Name: カリネクテス・サピドゥスにおける神経ペプチドの多面的質量分析調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶ神経ペプチドの質量分析的手法をCallinectes sapidus脳組織に適用し、LC-ESI-MSとMALDI-MSイメージングで定量・局在解析を行う方法。ペプチド治療薬開発とバイオマーカー発見に貢献します。

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この研究は、米国国立科学財団(CHE-1710140およびCHE-2108223)および米国国立衛生研究所(NIH)の助成金R01DK071801を通じて支援されました。A.P.は、NIH化学生物学界面トレーニング助成金(T32 GM008505)によって部分的に支援されました。N.V.Q.は、国立心肺血液研究所からウィスコンシン大学マディソン心臓血管研究センター(T32 HL007936)へのルース・L・キルシュシュタイン国立研究サービス賞の下で、国立衛生研究所によって部分的に支援されました。L.L.は、NIHの助成金R56 MH110215、S10RR029531、S10OD025084、ならびにウィスコンシン同窓会研究財団とウィスコンシン大学マディソン薬学部が提供する資金援助を受けて、ヴィラス特別業績教授職とチャールズメルボルンジョンソン教授職からの資金援助を認めたいと思います。

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著者らは開示するものは何もありません。

神経系に見られる神経ペプチドおよび内因性ペプチドの正確な同定、定量、および局在化は、それらの機能を理解する上で極めて重要である23,24。質量分析は、完全に配列決定されたゲノムを持たない生物でも、これらすべてを達成できる強力な技術です。LC-ESI-およびMALDI-MSの組み合わせを介してC. sapidusから採取された組織から神経ペプチドを検出、定量、および局在化するこのプロトコルの能力が実証されている。
LC-ESI-MS分析のサンプル調製中に、考慮する必要があります。MSは高感度な技術ですが、ニューロン組織のペプチド濃度が低い(フェムトモル範囲25まで)ことは深刻な制限をもたらします。タンパク質や脂質などのより豊富で干渉的なマトリックス成分を除去するだけでなく、各ステップ26、27</s...

神経系は複雑であり、生物全体に信号を伝達するためにニューロンのネットワークを必要とする。神経系は感覚情報と生物学的反応を調整します。シグナル伝達に関与する複雑で複雑な相互作用は、神経伝達物質、ステロイド、および神経ペプチドなどの多くの異なるシグナル伝達分子を必要とする。神経ペプチドは、ストレスおよび他の刺激に対する生理学的応答を活性化する上で重要な役割を果たす最も多様で強力なシグナル伝達分子であるため、これらの生理学的プロセスにおけるそれらの特異的役割を決定することは興味深い。神経ペプチドの機能は、移動度、受容体相互作用、および親和性を決定するアミノ酸構造に関連しています1。神経ペプチドの構造と機能を調べるために、神経ペプチドが組織の異なる領域で合成、保存、放出され得るため重要である組織化学、および電気生理学などの技術が採用されてきた2,3,4が、これらの方法は、神経ペプチドの膨大な配列多様性を解明するためのスループットおよび特異性によって制限されている。
質量分析(MS)は、神経ペプチドの構造と存在量のハイスループット分析を可能にします。これは、さまざまなMS技術、最も一般的には液体クロマトグラフィー - エレクトロスプレーイオン化MS(LC-ESI-MS)5およびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化MS(MALDI-MS)6を介して行うことができる。高精度の質量測定とMSフラグメンテーションを利用して、MSは、先験的な知識なしに複雑な混合物からの神経ペプチドにアミノ酸配列および翻訳後修飾(PTM)ステータスを割り当てる能力を提供し、その機能を確認するのに役立ちます7,8。定性的な情報に加えて、MSは標識フリー定量(LFQ)または同位体または等圧標識などの標識ベースの方法を通じて神経ペプチドの定量情報を可能にします9。LFQの主な利点には、そのシンプルさ、分析の低コスト、サンプル損失を最小限に抑えることができるサンプル調製ステップの削減が含まれます。しかし、LFQの欠点は、実行ごとの変動性からの定量的誤差に対処するために複数の技術的反復を必要とするため、計測器の時間コストの増加です。これはまた、小さな変動を正確に定量化する能力の低下にもつながる。標識ベースの方法は、複数のサンプルをさまざまな安定同位体を使用して差動的に標識し、1つのサンプルに結合し、質量分析によって同時に分析できるため、系統的な変動が少なくなります。これによりスループットも向上しますが、同位体標識は合成や購入に時間とコストがかかる可能性があります。フルスキャンマススペクトル(MS1)スペクトルの複雑さも多重化が増加するにつれて増加し、断片化して同定することができるユニークな神経ペプチドの数が減少する。逆に、等圧標識はMS1レベルでスペクトルの複雑さを増大させませんが、神経ペプチドなどの低存在量の分析物には課題をもたらします。等圧定量はフラグメントイオン質量スペクトル(MS2)レベルで行われるため、より豊富なマトリックス成分がフラグメンテーションのために選択され得るので、存在量の低い神経ペプチドは定量することができず、選択されたものは定量されるのに十分な存在量を有しない可能性がある。同位体標識により、同定されたすべてのペプチドに対して定量を行うことができます。
同定および定量化に加えて、局在化情報は、MALDI−MSイメージング(MALDI−MSI)10を介してMSによって得ることができる。サンプル表面を横切ってレーザーをラスタリングすることにより、MSスペクトルを各 m/z 値のヒートマップ画像にコンパイルすることができます。条件全体にわたる異なる領域における一過性ニューロペプチドシグナル強度のマッピングは、機能決定のための貴重な情報を提供することができる11。神経ペプチドの局在化は、神経ペプチドの機能が位置12によって異なる可能性があるため、特に重要である。
神経ペプチドは、神経伝達物質などの他のシグナル伝達分子よりもインビボで存在量が少なく、したがって検出には高感度な方法が必要である13。これは、脂質11、14などのより存在量の多いマトリックス成分の除去によって達成することができる。神経ペプチドの分析のための追加の考慮事項は、主にほとんどのneuropeptidomic分析が酵素消化を省略しているため、一般的なプロテオミクスワークフローと比較すると、行う必要があります。これは、ほとんどがプロテオミクスデータとペプチド検出によって知らされたタンパク質一致に基づくアルゴリズムで構築されたため、神経ペプチドデータ分析のためのソフトウェアオプションを制限します。しかし、PEAKS15などの多くのソフトウェアは、de novoシーケンシング機能により、神経ペプチド分析に適しています。抽出法からMSデータ解析までの神経ペプチドの解析には、いくつかの要因を考慮する必要があります。
ここで説明するプロトコルには、LC-ESI-MS、MALDI-MS、およびMALDI-MSIによる神経ペプチドのサンプル調製およびジメチル同位体標識、データ取得、およびデータ分析のための方法が含まれる。いくつかの実験からの代表的な結果を通して、青いカニ、 カリネクテス・サピドゥスからの神経ペプチドを同定、定量、および局在化するこれらの方法の有用性および能力が実証される。神経系をよりよく理解するために、モデル系が一般的に使用される。多くの生物は、完全に配列決定されたゲノムを利用可能にしていないため、ペプチドレベルでの包括的な神経ペプチドの発見を妨げている。この課題を軽減するために、完全なゲノム情報を持たない生物のデータベースを生成するための新規神経ペプチドおよびトランスクリプトームマイニングを同定するためのプロトコルが含まれる。ここで提示されるすべてのプロトコールは、任意の種からの神経ペプチドサンプルに対して最適化することができ、また、任意の内因性ペプチドの分析に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>化学薬品、試薬、消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)マトリックス</td><td>Supelco</td><td>39319</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリルオプティマ LC/MSグレード</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A955-500</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>ボランピリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179752</td><td></td></tr><tr><td>Brukerペプチドキャリブレーションミックス</td><td>Bruker Daltonics</td><td>NC9846988</td><td></td></tr><tr><td>キャピ</td><td>ラリーPolymicro</td><td>1068150019</td><td>ナノフローカラム(75 &micro;m内径×360&マイクロ;m外径)</td></tr><tr><td>クライオスタットカップ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032</td>任意の<td>カップまたは金型は機能するはずです</td></tr><tr><td>&nbsp;マイクロ遠心チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>30108434</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド - D2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸 Optima LC/MS グレード</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Difco</td><td>214340</td><td>場所 37 &deg;疎水性バリアペンを溶かすCウォーターバス</td></tr><tr><td></td><td>Vector Labs</td><td>15553953</td><td></td></tr><tr><td>酸化インジウムスズ(ITO)コーティングガラススライド</td><td>Delta Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm x 75 mm x 0.8 mm (幅 x 長さ x 厚さ)</td></tr><tr><td>LC-MS バイアル</td><td>Thermo</td><td>TFMSCERT5000-30LVW</td><td></td></tr><tr><td>メタノール Optima LC/MS グレード</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>A456-500</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>疎水性フィルム</td></tr><tr><td>pHインジケーターストリップ</td><td>Supelco</td><td>109450</td><td></td></tr><tr><td>赤リンクラスター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343242</td><td></td></tr><tr><td>逆相 C18 材料</td><td>Waters</td><td>186002350</td><td>Nanoflow カラムに手動で詰め込まれ</td></tr>ています <tr><td>ワイトアウト ペン</td><td>BIC</td><td>150810</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip</td><td>ミリポア</td><td>Z720070</td><td></td></tr><tr><td>Instruments and Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatic matrix sprayer system- M5</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 - 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット- HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>乾燥剤</td><td>Drierite</td><td>2088701</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>WPI</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>MALDI ステンレス鋼 ターゲット プレート</td><td>Bruker Daltonics 8280781</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite XLS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>200 & マイクロ;L</td></tr><tr><td>Q Exactive Plus ハイブリッド四重極-Orbitrap</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>ラピfleX MALDI-TOF/TOF</td><td>ブルカー ダルトニクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac - SVC100</td><td>サヴァント</td><td>SVC-100D</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>ブランソニック</td><td>2510R-MTH</td><td>超音波</td></tr><tr><td>処理用 超音波ホモジナイザー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ック</td><td>FB120110 FB120 超音波ディスクレーター CL-18 プローブ</td></tr><tr><td>真空ポンプ - Alcatel 2008 理想</td><td>真空製品</td><td>P10976</td><td>極限圧力 = 1 x 10-4 Torr</td></tr><tr><td>Vortex ミキサー</td><td>コーニング</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス (37C) - Isotemp 110</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-460-10</td><td></td></tr><tr><td>データ分析ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FlexAnalysis</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexControl</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab</td><td>https://scils.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SignalP 5.0</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tBLASTn</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ プログラム=tblastn&PAGE_ TYPE=ブラストサーチ&SHOW_ デフォルト=オン&LINK_LOC =ブラストホーム</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

カリネクテス・サピドゥスにおける神経ペプチドの多面的質量分析調査

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

神経ペプチドは、発生、生殖、食物摂取、外部ストレッサーへの応答など、ほぼすべての生理学的および行動的プロセスを調節するシグナル伝達分子です。しかし、神経ペプチドの生化学的メカニズムと完全な補完物、およびそれらの機能的役割については、ほとんど理解されていない。これらの内因性ペプチドの特性評価は、このクラスのシグナル伝達分子内の膨大な多様性によって妨げられている。さらに、神経ペプチドは、神経伝達物質の濃度よりも100倍〜1000倍低い濃度で生理活性であり、シナプス放出後に酵素分解を起こしやすい。質量分析(MS)は、 先験的な 包括的な知識がなくても分析物を同定、定量、局在化できる高感度分析ツールです。これは、神経ペプチドをグローバルにプロファイリングし、新規ペプチドの発見を支援するのに適しています。このクラスのペプチドの豊富さと化学的多様性が低いため、いくつかのサンプル調製方法、MS取得パラメータ、およびデータ分析戦略がプロテオミクス技術から適応され、最適な神経ペプチド特性評価が可能になりました。ここでは、液体クロマトグラフィー(LC)-MSおよびマトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)-MSを使用して、配列特性評価、定量、および局在化のために、複雑な生物学的組織から神経ペプチドを単離するための方法について説明する。青いカニから神経ペプチドデータベースを調製するためのプロトコルには、包括的なゲノム情報を持たない生物であるCallinectes sapidusが含まれている。これらのワークフローは、様々な器具を用いて、異なる種の内因性ペプチドの他のクラスを研究するために適合させることができる。

サンプル調製とMS分析のワークフローを 図1に示します。ニューロン組織の解剖後、均質化、抽出、および脱塩を行い、ニューロペプチドサンプルを精製する。同位体標識ベースの定量が必要な場合は、サンプルを標識し、再度脱塩します。得られたサンプルは、神経ペプチドの同定および定量のためにLC-MS/MSを介して分析されます。
プロテオミクスソフトウェアを介して同定された神経ペプチドは、良好なペプチド断片化配列カバレッジを有するべきであるが、これは世界的に定義または標準化されていない。絶対同定のためには、すべてのアミノ酸は、明確な同定および局在化を提供するフラグメントイオンを生成するべきである。これはまた、各フラグメントイオンの強度の確認のために合成ペプチドと比較しなければならない。すべての推定同定でこれを実行するためのコストは実現不可能であるため、同定は一般に、より観察されたフラグメントイオンがペプチド同定の信頼度を高める信頼度に基づいて記述される。図2A,B...

神経ペプチドの質量分析特性評価は、配列、定量、および局在化情報を提供します。この最適化されたワークフローは、神経ペプチド研究だけでなく、他の内因性ペプチドにも有用です。ここで提供されるプロトコルは、LC-ESI-MS、MALDI-MS スポッティング、および MALDI-MS イメージングを使用した神経ペプチドのサンプル調製、MS 取得、MS 分析、およびデータベース生成について説明しています。

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

ほとんどのタンパク質よりも小さいが、多くの消化ペプチドよりも大きい内因性ペプチドの分析は、未検討の分野である。このプロトコルは、質量分析ベースのワークフローにおけるscapに対処します。質量分析は非常に高感度であり、目的の特定の神経ペプチドを標的にするために使用したり、サンプル内の神経ペプチドの範囲を捕捉して検出することができます。質量分析による神経ペプチド発現の定量および局在化は、ペプチド治療薬の開発および様々な疾患に対する神経ペプチドバイオマーカーの発見につながる可能性がある。神経ペプチド抽出を開始するには、甲殻類から脳組織を収集し、鉗子を使用して直ちに1つの組織を20マイクロリットルの酸性化メタノールを含む0.6ミリリットルのチューブに入れる。150マイクロリットルの酸性化メタノールをサンプルに加える。ソニック患者の合計時間を24秒、パルス時間を8秒に設定します。超音波ホモジナイザーで振幅を50%に15秒に一時停止し、氷上でサンプルを均質化します。サンプルを摂氏 4 度で 20, 000 GS で 20 分間遠心分離します。ピペットで上清をチューブに移し、約35°Cの真空濃縮器で乾燥させた。脱塩のために、抽出した組織試料を20マイクロリットルの0.1%ギ酸で再構成する。溶液を渦巻き、室温の水浴中で1分間超音波処理する。0.5マイクロリットルのサンプルをpHストリップに塗布して、pHが4未満であることを確認します。摂氏 4 度と 20, 000 GS で 30 秒間遠心分離します。錯覚溶液中で濡れ平衡洗浄を準備する。10マイクロリットルの脱塩チップをC18樹脂で得た。脱塩チップを、15 マイクロリットルに設定された 20 マイクロリットルのピペットの上に置きます。先端を濡れ溶液で3回、等コラボレーション溶液で3回吸引します。試料を10回吸引し、続いて各洗浄液を捨てて洗浄液で3回洗浄した。アセトニトリルを増加させる順にそれぞれの錯覚溶液で10回吸引して溶出する。ほのめかした神経ペプチドを真空濃縮器で乾燥させる。乾燥脱塩した神経ペプチドを5マイクロリットルの0.1%ギ酸で再構成する。溶液を渦巻き、室温の水浴中で1分間超音波処理する。2000 GSで短時間遠心分離機。神経ペプチドおよびクラスタ組織のスポッティングのために、疎水性フィルム上に3マイクロリットルのサンプル液滴をピペットで留める。3マイクロリットルのDHBマトリックスをサンプル液滴上に直接ピペットする。上下にピペッティングして溶液を混ぜる。サンプルおよびマトリックス混合物の1マイクロリットルをMALDIステンレス鋼ターゲットプレートのウェルにピペットし、ピペットチップを使用して各混合物をサンプルウェルの縁に広げる。1マイクロリットルの1対1口径とマトリックス混合物をサンプルの近くのウェルにスポットし

multi-faceted-mass-spectrometric-investigation-neuropeptides

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

パッチクランプキャパシタンス測定とCa 2 +</sup網膜スライスにおける単一神経終末で>イメージング

L-DOPAを用いたドーパミン補充薬物療法は、パーキンソン病の最も一般的に使用される対症療法ですが、不随意の異常な動き、と呼ばれる運動障害などの副作用が付属しています...

パーキンソン病における神経ペプチドのMALDIイメージングマススペクトロメトリー

出典:Wulf, M., et.al.ニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS / MS分析のためのレーザーマイクロダイセクションベースのプロトコル。J. Vis.

ヒト脳組織から単離されたニューロメラニン顆粒のプロテオミクスプロファイルのLC-MS/MS分析

細菌細胞壁はペプチドによって架橋された糖鎖の高分子ネットワークであるペプチドグリカンで構成される。超高性能液体クロマトグラフィーは、ペプチドグリカン組成物の新しい発見に高解像度とスループットを提供します。細胞壁(sacculi)の分離とUPLCによる分析のためのその後の準備のための手順を提示する。...

超高性能液体クロマトグラフィーによる組成解析のための細菌細胞壁の分離と調製

質量分析イメージング（MSI）は、生物学的プロセスに新たな洞察を提供することができ、ネイティブ環境で化合物を保持し、無傷の組織内の様々な化学種を発見し、識別するために使用することができる強力なツールです。本明細小分子の分析のために開発MSI方法が記載されている。...

代謝産物の調査のためのMALDI-質量分析イメージング<em&gt;ウマゴヤシtruncatula</em&gt;ルート結節

ひと脳脊髄液 (CSF) の内因性ペプチドの質量分析法である. します。分子量カットオフろ過、クロマトグラフィーによる事前分別、質量分析、ペプチドの同定戦略の後の組み合わせを採用し、約 10 倍に比べて知られている CSF...

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このプロトコルは、液体クロマトグラフィー質量分析と高度な特徴抽出およびバイオインフォマティクス分析ソフトウェアを組み合わせたペプチドグリカン組成の詳細な分析をカバーしています。...

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

ここでは、脊椎動物 アフリカツメガエル...

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翻訳後修飾(PTM)は、タンパク質の構造と機能を変化させます。複数のPTMタイプを同時に強化する方法は、分析のカバレッジを最大化することができます。我々は、膵臓組織におけるタンパク質N-グリコシル化およびリン酸化の同時濃縮および分析のための質量分析に続く二重機能Ti(IV)固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いたプロトコルを提示する。...

ヒト膵臓組織からのN-糖ペプチドとリンペプチドの同時分析のためのスピンチップ濃縮戦略

学ぶ神経ペプチドの質量分析的手法をCallinectes sapidus脳組織に適用し、LC-ESI-MSとMALDI-MSイメージングで定量・局在解析を行う方法。ペプチド治療薬開発とバイオマーカー発見に貢献します。

カリネクテス・サピドゥスにおける神経ペプチドの多面的質量分析調査

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