Name: 交換可能な蓋付き乳房イメージングウィンドウを使用した縦方向のバイタル内顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 学ぶ交換可能な蓋付き乳房イメージングウィンドウを用いた縦方向バイタル内顕微鏡法。マウス乳房組織の長期的ダイナミクスと単一細胞レベルの腫瘍進行を観察し、発生生物学とがん研究に応用可能です。

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この研究は、研究財団フランダース(PhD grant fundamental research 11L7222N to M.C.)、ベーリンガー・インゲルハイム財団(C.L.G.J.S.への博士フェローシップ)、EMBOポスドクフェローシップ(C.L.G.J.S.への助成金ALTF 1035-2020)、およびDoctor Josef Steiner Award(J.v.R.への)によって支援されました。

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著者は開示するものは何もありません

R.MIWは、そのネイティブで最小限の破壊された環境での健康および罹患した乳腺の縦方向イメージングを可能にし、多様な発達段階で乳腺の反復視覚化を可能にする。R.MIW計画では、実験中の任意の時点でウィンドウを開くことができます。関心のある組織への長期的な視覚的アクセスは、例えば、カバースリップ上の細胞破片の蓄積によって妨げられ得る。このような場合、R.MIWは、画像化セッションの前または直後に開封して、目に見える組織領域および蓋全体の洗浄を可能にすることができる。取り外し可能な蓋はまた、組織の操作だけでなく、特定の阻害剤および療法、標識色素、または関心のある特定の細胞タイプなどの物質の局所適用を可能にする。
この方法は、1つのイメージングセッションに限定された前述の乳房皮膚フラップ手順4、7、8、13の限界を克服し、分岐形態形成(図5)、恒常性組織代謝回転(図6)、または細胞レベルでの腫瘍増殖(図3B)などのプロセスを視覚化することができる。).しかし、同時に、R.MIWは、以前に公開されたMIW3,18および他のすべてのイメージングウィンドウ20,22と比較して、R.MIWの大きな資産を構成するイメージングセッション間の組織の局所的な操作を可能にする。R.MIWを開くときは、感染源を防ぐために常に無菌状態を維持することが重要です。無菌環境でR.MIWを開く能力により、すべてのイメージングセッションの前にイメージング条件を最適化することができ、目的の組織への長期的な視覚的アクセスが大幅に改善されます。具体的には、脂肪細胞が豊富な間質に埋め込まれている乳腺において、これは大きな価値がある。さらに、交換可能な蓋は、IVM実験を終了させることなく、治療薬、異なる細胞タイプ、標識色素、画像誘導マイクロダイセクション、または組織の他の局所操作の局所投与を一意に可能にすることができる。例えば、腫瘍開始を研究するために、このROIがR.MIWリングを介してアクセス可能である限り、特定の癌細胞集団を、決定されたIVM時点および正確な乳腺位置で管状樹または間質に直接注入することができる。腫瘍の進行を研究するために、IVMセッション中に特定の癌細胞集団(特定の場所、特定の微小環境、または特定の挙動を有する)を光マーキングし、続いてR.MIWの開封後に蛍光解剖顕微鏡を用いて微小解剖することができる。単離された細胞は、(単一細胞)mRNAシーケンシングなどの下流分析のためにさらに処理することができます。このアプローチを用いることで、生体内細胞の挙動を分子発現プロファイルに結びつけることができる。R.MIWによって可能になる局所薬物投与の利点は、組織を治療の前および直後に画像化することを可能にする。マウスをイメージングボックスから取り出し、R.MIW蓋を開けた後に局所薬物投与を行うのに必要な間隔は数分で行うことができ、これにより速効性薬物の即時段階捕捉が可能になる。
我々は、R.MIWを介した乳腺のIVMが、多くの異なる蛍光レポーターマウスモデルと互換性があることを示す。脂肪が豊富な環境は画像化が困難なため、明るい蛍光色素の使用をお勧めします。しかし、ここに示すように、mCFPのようなあまり明るくない蛍光色素であっても、最適なイメージング条件でR.MIWを介して可視化することができます。必然的に、脂肪パッドは、より深い管構造のイメージングを排除し、より表面的なダクトへのイメージングを制限する。各IVM実験の開始時に低解像度の概要画像は、高解像度イメージングに十分に表面的な目的のダクト構造を特定するのに役立ちます。局所組織操作、結合組織の除去、またはR.MIWを開いた後の脂肪組織の再配置は、脂肪組織によってオーバーレイされる特定のROIについてIVMを最適化することができる。これは、これらの操作を実行できず、ウィンドウ自体を完全に削除する必要がある以前のすべてのウィンドウ設計に対する重要な利点です。具体的には、鼠径リンパ節の可視化のために、光散乱を低減し、高解像度イメージングを可能にする、上層の脂肪組織を穏やかに除去することが推奨される。組織を操作するときは、IVM実験中に研究されているプロセスに影響を与える可能性があるため、常に無菌状態を維持し、出血や組織への重大な損傷を防止してください。
R.MIWはチタンでできており、関節や骨板などの硬組織を置き換えるために臨床現場で一般的に使用されている材料です。チタンは、その軽量で不活性な特性21を含む、スチール窓よりもいくつかの利点を有する。最近、フレキシブルシリコンウィンドウ20を含む新規な画像化ウィンドウタイプを生成するために、いくつかの他の材料が使用された。R.MIWとは対照的に、フレキシブルウィンドウは移植に縫合糸を必要とせず、ほぼすべての解剖学的位置、特に柔らかく壊れやすい組織の場合に適しています。シリコン窓は、その軽量で変形可能な性質のために動物の運動性への影響を最小限に抑え、急速な組織膨張および成長を研究する実験におそらくより適している20。チタン版に対する別の利点は、シリコン窓が、磁気共鳴画像化20,27を含む他の画像化モダリティと互換性があることである。ただし、対物レンズは 0.17 mm のガラスカバースリップに最適化されていることに留意することが重要です。さらに、乳腺組織は呼吸運動の影響を受けやすく、特に倒立顕微鏡を使用する場合、フレキシブルウィンドウを使用して制限することは困難です。呼吸アーチファクトは、R.MIW設計とイメージングボックスのインレイへのR.MIWの固定によって最小限に抑えられます。その結果、提案されたR.MIWセットアップを使用して取得された画像は、呼吸アーチファクトのために歪むことはありません。しかしながら、組織局在化における軽微なドリフトが生じ得、これは通常、緩やかであり、取得後運動補正ソフトウェア28を用いて補正することができる。IVM技術2,20のツールボックスの増加に伴い、各実験の特定の要件は、最終的に、関心のある組織のin vivo可視化の最良の方法を決定するでしょう。異なる窓設計には異なる長所と短所があり、研究課題、利用可能な顕微鏡のセットアップ、必要な空間的および時間的分解能、および研究プロセスの総時間スパンに応じて、最適なアプローチを決定する必要があります。
要約すると、R.MIWは、乳腺の発達、恒常性、および疾患中の細胞動態の高解像度特性評価を数日から数週間にわたって促進する。

乳腺上皮は哺乳類に存在するユニークな分泌器官であり、子孫に栄養を与えるために牛乳を生産して分泌します。生涯を通じて、乳腺は複数回の発達および成長を受け、組織1の構造的および機能的変化を伴う。発生段階に応じて、組織リモデリングに寄与する細胞型、ならびに管状樹内の位置が異なる。
多光子インタビタル内顕微鏡(IVM)は、天然かつ最小限に摂動した設定2、3、4におけるインビボでの乳腺細胞ダイナミクスの研究を可能にする。乳腺への視覚的アクセスを得るために、思春期4、5、6、7、成人期2、8、授乳9、10、11、12、および腫瘍動態13、14を含む、乳腺発達の異なる段階の間に、いくつかの一時的なエクスビボまたは皮膚フラップ画像化技術が公開されている。,15.これらの技術は、乳腺細胞ダイナミクスの高い空間的および時間的に分解された画像化をもたらすが、時間枠は時間に制限されているのに対し、ほとんどの乳腺リモデリングプロセスは数日から数週間かかる。したがって、長期間にわたって関心のある組織への光学的アクセスを可能にする方法が必要とされる。長年にわたり、チタン製乳房画像化窓(MIW)2,3,19を含む、乳腺腫瘍画像化のためにいくつかの永久画像化窓15,16,17,18が開発されてきた。乳腺腫瘍の増殖を研究するのに非常に有用であるが、健康な乳腺構造の可視化は数日にとどまった。最近、柔軟なシリコンイメージングウィンドウが開発され、数週間にわたって思春期の乳腺を視覚化することができます20。しかし、乳腺は脂肪細胞が豊富な脂肪パッドに埋め込まれており、これは広範な光散乱をもたらし、その結果、乳腺管構造の視認性が制限される。したがって、乳腺における長期間にわたる組織動態を視覚化するためには、常に優れた画像化条件が要求される。古典的なMIWも柔軟なシリコンウィンドウも、手術や移植後にウィンドウが閉じたシステムを形成するため、イメージング前の組織操作や物理的な組織位置の最適化はできません。その結果、基礎となる乳腺組織への最適な光学的アクセスは、より長い期間にわたって妨げられる可能性が高い。対照的に、皮膚フラップ技術は、画像化セッション中の組織の最適化および再配置を可能にし、皮膚フラップを複数回繰り返すことができる2。しかし、皮膚フラップによる反復画像化セッションは、皮膚の回復を可能にするために手術の間に十分な時間(少なくとも7日間)が割り当てられている場合にのみ可能であり、したがって、より長い時間スケールでの研究プロセスにほとんど適している。さらに、その侵襲的な性質および創傷閉鎖時の感染および瘢痕化の大きなリスクのために、この処置を何度も行わないことが推奨される。
これらの制限を克服するために、すなわち、高周波で長期間にわたって最適なイメージング条件を確保し、同時に組織操作を可能にするために、交換可能な蓋(R.MIW)を備えたMIWの改良されたチタンバージョンが、数日から数週間にわたって健康な乳房および罹患した乳腺を視覚化するように設計されました2 (図1A、R.MIWは、最適な組織アクセスを提供するようにカスタム設計されており、IVM実験の全期間にわたって直接組織操作を可能にし、それによって長期間にわたって適切な時間と場所で乳腺を視覚化することができます。閉じると、R.MIWは古典的なMIWに匹敵する気密システムを形成します(図1C)。無菌条件下で開くと、R.MIWは局所組織操作を可能にして光学アクセスを改善し、経路阻害剤またはアゴニストなどの物質の局所投与、癌細胞または免疫細胞集団などの異なる細胞タイプの標的の注射、または組織標識色素の添加も可能にする。蓋は、下層組織に損傷を与えることなく、イメージングセッション間の任意の時点で開くことができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig01.jpg"> 図1:交換可能な蓋を備えた乳房造影窓の設計。(A)リングに10mmのカバーガラスを接着した乳房造影窓の交換可能な蓋の上面図と側面図。(b)乳房撮像窓の上面図及び側面図は、財布紐縫合糸を用いてマウスの皮膚内に窓を固定する間に溝を有する外輪及び内輪からなる。外側のリングには、蓋の4つの突起(アーム)にフィットする小さな溝があります。(C)蓋の開閉機構を示す漫画や写真。斜めの突起は、蓋が窓枠の内側に固定されていることを確認します。この図は Messal et al. 2 から修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
このプロトコルは、R.MIWの設計と移植手順、および同じ乳管とその可視化を細胞分解能で再検討するための縦方向IVM戦略を記述しています。R.MIWは、多様な蛍光レポーターマウスモデルにおける乳腺の異なる発生段階における細胞分裂および形態学的変化の追跡を可能にする。まとめると、R.MIWは、乳腺の発達、恒常性、および疾患中の細胞ダイナミクスの高解像度特性評価を容易にする。

<table><tbody><tr><td>0.9% NaCl</td><td>BD</td><td>306573</td><td>その他のブランドが利用可能</td></tr><tr><td>10 mm 丸型カバーガラス</td><td>フィッシャー 科学</td><td>10696365</td><td>その他のブランドが利用可能</td></tr><tr><td>5-0 編組シルク縫合</td><td>エチコン</td><td>W580</td><td></td></tr><tr><td>80% エタノール</td><td>自家製</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>麻酔誘導ボックス</td><td>Kentscientific</td><td>VetFlo-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン(獣医学&reg;)</td><td>Ecuphar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップ(滅菌)</td><td>フィッシャー科学</td><td>13113743</td><td>他のブランドが利用可能</td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>ロックタイト</td><td>NA</td><td>利用可能な他のブランド</td></tr><tr><td>目の軟膏</td><td>Duratears</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>フレキシブルバタフライニードル</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450120</td><td>利用可能な他のブランド</td></tr><tr><td>Graefe鉗子(鈍い)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>Kentscientific</td><td>RightTemp Jr.</td><td>利用可能な他のブランド</td></tr><tr><td>イメージングボックス</td><td>カスタムメイド</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>注入栄養混合物</td><td>ブラウン</td><td>・ニュートリフレックス・スペシャル 70/240</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>BD</td><td>324911</td><td>その他のブランド</td></tr><tr><td>自動ステージ付き倒立多光子顕微鏡</td><td>ライカ・マイクロシステムズ</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>VetFlo-1231K</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>12510-14</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P7793</td><td>半透明テープ</td></tr><tr><td>紙テープ テ</td><td>サ</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン ワセ</td><td>リン</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>11904325</td><td>その他のブランド</td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>ソリューションエラストメア</td><td>NA</td><td>家庭用品</td></tr><tr><td>春はさみ(小)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>滅菌PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ(10ml)</td><td>BD</td><td>305482</td><td>その他のブランド</td></tr><tr><td>薄い鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11413-11</td><td></td></tr><tr><td>乳房イメージングウィンドウ</td><td>用チタン蓋カスタムメイド</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>チタン乳房イメージングウィンドウカスタム</td><td>メイド</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>木製スティックつまようじフィ</td><td>ッシャー科学</td><td>NC1678836</td><td>他のブランドが利用可能</td></tr></tbody></table>

交換可能な蓋付き乳房イメージングウィンドウを使用した縦方向のバイタル内顕微鏡

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

乳腺の分岐構造は非常に動的であり、出生後に成長およびリモデリングのいくつかの段階を経る。皮膚フラップ手術またはイメージングウィンドウの移植と組み合わせたバイタル内顕微鏡検査は、異なる発達段階における健康な乳腺の動態を研究するために使用されてきた。ほとんどの乳腺イメージング技術は数時間から数日の時間枠に制限されていますが、乳腺のリモデリングプロセスの大部分は数日から数週間の時間枠で行われます。乳腺リモデリングを研究するには、関心のある組織への光学的アクセスを長時間にわたって可能にする方法が必要である。ここでは、交換可能な蓋(R.MIW)を備えたチタン乳腺イメージングウィンドウの改良版が記載されており、最大数週間の細胞分解能で乳腺の高解像度イメージングを可能にします。重要なことに、R.MIWは、生体内イメージング実験の全期間にわたって組織アクセスを提供するため、局所組織操作、標識、薬物投与、または画像誘導マイクロダイセクションに使用される可能性があります。まとめると、R.MIWは乳腺の発達、恒常性、および疾患中の細胞ダイナミクスの高解像度特性評価を可能にします。

乳腺の異なる発達段階における乳腺上皮細胞の増殖動態を研究するために、記載されたプロトコールが実行された。R.MIWの設計を図 1に示し、R.MIWを移植する手順を 図2にまとめたものです。R.MIWは、乳腺と皮膚との間に外科的に移植される。縫合糸は、窓のリング内に保持し、マウスが縫合糸を引っ張るのを防ぐために使用されます(図2)。R.MIWを保持する縫合糸は、低アレルギー性、柔らかい質感、および取り扱いが容易な非吸収性シルクで作られています。R.MIWリングはチタンでできており、移植後の炎症や壊死を促進しない最も生体適合性の高い材料の1つである21。無菌状態に従い、縫合糸がうまく実行される場合、R.MIW乳腺移植は術後合併症のリスクが低い。さらに、腹部画像窓移植22とは異なり、R.MIW移植は、乳腺が重要な器官ではなく、倫理的プロトコルに規定された限界まで毎日の画像化を可能にするため、マウスの生存のための制限因子ではない。窓の移植の持続時間を制限する唯一の要因は、皮膚の恒常性ターンオーバーであり、これは最終的に4〜6週間後に縫合糸が脱落することにつながる。したがって、縫合糸の安定性を定期的に検査することが重要です。必要に応じて、縫合糸を除去し、無菌条件下で(ステップ3.5〜3.8で説明されているように)新しい財布紐縫合糸で置き換えて、窓の安定性を安心させることができる。
複数日イメージングアプローチを使用する場合の大きな課題は、連続した日にROIを追跡することです。この目的のために、ROIを選択する前にクイックオーバービュースキャンを含めることができます(図3B)。コラーゲンネットワークシグナル(第2高調波生成によって視覚化される)、組織構造、色素または蛍光タンパク質で差次的または確率的に標識された細胞の局所パターンなど、複数の組織ランドマークを使用して組織の同じ領域をたどることができます(図3B)。この代表的な例では、MMTV-PyMTの第4乳腺にR.MIWが移植された 。R26-CreERT2het;R26-触知可能な腫瘍形成の開始時の紙吹雪ヘット 雌マウス。続いて、1.5mgのタモキシフェンの注射によって確率的組換えが誘導され、いくつかの細胞においてConfetti構築物の再結合を生じた(図3C)。組換え腫瘍細胞を20日間追跡した(図3B、C)。連続した日にわたる乳腺の同じ領域の画像化が妨げられる場合、無菌環境で窓を開き(ステップ5.1で説明したように)、さらに片付け、組織を再配置して視認性と画像取得を改善することができます(図3A)。
この方法を用いて、思春期に発達中の乳腺を単一細胞レベルで追跡した。R.MIWを介した反復IVMを 、R26-CreERT2ヘットを用いて実施した。R26−mTmGhet雌マウスの4〜6週齢の間に、全ての細胞が膜tdトマトで標識されている(図4A)23。マウスに低用量のタモキシフェン(0.2mg/25g体重)を注射し、その結果、mTmG構築物の散発的な組換えが起こり、乳腺を含むすべての組織の一部の細胞において赤色から緑色への変化を引き起こした(図4B)。同じROIを数日間にわたって再検討し、乳管伸長および乳管分岐(図4C)を含む乳腺内の形態学的変化を細胞分解能で視覚化した。重要なことに、確率的細胞標識と複数日IVMのこの組み合わせにより、細長い管と分岐する管を囲む間質内の単一細胞のダイナミクス(図4D)や鼠径リンパ節内の細胞ダイナミクス(図4E)など、乳管環境の動的変化を視覚化することもできます。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig04.jpg"> 図4:思春期分岐形態形成の複数日IVM。生後4〜6週のR26-mTmGマウスに、R26-mTmG対立遺伝子のCre媒介性組換えをもたらす低用量のタモキシフェンを注射し、発達中の乳腺の動的変化を追跡するために1日目、3日目、および5日目に画像化した。(b)非組換え条件下で膜tdトマト(mT)の遍在的発現をもたらすR26−mTmGマウス構築物の概略図。Cre媒介組換えにより、mTは膜eGFP(mG)発現のために切り替えられる。(C)R26-CreERT2のR.MIWを通して画像化された数日間にわたる細長く枝分かれした乳管の3Dレンダリング;6週齢のR26-mTmGメスマウス。(D)分岐先端(上部パネル)および伸長分岐(下部パネル)の単一Z平面画像。mT は赤、mG はシアンで表され、スケールバーは 100 μm (A と B) を表します。間質内の単一細胞は、白いアスタリスクで強調表示されている。間質内の単一細胞を強調するためにシグナル強度を手動で増加させ、乳腺上皮細胞のわずかに露出過剰の外観をもたらしたことに留意されたい。(e)R26-CreERT2の鼠径リンパ節の代表的な画像;R26-mTmG メスマウスを R.MIW で画像化し、1 つの Z 平面の概要タイル スキャン (左パネル)、ズーム画像 (右パネル)、および 3D レンダリング (下) を表示します。第2高調波生成(コラーゲンI)は緑色、mTは赤色、mGはシアンで示されている。スケール バーは、500 μm (概要タイルスキャン) と 100 μm (ズーム画像) を表します。図パネルCおよびDは、Messalら2から改変されている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
同様に、成人乳腺では、提案されたR.MIWアプローチにより、妥協のない視認性で数日間にわたって同じ乳管構造を視覚化することができます。Cdh1-mCFP(Ecadherin-mCFP)マウスモデルのような、あまり明るくない蛍光レポーターモデル24を用いても、細胞分解能での乳管安定性および微妙な形態学的変化の可視化を可能にする(図5)。3日目から5日目の間の視認性は、組織再配置後に有意に改善されたことに留意されたい(図5)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig05.jpg"> 図5:成体乳腺の複数日イメージング。成体 雌 Cdh1-mCFP (シアン、エカドヘリン陽性管腔細胞発現をマーク)マウスの乳腺管構造の3Dレンダリング画像を連続して複数日間にわたって撮影。コラーゲンIパターン(第2高調波生成、マゼンタ)を用いて同じROIをたどり、 Cdh1-mCFP シグナルを用いて乳管(管内)細胞をマークした。なお、3日目以降の視認性は、R.MIW蓋の開放および組織の位置変更により改善された。スケール バーは 100 μm を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ホルモン周期中の乳腺上皮細胞の増殖性不均一性を単一細胞レベルで評価するために、KikGRタンパク質の遍在的な発現を有する光変換可能なキクメグリーンレッド(KikGR)レポーターマウスモデル25、26を使用した。KikGRは、紫色光に曝露すると緑から赤への変換を受ける明るい蛍光色素分子であり、赤/緑の比は細胞2の増殖活性の代理として使用することができる(図6A、B)。R.MIWアプローチを用いて、成乳腺の乳管樹内の同じ細胞を数日間にわたって追跡し、管樹全体に以前は予想外の増殖性の不均一性を見出した(図6C)。高増殖性および低増殖性細胞は、異なる変換領域にわたって均等に分布していた(図6C、D)。驚くべきことに、局所レベルでは、隣接する細胞は赤/緑の比に大きな違いを示した(図6C、D)。光変換の10日後に異なる細胞の赤/緑の比を(増殖活性の代理として)定量化すると、同じ乳管微小環境内のいくつかの細胞の希釈率が高度に変動することが明らかになった(図6E)。これらのデータを総合すると、成体乳腺内の顕著な局所的な増殖性の不均一性、および同時に、世界的に均一な離職率を明らかにしている。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig06.jpg"> 図6:KikGRマウスモデルを用いて成体乳腺における増殖性不均一性の縦IVM 。 (A)KikGRマウスを紫色光への曝露前後の0日目に画像化した。イメージングセッションは、変換後の2日目、6日目、および10日目に繰り返されました。(B)増殖後のKikGR乳腺上皮細胞の光変換(左パネル)および増殖なし(右パネル)の時間の関数としての仮説的転帰の概略描写。(C)乳腺の同じ領域をR.MIWを通して10日間にわたって画像化した。より小さい領域は0日目に光変換され、時間の経過とともにキクメ赤色シグナルの同様の希釈速度を示し、上皮全体で等しい代謝回転速度を示した。(D)パネルCに示された領域のズーム画像(単一のZ平面)は、光変換後6日目および10日目の細胞レベルでの増殖性不均一性を示す。スケールバーは、100 μm(パネルC)および10 μm(パネルD)を表す。(E)3つの光変換領域におけるランダムに選択された細胞(n= 48細胞)の赤/緑比の定量化。高い赤/緑比は低い希釈率および低い増殖活性を示し、一方低い赤/緑色比は高い希釈率および増殖を示す。図パネルC−Eは、Messalら 2から改変されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、交換可能な蓋(R.MIW)を備えた新しい乳房イメージングウィンドウを記述しています。R.MIWの移植後の生体内顕微鏡検査は、異なる発達段階の間に細胞分解能を有する健康および罹患した乳腺の縦方向および複数日のイメージングを可能にする。

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

乳腺は非常に動的であり、生涯を通じて改造の複数のラウンドを受けます。私たちのプロトコルは、健康な乳腺と病気の乳腺における組織再配列を駆動する細胞ダイナミクスを捉えることを可能にします。交換可能な蓋を備えた当社の乳腺イメージングウィンドウは、数週間までの長期間にわたって乳腺の縦方向のインバイタル内イメージングを行うことができます。乳房イメージングウィンドウの交換可能な蓋は、常に最適なイメージング条件を保証し、イメージングセッション間の組織操作または薬物投与を可能にします。私たちの方法は、健康な乳腺生物学への洞察を提供するだけでなく、単一細胞レベルで乳腺腫瘍の開始と進行を研究することを可能にします。まず、乳房造影窓の蓋を滅菌面に置き、リム蓋の周囲全体にシアノアクリレート接着剤を塗布します。10 mm の丸いガラスカバースリップを蓋の上に慎重に置きます。滅菌した木の棒を使用してガラスカバースリップを配置し、ガラスカバースリップと蓋のフレームの間に気密シールを確保するために、押し下げるために力を加えます。ガラスが蓋の腕の穴を覆っていないことを確認してください。蓋と乳房のイメージングウィンドウを消毒するには、閉じたペトリ皿で80%エタノールに少なくとも30分間浸します。アセトンに浸した綿の先端を使用して、ガラスカバースリップ上の余分なシアノアクリレート接着剤接着剤を取り除きます。手術のためにマウスを準備するために、カミソリの刃を使用して第4乳腺の周りの領域を剃る。4番目の乳首を目印にし、粘着テープでゆるい毛を取り除きます。動物が適切に麻酔されているかどうかを確認するために足の撤回試験を行います。細かい鉗子を使って皮膚をやさしく持ち上げ、小さなスプリングハサミを使って4番目の乳房脂肪パッドの上に皮膚に10〜15ミリメートルの対角線切開を行います 第4乳首を向きのポイントとして使用し、腹膜や乳腺を切断または損傷しないようにしてください。切開ラインの周囲に最大5〜8ミリメートルの鈍い解剖を使用して、乳房脂肪パッドおよび下層の組織層から皮膚を分離し、乳房イメージング窓枠に収まるポケットを作成する。リンパ節または腫瘍病変の位置を含む乳腺組織の巨視的特徴に基づいて、関心領域またはROIを定義する。切開に関してROIを中心に保つようにしてください。滅菌鉗子を使用して乳房イメージングウィンドウを拾い上げ、切開部がウィンドウを挿入するのに十分な大きさであるかどうかをテストします。必要に応じて、乳房の画像検査窓が収まるまで切開部をわずかに拡大します。窓を取り外し、5-0シルク縫合糸を使用して、尾端から始まり、皮膚の外側から内側まで、切開部の端から1〜2ミリメートル離れたところに財布の紐縫合糸を配置する。切開部に沿って約5ミリメートル上に移動させ、縫合糸を皮膚の内側から外側に通す。切開部の縁に沿ってこの手順を繰り返し、それによって5〜6個のループからなる円形の縫合糸を作成する。縫合糸の最終出口は、最初の入り口から約2〜5ミリメートル離れた場所に配置する必要があります。乳房のイメージングウィンドウを切開部内に収め、グレーフ鉗子を使用して、窓の溝に皮膚を慎重に配置します。縫合糸のループを外側に残してください。財布の紐縫合糸のループを引っ張り、縫合糸の両端を優しく引っ張って乳房造影窓の溝に締め付けます。外科用結び目で結び、余分な糸を切り取ります。爪楊枝を使用して、ワセリンを窓の内側の縁に塗布し、下層の組織を避けます。滅菌鉗子で窓枠をゆっくりと下に押し下げ、蓋を窓枠に入れます。これにより、乳腺組織と乳房画像窓蓋との間の空気の体積が回避される。蓋の腕の穴に細い鉗子の先端を置き、時計回りにひねって蓋を締めます。蓋を締めた後に空気が残っている場合は、皮膚を通して乳房組織と蓋の間の空洞に滅菌インスリン針を導入し、プランジャーをゆっくりと引き出して、乳腺組織と乳腺イメージング窓の蓋との間に真空を作り出す。今、リンパ節は、この手順の後に容易に観察することができます.乳房の画像窓枠と蓋の状態を検査し、縫合糸の安定性や蓋の潜在的な損傷を含めます。乳房の撮像窓が撮像ボックスインレイの穴に落ちるように、マウスをインレイの上に置きます。マウスの背面に半透明の紙テープを貼り、マウスを安定させ、呼吸による組織運動を軽減します。3 時間以上のイメージング セッションの場合は、マウスの首に柔軟な針を皮下に置き、紙テープで固定します。栄養ミックスの入った10ミリメートルのシリンジを柔軟なシリコーンチューブに取り付け、チューブの端に達するまで栄養ミックスを押します。シリコーンチューブを柔軟な針に接続し、30分ごとに50マイクロリットルの注入溶液を注入する。イメージングボックスの上に蓋をして閉じます。次いで、顕微鏡のステージに撮像ボックスを固定する。マウスがイメージングボックス内で安定していることを確認します。顕微鏡の落射蛍光モードを使用して関心領域を定義し、顕微鏡設定を適用します。イメージングソフトウェアナビゲータモードでスパイラル機能を使用して、大きな概観タイルスキャンを生成し、組織の参照マップを作成します。スパイラル概要内の関心領域を定義し、Z スタックを決定するために上下の Z 平面を定義します。開始を押して、組織の詳細な3次元または4次元Zスタックを取得します。薄い鉗子の先端を蓋の腕の乳房造影窓の穴に通し、反時計回りにねじってふたを緩めます。あるいは、滅菌鈍鉗子を使用して組織を操作または再配置して、特定の関心領域の画像化条件を最適化することができます。ワセリンを乳房イメージングウィンドウの内側の縁に塗布し、下層の組織を避けます。滅菌鉗子で窓枠をゆっくりと下に押し下げ、蓋を窓枠に入れます。最後に、薄い鉗子の先端を蓋の腕の穴に通し、時計回りにねじってふたを軽くします。思春期Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26膜トマト膜GFPマウスに低用量のタモキシフェンを注射し、Rosa26膜トマト膜GFP対立遺伝子のCre媒介組換えをもたらした。マウスを1日目、3日目、および5日目に画像化し、発達中の乳腺の動的変化を追跡した。代表的な画像は、乳腺イメージングウィンドウを通して画像化された数日間にわたる細長く枝分かれした乳管の3Dレンダリングを示しています。分岐先端と細長い枝の単一Z平面画像がここに示されている。間質内の単一細胞は、白いアスタリスクで強調表示されている。代表的な画像は、乳房画像化窓を通して画像化されたマウスの鼠径リンパ節を示す。第2高調波発生は緑色で示されています。複数の連続した数日間にわたる成体雌E-カドヘリン膜CFPマウスの乳腺管構造の3Dレンダリング画像がここに示されている。コラーゲンIパターンは、同じROIをたどるために使用され、E-カドヘリン膜CFPシグナルは、乳管細胞をマークするために使用された。キクメ緑赤色マウスは、紫色光に曝す前後0日目に画像化した。イメージングセッションは、変換後2日目、6日目、および10日目に繰り返されました。乳腺の同じ領域を、乳腺画像化窓を通して10日間画像化した。より小さな領域は零日目に光変換され、時間の経過とともにキクメ赤色信号の同様の希釈速度を示し、上皮全体で等しい代謝回転速度を示した。示された領域のズーム画像は、光変換後6日目および10日目に細胞レベルで増殖性不均一性を示す。光変換後10日目に異なる細胞の赤と緑の比を定量化すると、同じ乳管微小環境内のいくつかの細胞の希釈率が高度に変動することが明らかになった。この手順の重要なステップは、イメージングセッションの間に蓋を開けることです。ウィンドウのこのユニークな特徴は、イメージング条件を改善し、組織の縦方向イメージングを可能にします。交換可能な蓋を備えた乳房イメージングウィンドウは、マウス乳腺における腫瘍の開始および進行の分野におけるin vivo、速効性薬物検査およびスクリーニングに関する新しい質問を容易にする。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

乳腺画像ウィンドウを通してDendra2標識腫瘍細胞の生体内photoswitchingとトラッキングは、私たちは、画像間のタイムスケール上の選択された腫瘍の微小環境における腫瘍細胞の転移挙動をするという技術です。...

乳腺イメージングの窓からDendra2 Photoswitching

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真空安定化撮像窓と肺における長期高分解能生体顕微鏡

このプロトコルは細胞特異的蛍光マーカーを発現するトランスジェニック マウスの生体イメージングを説明します。生体イメージングは、プロセスの顕微可視化が可能な埋込型の windows...

腫瘍関連血管系を使用しての生体顕微鏡が背高度な蛍光トランスジェニック マウスの皮下脂肪のウィンドウの部屋

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透明なシリコーン窓による縦方向の生体内イメージング

ここで説明するイントラバイタルイメージング法は、コラーゲンの第二高調波発生と代謝補因子NAD(P)Hからの内因性蛍光を利用して、標識されていない腫瘍微小環境を腫瘍、間質、血管区画に非侵襲的にセグメント化し、4Dインタビタル内画像の詳細な解析を行います。...

乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

本プロトコルは、授乳中のマウス乳腺の生体内イメージングのための容易な技術を、レーザー走査型共焦点顕微鏡および多光子顕微鏡法によるものとして記述している。...

乳腺の生体内細胞内顕微鏡検査

このプロトコルは、倒立共焦点顕微鏡を使用して生体内イメージングを簡素化する新しいツールを提供します。...

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ルシフェラーゼを発現する乳腺腫瘍細胞をマウスに皮下移植し、縦断的研究で、非侵襲的に腫瘍の成長と発展を監視する光イメージングを用いて可視化されています。...

IVISスペクトラムを用いた乳腺腫瘍の in vivo生物発光イメージングに

学ぶ交換可能な蓋付き乳房イメージングウィンドウを用いた縦方向バイタル内顕微鏡法。マウス乳房組織の長期的ダイナミクスと単一細胞レベルの腫瘍進行を観察し、発生生物学とがん研究に応用可能です。

交換可能な蓋付き乳房イメージングウィンドウを使用した縦方向のバイタル内顕微鏡

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