時点で、SPI方式には2つの大きなバリエーションがあります。最初のものでは、プロリンの濃度は、プロリンの枯渇が外部からの侵入なしに起こるように、初期増殖培地(化学的に定義された培地)において調整される。細胞は、対数増殖期を出る前に培地中のプロリンを排出し、続いて類似体を添加し、目的のタンパク質産生を誘導する。本方法の第2バージョンでは、細胞は、それらの対数段階の途中までプロリンを含む培地中で増殖される。この時点で、細胞を取り出し、プロリンをもはや含まず、類似体のみを含む別の培地に物理的に移し、その後に目的のタンパク質を誘導すべきである。両方のバージョンにおいて、類似体およびタンパク質誘導試薬は、予め増殖した細胞に提供される。野生型タンパク質の単離精製は、変異体の場合と同様に行われる。原則として、利用可能なすべての栄養要求性株を発現宿主として使用することができる。それにもかかわらず、最も適切な宿主を特定するための発現試験が推奨される。また、異なる化学的に定義された培地の試験を使用して、タンパク質収量を最適化することができます。
SPIのために考慮する必要がある化学類似体に関して、溶解度および濃度などの特定の要件がある。アミノ酸の代謝利用可能性および取り込みは、培地中に溶解した分子の数に依存する。特定の化合物の溶解度を高めるために、微酸性またはアルカリ性の条件が選択され得る。人工分子はそれらの細胞毒性のために増殖阻害効果を引き起こし得るので、細胞ストレスを避けるために濃度を最小に下げるべきである75。
SPIの小さな弱点は、交換する必要があるポジションの数が増えたことで、法人化効率が低下することです。原理的には、部位特異的変異誘発法による標的生体分子内のアミノ酸頻度の低下は、この問題を解決することができる。しかしながら、所望のタンパク質の構造的および機能的特性は、一次構造を変更することによって影響を受ける可能性がある。
前述のように、SPIは、正準アミノ酸の残基特異的置換を可能にする。これは、非正準アミノ酸が、タンパク質の機能またはフォールディングに不可欠な保存残基を含む、標的タンパク質内の正準アミノ酸のあらゆる位置に挿入されることを意味する。サイト固有の組み込みのための代替方法は、この問題を克服する唯一の可能性です3。過去数十年間、事前定義された部位に修飾残基を含むタンパク質を産生することができる直交対法が開発されてきた。この方法の最も一般的な改変は、終止コドン抑制として知られている。この方法は、合成アミノ酸76の部位特異的取り込み専用の工学的直交翻訳システムに基づいている。異なる側鎖修飾を有する200以上のアミノ酸が、このアプローチを用いて今日までタンパク質に組み込まれている77。しかしながら、これらの翻訳系は、標的タンパク質へのプロリン類似体の挿入にはまだ適していない。さらに、アミノアシル-tRNA合成酵素のバックグラウンド乱交性は、典型的には、操作された翻訳系に残っているため、軽微なアミノ酸改変の場合、この方法の性能は低いと考えられる。
SPIを用いて、我々は多数のβバレル蛍光タンパク質変異体を作製し、プロリンとその非天然類似体との交換の結果を研究した。R-FrpおよびDfpによるプロリン置換の場合、発現宿主によって機能不全タンパク質が産生された。この効果は、タンパク質のミスフォールディングによって生成される可能性が高い。後者は、R−Flpによって促進されるC4−エキソ立体構造に由来する可能性があり、これは親タンパク質構造27によって好まれない。Dfpでは、ミスフォールディングは、プロリン残基27におけるトランス・ツーシスペプチド結合異性化の速度の低下によって生じる可能性が高い。後者は、βバレル形成およびその後の発色団成熟に影響を及ぼすタンパク質フォールディングの速度論的プロファイルにおける制限ステップの1つであることが知られている。実際、R-FrpおよびDfpの両方のアミノ酸について、タンパク質産生は凝集した不溶性タンパク質をもたらした。その結果、発色団形成は起こらず、蛍光は完全に消失した。しかし、S-FldpおよびDhpでは、適切なタンパク質成熟が観察され、その結果、各アナログ/タンパク質の組み合わせについて蛍光タンパク質サンプルが得られた。タンパク質の吸光度および蛍光特徴のいくつかの変調にもかかわらず、これらは野生型タンパク質のものと大部分が類似したままであった。アミノ酸置換の効果は、リフォールディング動態研究において明らかにされた。モデル研究は、この残基がトランス・ツー・シスアミド回転速度にいくらかの改善をもたらし、C4-endo立体配座の形成につながる可能性があることを示している。これらの因子はいずれも、EGFPにおけるこの残基の有益な動態学的効果に寄与する可能性が高い。対照的に、Dhpは親タンパク質と最大に類似した動態フォールディングプロファイルを産生した。調査された蛍光タンパク質における単なる原子変異によって生じる結果の多様性は、標的タンパク質の特性を変化させるSPI製造方法の可能性を示している。類似体とのプロリン置換によって誘導されるタンパク質変化は、酵素78、79、80およびイオンチャネル81、82の工学、ならびにタンパク質安定性の一般的な工学においてさらなる意味合いを有する。
SPI法の基本的な制限は、プロリンが関連する類似体と存在する交換におけるその「オールオアノン」モードである。どのプロリン残基を類似体で置換すべきか、どの残基を改変しないままにしておくべきかを正確に選択できることは大きな利点となる。しかしながら、微生物生産宿主を用いてこのような高度な生産を行うことができる技術は存在しないのが現状である。タンパク質83、84の化学合成、ならびに無細胞産生85、86は、位置特異的プロリン修飾を産生することができる2つの代替方法である。それにもかかわらず、それらの操作の複雑さと低い生産収率は、生細胞での生産と比較して劣っています。現在のところ、SPIは、原子変異を有する複雑なタンパク質を製造するための最も操作上簡単で堅牢なアプローチのままである。非天然アミノ酸代替物を導入することにより、プロリン置換体によって生成される蛍光タンパク質のフォールディングおよび光吸収/発光の変化によってここに例示されるように、標的化された方法でタンパク質の特徴を改変することを可能にする。

古典的な部位特異的突然変異誘発は、DNAレベルでのコドン操作による既存の遺伝子コードタンパク質配列の順列を可能にする。タンパク質の折り畳みと安定性を研究するためには、類似のアミノ酸を類似の対応物で置き換えることが望ましいことがよくあります。しかし、従来のタンパク質突然変異誘発は、標準的な遺伝暗号レパートリーに存在するSer/Ala/Cys、Thr/Val、Glu/Gln、Asp/Asn、Tyr/Pheなどの正準アミノ酸間の構造的に類似した置換に確実に制限されている。一方、Trp、Met、His、Proなどの他の正準アミノ酸にはそのような可能性はなく、タンパク質1においてしばしば必須の構造的および機能的役割を果たす。タンパク質の高度に特異的な内部構造とその折り畳みプロセスの文脈でこれらの相互作用を研究するための理想的なアプローチは、無停止のアイソステリック修飾を生成することです。実際、非正準アミノ酸(ncAAs)としても知られるこれらの正準アミノ酸のアイソステリックアミノ酸類似体がタンパク質に挿入されると、「原子変異」として知られるH/F、CH2/S/Se/Teなどの単一原子または原子団のレベルでも微妙な変化が可能になる2。このような「分子手術」は、単一の原子または原子群の交換のみから生じる特性を有する改変タンパク質を生成し、好都合な場合には分析することができ、検出された変化を合理化することができる。このようにして、タンパク質の折り畳みと構造を研究するためのタンパク質合成の範囲は、古典的なDNA突然変異誘発をはるかに超えて拡張されます。部位特異的変異誘発によって生成されたタンパク質は通常「変異体」と呼ばれるが、正規のアミノ酸を置換したタンパク質は「変異体」3、「アロタンパク質」4、または「タンパク質同族体」5と呼ばれる。
緑色蛍光タンパク質(GFP)は、海洋生物Aequorea victoriaで最初に同定され、紫外から青色への光6,7にさらされると明るい緑色蛍光を示す。今日、GFPは、蛍光顕微鏡による細胞内の遺伝子発現およびタンパク質局在の日常的な視覚化のための高感度標識ツールとして一般的に使用されている。GFPはまた、様々な生物物理学的8、9、10および生物医学的11,12の研究、ならびにタンパク質工学13、14、15において有用であることが証明されている。GFP構造の厳密な解析により、様々な安定性および蛍光極大を特徴とする多数の変異体の作製が可能となった16,17。細胞生物学および分子生物学で使用されるGFP変異体のほとんどは、溶液中および結晶中の単量体タンパク質である18。それらの主要な構造組織は、系統学的起源とは無関係にGFPファミリーのすべてのメンバーにとって典型的であり、いわゆるβバレルを形成する11本のβ鎖から成り、一方、ねじれたαらせんがバレルの中心を通って走り、発色団を帯びている(図1A)。発色団の自己触媒的成熟(図1B)には、それを取り囲む側鎖をタンパク質の中心位置に正確に配置する必要があります。これらの側鎖の多くは、他のGFP変異体19において高度に保存されている。Aequorea victoriaなどのクラゲ由来のほとんどの蛍光タンパク質では、緑色発光発色団は、Tyr66のフェノール環とイミダゾリノンの5員複素環構造を含む2つの芳香環で構成されています(図1B)。発色団は、タンパク質マトリックスに適切に埋め込まれると、タンパク質全体の特徴的な蛍光の原因となります。これは、構造体の中央に位置し、一方、バレル構造は、水性媒体20からそれを絶縁する。発色団のバルク水への曝露は、蛍光消光、すなわち蛍光21の損失をもたらすであろう。
バレル様構造の適切な折り畳みは、蛍光消光22から発色団を保護するために不可欠である。プロリン(Pro)残基は、GFP23の構造組織において特別な役割を果たす。β鎖をサポートできないため、それらはタンパク質構造全体を維持する責任がある連結ループを構成する。驚くことではないが、10〜15個のプロリン残基が 、Aequorea-および Anthoathecata由来GFPsの両方に見られる。それらのいくつかは、他のタイプの蛍光βバレルタンパク質において高度に保存されている。プロリンは、その独特の幾何学的特徴のために折り畳み特性に重大な影響を与えることが期待されています。例えば、 エクオレア由来GFPsでは、10個のプロリン残基のうち(図2A)、9個の トランス型および1個のみが シス型ペプチド結合を形成する(Pro89)。Pro58は必須であり、すなわち、残りの19個の正準アミノ酸と交換可能ではない。この残基は、Trp57残基の正しい位置決めの原因である可能性があり、これは発色団成熟および全体的なGFPフォールディング24に重要であることが報告されている。3つのプロリン残基(Pro54、Pro56、Pro58)およびTrp57を有するフラグメントPVPWPは、 図1AからのGFP構造における「下蓋」の本質的な部分である。PVPWP構造モチーフは、シトクロムおよび真核生物の電位活性化カリウムチャネル25などのいくつかのタンパク質に見られる。位置75および89におけるプロリンからアラニンへの置換もまた、タンパク質発現およびフォールディングに有害であり、発色団成熟を消失させる。Pro75およびPro89は、発色団を埋め込む「上蓋」の一部であり(図1A)、11本鎖βバレル蛍光タンパク質23にわたって保存されている。これら2つの「蓋」は、安定な三次構造が部分的に破壊された場合でも、発色団を水性溶媒から除外しておく26。このような特定の分子構造は、例えば、水、酸素、または他の拡散性リガンドによる衝突(動的)蛍光消光から蛍光色素を保護する。
GFP構造の分子工学を行うためには、タンパク質の一次構造にアミノ酸置換を導入する必要があります。GFPに対して多数の変異が行われており、高い安定性、高速で信頼性の高いフォールディング、および可変蛍光特性を有する変異体が提供されている17。それにもかかわらず、ほとんどの場合、プロリン残基の変異は、残りの19個の正準アミノ酸のいずれもプロリン残基27の立体構造プロファイルを適切に復元することができないという事実のために、危険なアプローチと考えられる。したがって、プロリン残基が、プロリン類似体28と呼ばれる他のプロリンベースの構造と置換される代替アプローチが開発されている。そのユニークな環状化学構造のために、プロリンは2つの特徴的な立体構造遷移を示す(図1C):1)主にφねじり角に影響を与える骨格の組織を伴う速いプロセスであるプロリンリングパッカリング、および2)ペプチド結合シス/トランス異性化、ωねじり角を介して骨格折り畳みに影響を与える遅いプロセス。その遅い性質のために、後者の遷移は、一般に、タンパク質全体の折り畳み過程における律速ステップの原因である。いくつかのプロリン残基の周りのペプチド結合シス/トランス異性化は、GFP変異体の折り畳みにおける遅いステップを特徴とすることが以前に示されている。例えば、Pro89におけるシス-ペプチド結合の形成は、トランスからシス29への結合遷移に依存するため、フォールディングの過程における遅いステップを特徴とする。Pro89を全トランスペプチドループで置換した後、すなわちシス-トランス異性化イベント30を廃止することによって、より速いリフォールディングを達成することができる。シス/トランス異性化に加えて、パッカー転移はまた、タンパク質内部27,31内の骨格組織およびパッキングに起因するタンパク質折り畳みの深い変化を生じ得る。
化学修飾は、プロリン残基の固有の立体構造遷移の変化をもたらし、それによってタンパク質のフォールディング能力に影響を及ぼす。特定のプロリン類似体は、折り畳み特性の操作および研究を可能にするため、タンパク質におけるプロリン置換の特に魅力的な候補である。例えば、(4R)-フルオロプロリン(R-Flp)、(4S)-フルオロプロリン(S-Flp)、4,4-ジフルオロプロリン(Dfp)、および3,4-デヒドロプロリン(Dhp)は、分子体積および極性32の点でプロリンと最小限に異なる4つの類似体(図1D)である。同時に、各アナログは別個のリングパッカーを示す:S−FrpはC4エンドパッカーを安定化させ、R−FrpはC4−エキソパッカーを安定化させ、Dfpは明らかなパッカー選好を示さず、一方Dhpはパッカリングを消失させる(図1D)33。タンパク質構造においてこれらの類似体を使用することによって、プロリン残基の立体構造遷移を操作することができ、そしてこれを用いて、得られるGFP変異体の特性に影響を及ぼす。
この研究では、選択圧取り込み法(SPI、図3)34を用いて、指定されたプロリン類似体のセット(図1D)をGFP変異体の構造に組み込むことに着手しました。アミノ酸残基をそれらの最も近い等構造類似体で置換することは、タンパク質設計35,36において応用されたバイオテクノロジーの概念である。したがって、モデルタンパク質におけるプロリン類似体の効果は、タンパク質工学37においてツールとして役立つそれらの可能性を示す。所望の類似体を含むタンパク質の産生は、プロリン(プロリン・要求性)を産生することができない改変大腸菌株において行った。したがって、それらは、タンパク質生合成38の過程において基質の置換を受け入れることを余儀なくされ得る。プロリンのこのグローバルな置換は、tRNAと適切なアミノ酸40とのエステル化を触媒する重要な酵素である内因性アミノアシルtRNA合成酵素39の天然基質柔軟性によって可能になる。一般に、図3に概説されるように、細胞増殖は、中間対数増殖段階に達するまで、定義された培地中で行われる。次のステップでは、置換されるアミノ酸は、発酵中に発現系から細胞内で枯渇し、続いて所望の類似体またはncAAによって交換される。次いで、標的タンパク質発現は、残基特異的非正準アミノ酸取り込みのために誘導される。同族アミノ酸とその類似体との置換は、プロテオーム全体の方法で起こる。この副作用は宿主株の増殖に悪影響を及ぼす可能性があるが、標的タンパク質産生の質はほとんど影響を受けず、なぜなら、組換え発現において、細胞資源は主に標的タンパク質41、42の生産に向けられるからである。したがって、厳密に調節された誘導性発現系および強力なプロモーターは、高い取り込み効率43にとって極めて重要である。我々のアプローチは、センスコドンに応答したncAAの複数残基特異的組み込み(センスコドン再割り当て)に基づいており、それによって、標的遺伝子内で、Proアナログ挿入のための位置の数を部位特異的変異誘発を介して操作することができる44。同様のアプローチが、抗菌特性を有する組換えペプチドの調製に関する我々の以前の報告においても適用された45。本研究では、すべてのプロリン残基を関連類似体に置換するSPI法を適用し、標準的なアミノ酸レパートリーで合成されたタンパク質には存在しない明確な物理化学的性質を有すると期待されるタンパク質を作製した。得られた変異体のフォールディングおよび蛍光プロファイルを特徴付けることによって、GFPの変異体における原子置換の効果を示すことを目指している。

<table><tbody><tr><td>LC-MS、83642 LC-MS グレード用</td><td>アセトニトリル</td><td>VWR</td> HiPerSolv CHROMANORM ULTRA <td>必要な</td></tr><tr><td>アクリルアミドとビスアクリルアミド水溶液 37.5:1 (ROTIPHORESE Gel 30)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>Carl Roth</td><td>5210</td><td></td></tr><tr><td>モリブデン酸アンモニウム ((NH4)2MoO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>277908</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシ二硫酸アンモニウム (APS)</td><td>カール・ロス</td><td>9592.2</td><td>&ge;98%、年率、ACSグレードが必要硫酸</td></tr><tr><td>アンモニウム((NH4)2SO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Carl Roth</td><td>K029</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム(CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brillant Blue R 250</td><td>Carl Roth</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅 (CuSO4)</td><td>Carl Roth</td><td>CP86.1</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Carl Roth</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ビス-(ジメチルアミノ)-エタン、&nbsp;N、N、N'、N'-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)</td><td>カールロス</td><td>2367.3</td><td>&ge;電気泳動用 99 %, p.a.,</td></tr><tr><td>1,4-ジチオスレイトール (DTT)</td><td>カール・ロス</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン (DCM)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二カリウム水素 (K2HPO4)</td><td>カール・ロス</td><td>P749.1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム (Na2HPO4)</td><td>カール・ロス</td><td>X987</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50WX8-100 (水素形態)</td><td>Acros Organics / Thermo Fisher Scientific(ウォルサム、アメリカ)</td><td>10731181</td><td>陽イオン交換樹脂</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>カール・ロス</td><td>9065.1</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>VWR</td><td>HiPerSolv CHROMANORM LC-MS用、84865</td><td>LC-MSグレードが必要</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>カール・ロス</td><td>3738.5</td><td>100 %, p. a.</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>カールロス</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>カールロス</td><td>X998</td><td></td></tr><tr><td>水素クロロイド (HCl)</td><td>メルク</td><td>295426</td><td></td></tr><tr><td>塩化鉄(II) (FeCl<サブ>2</サブ>)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>380024</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>カールロス</td><td>AE73.1</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &beta;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.1</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム (MgSO4)</td><td>Carl Roth</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>塩化マンガン (MnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63535</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>カール・ロス</td><td>4227.3</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 未染色タンパク質ラダー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>26614</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td> <td>カール・ロス</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>カール ロス</td><td>7156</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>カール ロス</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム (NaH2PO4)</td><td>カール ロス</td><td>T879</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (NaC12H25SO4)</td><td>カール ロス</td><td>0183</td><td></td></tr><tr><td>チアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩酸塩 (Tris-HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>トリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン (トリス)</td><td>カールロス</td><td>5429</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>カールロス</td><td>8952</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>カールロス</td><td>2363</td><td></td></tr><tr><td>塩化亜鉛 (ZnCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>229997</td><td></td></tr><tr><td>L-アラニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-アルギニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8381<</td><td></td></tr><tr><td>EM>L-アスパラギン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2128</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-isoleucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-プロリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-セリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-threonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-トリプトファン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-チロシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-バリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>(4S)-フルオロプロリン</td><td></td><td>Bachem 4033274</td><td>すべてのプロリン類似体がプロリンを含まないことを確認し、内容を確認してください。それ以外の場合は、発現中にプロリン汚染を消費するステップを含めます。</td></tr><tr><td>(4R)-フルオロプロリン</td><td>Bachem</td><td>4033275</td><td>すべてのプロリン類似体がプロリンフリーであることを確認し、内容を確認してください。それ以外の場合は、発現中にプロリン汚染を消費するステップを含めます</td></tr><tr><td>3,4-デヒドロプロリン</td><td>Bachem</td><td>4003545</td><td>すべてのプロリン類似体がプロリンを含まないことを確認し、内容を確認してください。それ以外の場合は、発現中にプロリン汚染を消費するステップを含めます</td></tr><tr><td>4,4-ジフルオロプロリン</td><td>エナミン</td><td>EN400-17448</td><td>すべてのプロリン類似体がプロリンを含まないことを確認し、内容を確認してください。それ以外の場合は、発現中にプロリン汚染を消費するステップが含まれます</td></tr><tr><td>コニカルポリスチレン(ファルコン)チューブ、15 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>コニカルポリスチレン(ファルコン)チューブ、50 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>透析メンブレン、分子量カットオフ (MWCO) 5,000</td><td>スペクトラム メディカルインダストリーズ</td><td>スペクトラ/POR MWCO 5000 透析メンブレン、133198</td><td></td></tr><tr><td>固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)カラム 1 mL、Ni-NTA</td><td>GE Healthcare</td><td>HisTrap HP、1 mL、17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ、5 mL</td><td>Carl Roth</td><td>EP96.1</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ、20 mL</td><td>Carl Roth</td><td>T550.1</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ、50 mL</td><td>Carl Roth</td><td>T552.1</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ、1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>シャーレ(ポリスチレン、滅菌)</td><td>カール・ロス</td><td>TA19</td><td></td></tr><tr><td>pQE-80L プラスミド ベクター</td><td>Qiagen</td><td>no</td> available <td>by N-terminus pQE ベクター セット カタログ番号/ID: 32915</td></tr><tr><td>補助栄養性 大腸菌 株 JM83</td><td>Addgene</td><td>50348</td><td>https://www.addgene.org/50348/</td></tr> <tr><td>補助栄養性 大腸菌/em<> JM83</td><td>ATCC</td><td>35607</td><td></td></tr><tr><td>丸底ポリスチレンチューブ、14 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>Corning Falcon、14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター 0.45 &micro;ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン付き</td><td>Carl Roth</td><td>CCY1.1</td><td></td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィー (HPLC) カラム LC-ESI-TOF-MS</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>Supelco Discovery BIO ワイドポア C5 HPLC カラム、3 &micro;m 粒子径、10 cm x 2.1 mm</td>、<td>円錐形の0.1 mLガラスインサート、スクリューキャップ、セプタ</td></tr>ム<tr><td>HPLCオートサンプラーバイアル1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Supelco</td> 854165 <td></td></tr><tr><td>LC-ESI-TOF-MS用質量分析計</td><td>Agilent Agilent</td><td>6530 Accurate-Mass QOF</td><td></td></tr><tr><td>質量分析データ解析ソフトウェア</td><td>Agilent</td><td>MassHunter 定性分析ソフトウェア v. B.06.00</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf チューブ用卓上遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5427 R</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon チューブ用冷却遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td><td>GE Healthcare</td><td>&Auml;KTA純粋な25 L</td><td></td></tr><tr><td>蛍光分光計</td><td>Perkin Elmer</td><td>LS 55</td><td></td></tr><tr><td>細菌細胞破壊のための高圧マイクロ流体化器</td><td>マイクロ流体LM</td><td>シリーズ "Z&rdquo;タイプチャンバー</td><td></td></tr><tr><td>細菌培養用オービタルシェーカー</td><td>Infors HT</td><td>Minitron</td><td></td></tr><tr><td>液体クロマトグラフィー用蠕動ポンプ(LC)GE</td> <td>Healthcare</td><td>P-1</td><td></td></tr><tr><td>細菌細胞破壊用超音波ホモジナイザー</td><td>Omnilab</td><td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td><td>MS72 ソニファイアチップ付き</td></tr><tr><td>UV-Vis分光光度計</td><td>Biochrom</td><td>ULTROSPEC 2100</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS/NIR(可視/近赤外)分光光度計</td><td>Perkin Elmer</td><td>LAMBDA 950 UV/VIS/NIR(可視/近赤外)</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光タンパク質中のプロリン類似体によるプロリンの残基特異的交換:骨格の「分子手術」が折り畳みと安定性にどのように影響するか

Residue-Specific Exchange of Proline by Proline Analogs in Fluorescent Proteins: How "Molecular Surgery" of the Backbone Affects Folding and Stability

残りの19個の正準アミノ酸のいずれかによる従来の部位特異的変異誘発によるタンパク質中のプロリン(Pro)残基の置換は、しばしばタンパク質のフォールディング、特に緑色蛍光タンパク質および関連変異体における発色団成熟に有害である。合理的な代替法は、 全ての Pro残基が類似体によって 残基特異的 に置換されるようにタンパク質の翻訳を操作することであり、これは選択圧取り込み(SPI)として知られる方法である。内蔵の化学修飾は、測定可能な変化を細かく解剖したり、さまざまなタンパク質特性を合理的に操作したりするための一種の「分子手術」として使用できます。ここで、この研究は、緑色蛍光タンパク質(GFP)のスペクトル変異体の典型的なβバレル構造の組織におけるプロリンの役割を研究するためのSPI法の有用性を実証しています:それらの配列中に10〜15個のプロリン:増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)、NowGFP、およびKillerOrange。プロ残基は、個々のβ鎖間の連結切片に存在し、バレル足場の閉鎖蓋を構成し、したがって、発色団を水から絶縁する、すなわち蛍光特性を担う。(4R)-フルオロプロリン(R-Flp)、(4S)-フルオロプロリン(S-Flp)、4,4-ジフルオロプロリン(Dfp)、および3,4-デヒドロプロリン(Dhp)を用いた選択圧取り込み実験を、プロリン-栄養要求性 大腸菌 株を発現宿主として用いて行った。我々は、S-FldpおよびDhpを有する蛍光タンパク質が活性(すなわち、蛍光性)であるのに対し、他の2つの類似体(DfpおよびR-Flp)は機能不全のミスフォールディングタンパク質を産生することを見出した。UV-Vis吸収および蛍光発光プロファイルの検査では、Pro類似体を含むタンパク質に特徴的な変化はほとんど見られませんでした。EGFP変異体におけるフォールディング動態プロファイルの検討は、S-Flpの存在下での加速リフォールディングプロセスを示したが、このプロセスはDhpを含むタンパク質における野生型と類似していた。この研究は、SPI法がタンパク質残基の微妙な修飾を原子レベルで(「分子手術」)生成する能力を示しており、これは関心のある他のタンパク質の研究に採用することができる。これは、βバレル蛍光タンパク質のクラスにおける折り畳みおよび分光特性に関する密接な化学的類似体によるプロリン置換の結果を示す。

古典的な部位特異的突然変異誘発の限界を克服するために、特定の修飾を有するプロリン類似体をいくつかの蛍光タンパク質に組み込んだ。我々は、水素をフッ素で置換するか、またはプロリン残基中の二重結合による単置換(「分子手術」)が、その折り畳みおよび光との相互作用を含む基本的なタンパク質特性にどのように影響するかを示す。

Replacement of proline (Pro) residues in proteins by the traditional site-directed mutagenesis by any of the remaining 19 canonical amino acids is often ...

ほとんどの場合、従来の部位特異的変異誘発は、タンパク質におけるプロリンの機能的役割を研究するのには適切ではない。ここでは、プロリン類似体を非正準アミノ酸としてリボソーム合成タンパク質に組み込む方法を提示し、タンパク質の折り畳みと機能に対するプロリン残基の役割を調べる。標準アミノ酸によるプロリンの置換は危険なアプローチです。プロリン類似体の組み込みは、一種の分子手術を可能にする。言い換えれば、タンパク質の性質に合理的に影響を与え、操作するために微妙な分子変化を導入する。プロリン残基はタンパク質足場の安定性に不可欠な役割を果たすため、我々の技術は、ヒトの特定の病理学的状態の根底にあるタンパク質フォールディング欠損の背後にある理由を理解するのに役立つ可能性がある。プロリン置換によって誘導されるタンパク質変化は、酵素のバイオテクノロジー工学に影響を及ぼし、リボソームタンパク質の翻訳またはフォールディングの増強の機会を提供する。この方法は、特別な装置や高価な計装を必要としません。プロリン類似体を添加する前に、天然のプロリンが大腸菌培養物から枯渇するプロトコルステップには特別な注意が払われるべきである。天然プロリンによる蛍光タンパク質の産生を開始するには、2リットルの三角フラスコに200ミリリットルの新鮮なNMM培地を2ミリリットルの一晩培養で接種する。細胞を摂氏37度で220RPMのオービタルシェーカーで約3.5時間インキュベートする。インキュベーション中、30分ごとに分光光度計で600ナノメートルでの光学密度を測定する。光学濃度が0.7に達したら、細胞懸濁液をスピンダウンし、上清をゆっくりと老廃物にデカントします。次いで、アミノ酸を含まない50ミリリットルの氷冷NMMまたはプロリンを含まないNMMに再懸濁することによって細胞を洗浄する。細胞を再び回転させ、上清を廃棄物にデカントする。次に、プロリンを含まない200ミリリットルのNMMに穏やかなピペッティングによって細胞ペレットを再懸濁し、2リットルの三角フラスコにアンピシリンを補充し、細胞をオービタルシェーカーで30分間インキュベートしてプロリンの完全な枯渇を可能にする。インキュベーション後、50ミリモルのストック溶液からL−プロリンまたはプロリン類似体のいずれかの適切な体積を加え、細胞懸濁液中の1ミリモルの最終濃度を得る。次に、1モルのストック溶液から500マイクロモルのIPTGを添加して目的タンパク質発現を誘導する。目的タンパク質をオービタルシェーカーで摂氏37度で一晩発現させ、翌日に光学密度を測定する。遠心分離により菌体を回収し、上清を廃液にデカントする。次いで、10%グリセロールを含む50ミリリットルの結合緩衝液中で注意深くピペッティングすることによって細胞を洗浄する。細胞を再び回転させ、上清をデカントし、さらに使用するまで、細胞ペレットをマイナス20度または80°Cの50ミリリットルチューブに保存する。蛍光発光を評価する前に、SDS-PAGEを実行してサンプル純度が95%以上であることを確認し、次に、各精製タンパク質変異体のサンプルを0.3マイクロモルの濃度に調整し、適切な波長で計算された吸光度値を基準として取る。おおよその最終サンプル量が 200 マイクロリットルであることを確認します。希釈したサンプルを室温で平衡化させます。1時間後、サンプルを1センチメートルの石英キュベットに移し、蛍光分光計を用いてサンプルの蛍光発光スペクトルを測定する。変性を誘導するために、8.89モル尿素および5.56ミリモルDTTを含む18マイクロリットルの1.11X PBS緩衝液に2マイクロリットルの300マイクロモルサンプルを加えて、各タンパク質変異体のサンプルを20倍希釈する。サンプルを摂氏95度で5分間インキュベートする。次いで、5ミリモルDTTを含むPBSを1,980マイクロリットル加えて100倍に希釈して再生を誘導し、直ちに200マイクロリットルのサンプルを1センチメートルの石英キュベットに移す。石英キュベットを適切な蛍光分析計に挿入し、30分間にわたって3秒ごとに蛍光スペクトルを取得してタンパク質のリフォールディングを監視します。リフォールディングサンプルを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、蓋を閉じ、EGFP変異体の完全なリフォールディングを可能にするために、室温で暗所にサンプルを保管する。24時間後、以前と同じ励起波長を用いてリフォールディングタンパク質サンプルの蛍光発光を測定し、蛍光回復の時間的エンドポイントを捕捉した。天然タンパク質を発現する細胞からのペレットおよびS-フルオロプロリンおよびデヒドロプロリンを有する変異体は、無傷の発色団のために典型的な明るい色を有していた。対照的に、R-フルオロプロリンおよびジフルオロプロリンを含む変異体は無色のままであり、封入体における折り畳まれていないタンパク質のミスフォールディングおよび沈着を示す。SDS-PAGE解析により、不溶性R-フルオロプロリン含有タンパク質の存在が検証された。対照的に、天然タンパク質ならびにS−フルオロプロリンおよびデヒドロプロリン含有変異体が可溶性画分中に見出された。液体クロマトグラフィー/質量分析分析では、プロリンをS-フルオロプロリンに置き換えると、プロリン残基あたり正の18ダルトンシフトが得られ、デヒドロプロリンで置換されると、残基あたり2ダルトンの負のシフトが生じた。光吸収スペクトルおよび発光スペクトルにおいて、発色団吸光度は、EGFPについて488ナノメートル、およびNowGFPについて493ナノメートルで見出された。KillerOrangeにおいて、発色団吸光度領域は、複雑な発色団の2つの可能な構成状態および電荷状態に対応する2つのバンドから構成されていた。さらに、対応する最大吸光度波長での励起時に記録された蛍光スペクトルは、類似体が発色団の化学的環境を変化させなかったことを暗示していた。リフォールディング実験では、天然EGFP発色団蛍光は部分的に回復したが、トリプトファン特異的蛍光は再生後に大きかった。同様の挙動が、デヒドロプロリンを含有する変異体についても観察された。EGFP含有S-フルオロプロリンでは、295ナノメートルの励起で同様の結果が観察されたが、蛍光は488ナノメートルではるかに高い程度に回復した。EGFP変異体のみが高速リフォールディング動態を示し、トリプトファン放出回復は発色団放出と比較して2倍速であった。適切な増殖培地を有する新鮮な細菌培養物を使用しなければならない。無菌技術および培養増殖の定期的なモニタリングも、実験の成功のための重要な前提条件である。この方法は、他の標準的なアミノ酸の役割を研究することを可能にするので、タンパク質工学に適用可能である。このために、適切な栄養要求性大腸菌株およびアミノ酸類似体が必要とされる。タンパク質全体の質量分析は、非正準アミノ酸類似体の取り込みを確認するための分析的証拠として必要である。プロリン類似体を組み込むためのSPI法は、タンパク質骨格を直接操作することを可能にし、リボソーム翻訳またはフォールディングのグローバルな安定化および改善を通じて、合理的な設計およびタンパク質の促進された生産のための利点を提供する。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は単一細胞の蛍光を用いて立体構造変化の部位特異的解析と並んで膜タンパク質のイオン輸送の動態を測定する方法を説明します。この手法は、イオンチャネル、トランスポーター、イオンポンプに適応可能であり、タンパク質サブユニット間の距離の制約を決定するために利用することができます。...

膜タンパク質の構造動力学を調べるその場で部位特異的蛍光標識を持つ

ここでは私たちはドナーとアクセプターフルオロフォアサイト間のプロテアーゼ切断部位を導入する改良された発光共鳴エネルギー移動（LRET）方法を記載している。この修​​飾は、タンパク質精製せずに膜タンパク質の研究を可能にする、目的の膜タンパク質から生じる特定のLRET信号を得ることを可能にする。...

発光共鳴エネルギーは、哺乳動物細胞で発現膜タンパク質の立体構造変化を研究するために転送

コンセンサスモチーフに基づく合成タンパク質配列は、通常、相互作用依存性(IPD)を示唆する共進化残基を無視します。 IPDはアクティビティに不可欠であり、IPDを無視する設計は最適でない結果をもたらす可能性があります。...

合成タンパク質の最適化：中間物挿入依存関係の同定構造的インジケートおよび/または機能的に連結された残基

タンパク質相互作用は、細胞の機能の中心にあります。熱量分光技術は、一般に、それらを特徴付けるために使用されます。ここでは、Shwachman-ダイヤモンド症候群（SBDS）で変異タンパク質と伸長因子様1 GTPアーゼ（EFL1）間の相互作用を研究するためのツールとして蛍光異方性を説明します。...

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのツールとしての蛍光異方性

合成生物学は、非正規のアミノ酸の co-translational の挿入を使用して前例のないプロパティとタンパク質工学を可能です。ここでは、我々 は選択圧定款 (SPI) 経由のエシェリヒア属大腸菌の「ゴールド」蛍光タンパク質 (GdFP) と呼ばれる、蛍光分光特性を持つ型 GFP...

非正規のアミノ酸の選択圧による 'ゴールデン' 蛍光と質量分析法と蛍光タンパク質解析工学

この資料では、蛍光タンパク質凝集の効果と蛍光レポーターのコンテキストで新しく,...

酵母におけるポリグルタミン毒性の試金を使用して融合パートナーの蛍光タンパク質の効果

ここでは、タンパク質ポリマーを制御された配列で形成する酵素によってタンパク質モノマーを結合し、単一分子力分光研究のために表面に固定化するプロトコルを提示する。...

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

有機溶媒および水性溶媒の界面では、カスタマイズされた両親媒性エラスチン様タンパク質は、環境パラメータによって引き起こされる小胞、繊維、コアセルベートなどの複雑な上分子構造に組み立てられます。記載された組立プロトコルは、調整可能な特性を有するタンパク質膜ベースのコンパートメント(PMBC)を生成し、様々な貨物のカプセル化を可能にする。...

エブラスチン様タンパク質の定義された上膜構造とカーゴカプセル化への組み立て

この記事では、遺伝暗号拡大(GCE)部位特異的にサル モネラ 菌分泌エフェクターを標識し、直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)を使用してHeLa細胞内の分泌タンパク質の細胞内局在を画像化するための簡単で明確なプロトコルを提供します。...

遺伝暗号拡張を用いた細菌分泌タンパク質の超解像イメージング

ダイナミンスーパーファミリータンパク質の機能は、GTP加水分解と組み合わせたコンフォメーション変化に依存します。1分子FRET(smFRET)技術を用いて、異なるヌクレオチド負荷状態におけるダイナミン様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスをモニターするシステムについて記述します。...

Dynamin様GTPaseアトラスチンのコンフォメーションダイナミクスを観察するための1分子FRETイメージング

学ぶ、蛍光タンパク質へのプロリン類似体導入法により、プロリン残基がタンパク質の折り畳みと機能に与える影響を調査する手法です。分子手術による骨格の微細な改変により、タンパク質の安定性と特性を制御できます。

蛍光タンパク質中のプロリン類似体によるプロリンの残基特異的交換:骨格の「分子手術」が折り畳みと安定性にどのように影響するか

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