3D構造化照明顕微鏡(3D-SIM)を用いた軸索初期セグメントの膜周期骨格の特性の測定
2022年2月11日
本プロトコールは、培養ラット海馬ニューロンおよび3D構造化照明顕微鏡(3D−SIM)を用いて軸索初期セグメントの膜周期骨格のアクチン環および他の成分を視覚化および測定する方法を記載する。
このプロトコルは、培養ニューロンの軸索初期セグメントにおける膜周期的骨格を解くことを可能にする。タンパク質の局在を調べることにより、膜周期骨格における機能についての洞察を得ることができる。この技術の主な利点は、その堅牢性と使いやすさです。
構造化照明顕微鏡は、膜周期骨格および試料調製を解決可能であり、容易かつ容易である。蛍光顕微鏡の以前の経験を持つ人なら誰でも、この技術を簡単に実装できます。このプロトコルは、サンプル調製およびイメージング中に信号対雑音比を最大化するように設計されています。
開始するには、室温で12分間、4%パラホルムアルデヒドを使用してニューロンを固定します。カバースリップをリン酸緩衝液中の0.2%BSA中で1回洗浄し、室温でPBS中のTriton Xの1%溶液中で10分間インキュベートする。カバースリップをリン酸緩衝液中のBSAで洗浄し、BSAを用いて抗アンキリンG抗体をリン酸緩衝液中で1対200の割合で希釈する。
抗体溶液をカバースリップに加え、摂氏4度で一晩インキュベートする。細胞をBSAリン酸緩衝液中で1回、リン酸緩衝液中の0.1%Triton X中で1回、リン酸緩衝液中で1回洗浄する。タグを付けたフルオロ4を希釈し、BSAリン酸緩衝液にさらに二次抗体を加え、カバースリップに加える。
細胞をBSAリン酸緩衝液中で1回、リン酸緩衝液中の0.1%Triton X中で1回、次いでリン酸緩衝液中で1回洗浄する。リン酸緩衝液中のタグ付きフェロジンの1マイクロモル溶液を調製し、それを細胞に加える。ウシ血清アルブミンリン酸緩衝液中で細胞を1回洗浄し、リン酸緩衝液中の0.1%Triton X中で1回、次いでリン酸緩衝液中で1回洗浄する。
スライドガラスにカバースリップを取り付ける場合は、スライドに装着用紙を一滴塗り、脱イオン水に浸し、柔らかいペーパータオルで叩いて余分な水分を除去します。カバースリップをスライドガラスの上に置き、室温で24時間インキュベートする。可能であれば、イメージング前に顕微鏡施設の担当者に相談し、浸漬油計算機を使用してサンプルに適した浸漬油を選択してください。
サンプルの準備ができたら、カバースリップを清潔にし、水またはエタノールに浸した綿の先端で洗浄して、残留物がないことを確認します。サンプルを3D-SIM顕微鏡に置き、画像をキャプチャする細胞を見つけます。関連するレーザーラインのパワーを調整します。
そして露光時間は、サンプルを著しく漂白することなく信号対雑音比を最大化する。サンプルの上限と下限をZ次元に設定し、スタックの取得に進みます。スタック上で再構成アルゴリズムを実行して、超解決された再構成を取得します。
再構成で既知のアーティファクトを確認し、必要に応じてパラメータを調整して修正します。SIM再構成を広視野画像と比較して、解像度の向上を観察します。多色構造化照明顕微鏡を実行する場合は、満足のいく再構成の準備ができたら、アライメントアルゴリズムを使用して異なるチャンネルを正しく整列させます。
膜周期骨格中のアクチン環は、独特の周期的外観を有する。アクチンリングが見えるすべての焦点面を使用して、画像解析ソフトウェアで最大強度投影画像を作成します。最大強度投影画像に、目に見える隣接するリングに垂直な線を描き、ソフトウェアのラインプロットプロファイル機能とともに蛍光強度を記録します。
平均ピーク間距離を計算するには、ラインプロファイルの極大値をメモし、隣接する個々の蛍光強度ピーク間の距離を測定します。膜周期骨格にアクチン環を有する異なるタンパク質の共局在を評価するために、アクチンおよび候補タンパク質のSIM再構成について共局在解析手順を実行する。ソフトウェアプラットフォームの簡単な共局在化プラグインのために、軸索初期セグメントを関心領域として定義する選択を手動で描画し、分析を実行して共局在化のためのピアソンの相関係数を計算します。
SIM画像解析の間、画像スタックの再構成は、アクチン環の明確な周期性を示した。抗アンキリンG抗体を用いてアンキリンGを可視化し、ピアソンの相関係数を計算するために、共局在解析手順を用いて軸索初期セグメントにおいてアンキリンGとアクチン環の共局在を試験した。アンキリンGおよびアクチン環蛍光の共局在に対するピアソンの相関係数は0.36プラスマイナス0.03であった。
適切な浸漬オイルを使用し、レーザー出力と露光時間を調整してグリッド線を見えるようにすることが不可欠です。タンパク質が膜周期骨格の一部であると判断されると、膜周期骨格を維持する上でその機能を調査し、確立することができます。例えば、アクチン環に対するタンパク質をノックダウンすることの影響を分析することができる。
超解像顕微鏡技術の開発は、軸索初期セグメントがアクチン環、スペクトルおよびアンキリンからなる膜周期骨格を含むことを知っている理由である。SIMにより、研究者は膜周期骨格成分を簡単に視覚化し、生細胞内のアクチン環を見ることができます。
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概要
この研究は、培養されたラットの海馬ニューロンと3D構造化照明顕微鏡法（3D-SIM）を用いて軸索初期節の膜周期的スケルトンの中のアクチンリングを視覚化し測定するためのプロトコルを概説しています。この技術により、研究者はタンパク質の局在を調査し、膜周期的スケルトンの機能に関する理解を深めることができます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 顕微鏡技術
背景
- 軸索初期節はニューロンのシグナル伝達に重要です。
- アクチンリングは膜周期的スケルトンの維持に重要な役割を果たします。
- 構造化照明顕微鏡法は生物学的サンプルのイメージングの解像度を向上させます。
- タンパク質の局在を理解することで、その機能的役割への洞察が得られます。
研究目的
- 培養されたニューロンのアクチンリングのイメージングのための信頼性の高いプロトコルを確立すること。
- 膜周期的スケルトンの構成要素を解明すること。
- 軸索初期節における様々なタンパク質の重複分析を容易にすること。
使用された方法
- イメージングには3D構造化照明顕微鏡法を使用しました。
- 主要な生物学的モデルは培養されたラットの海馬ニューロンでした。
- テキストにはマルチオミクスワークフローの言及はありませんでした。
- 重要なステップには固定、抗体インキュベーション、イメージング準備が含まれていました。
- アクチンリングの周期性とタンパク質の重複を評価するためにイメージング分析が実行されました。
主な結果
- プロトコルにより、明確な周期性をもつアクチンリングの視覚化が可能になりました。
- アンキリンGとアクチンリングの重複が定量化され、ピアソンの相関係数は0.36 ± 0.03でした。
- アクチンリングの同定は膜周期的スケルトンにおけるその役割を支持しています。
- SIMは従来の広視野イメージング法と比較して明確な解像度の向上を可能にしました。
結論
- この研究はニューロンにおける膜周期的スケルトンの分析のための堅牢な方法を実証しています。
- 強化されたイメージング技術はニューロン細胞における細胞アーキテクチャの理解に貢献します。
- この研究からの洞察は、健康と疾病におけるニューロンタンパク質の機能とその意味の将来の探索のための基礎を築きます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding the structural organization of the axon initial segment's membrane periodic skeleton supports target validation in neuroscience drug discovery by clarifying the spatial context of ion channels and scaffolding proteins. This mechanistic insight enables predictive de-risking of therapeutic hypotheses related to neuronal excitability disorders. The method enhances confidence in target engagement studies by providing quantitative spatial data on protein localization within a disease-relevant subcellular compartment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving the nanoscale architecture of the axon initial segment membrane periodic skeleton.
- Operational Value: Provides a robust, accessible super-resolution method for validating target localization in neuronal models.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking through quantitative assessment of protein periodicity and colocalization with actin rings.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence intensity profiles and Pearson's correlation coefficients for assessing protein-actin ring spatial relationships.
- Operational Value: Delivers reproducible, standardized imaging workflows compatible with multi-well neuronal culture formats.
- Assay Readiness: Produces super-resolved reconstructions that enable reliable detection of subcellular protein localization patterns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links molecular target localization to functional maintenance of the membrane periodic skeleton in a disease-relevant neuronal system.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether candidate proteins are structural components of the axon initial scaffold, informing target selection for neuropsychiatric indications.
- Predictive Confidence: Supports go/no-go decisions by determining if a protein is part of the periodic skeleton prior to functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through subcellular resolution and enabling progression to mechanistic studies in neuronal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by determining if a protein exhibits periodic localization consistent with membrane periodic skeleton integration.
- Screening: Enables assay development for high-content analysis of protein localization patterns in fixed neuronal cultures.
- Analytics: Provides quantitative readouts including inter-peak distance measurements and colocalization coefficients for objective comparison across conditions.
- Translational Research: Connects molecular findings to structural integrity of the axon initial segment, a key determinant of neuronal polarity and signaling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple targets across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by defining the nanoscale spatial organization of axon initial segment proteins.
- Operational Value: Offers ease of use and robustness, requiring only standard fluorescence microscopy experience and accessible super-resolution instrumentation.
- Strategic Value: Improves target selection confidence by validating subcellular localization before investing in functional assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their integration into the axon initial segment scaffold.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and super-resolution imaging principles.
- Dependent on access to 3D-SIM instrumentation and appropriate immersion oil optimization.
- Necessitates standardized antibody validation and blocking conditions to minimize nonspecific signal.
- Involves careful laser power and exposure calibration to balance signal-to-noise ratio with photobleaching.
- Applicable primarily to fixed neuronal cultures; live-cell applications require additional validation.
