Name: 2光子顕微鏡を使用して、糸球体プロセスに対する慢性片側尿管閉塞の影響を定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 学ぶ2光子顕微鏡を用いた糸球体プロセスの定量化法。ラットの慢性片側尿管閉塞による腎機能・炎症・線維化の影響をリアルタイムで観察し、細胞動態と病態生理機序を解明する革新的なイメージング技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所助成金RO1DK091623およびP30DK079312(BAMへ)の支援を受けました。ナノストリング分析を実施してくれたミシガン州立大学の研究技術支援施設(RTSF)のゲノミクスコアファシリティのスタッフに感謝します。

<ol><li>Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Indiana+O%27Brien+center+for+advanced+renal+microscopic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Indiana O'Brien center for advanced renal microscopic analysis.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 320 (5), 671-682 (2021).</li>
<li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 283 (3), 905-916 (2002).</li>
<li>Eisenbach, G., Liew, J., Boylan, J., Manz, N., Muir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+angiotensin+on+the+filtration+of+protein+in+the+rat+kidney%3A+a+micropuncture+study%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Effect of angiotensin on the filtration of protein in the rat kidney: a micropuncture study.</a> Kidney International. 8 (2), 80-87 (1975).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A., Palygin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+imaging+and+microscopy+for+dynamic+processes+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent imaging and microscopy for dynamic processes in rats.</a> Methods in Molecular Biology. 2018, 151-175 (2019).</li>
<li>Huber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+functional+podocin-nephrin+complex%3A+mutations+in+the+NPHS2+gene+disrupt+nephrin+targeting+to+lipid+raft+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the functional podocin-nephrin complex: mutations in the NPHS2 gene disrupt nephrin targeting to lipid raft microdomains.</a> Human Molecular Genetics. 12 (24), 3397-3405 (2003).</li>
<li>Kawachi, H., Koike, H., Kurihara, H., Sakai, T., Shimizu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+rat+homologue+of+podocin%3A+expression+in+proteinuric+states+and+in+developing+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology+JASN%22%5BJournal%5D)">Cloning of rat homologue of podocin: expression in proteinuric states and in developing glomeruli.</a> Journal of the American Society of Nephrology JASN. 14 (1), 46-56 (2003).</li>
<li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+glomerular+filtration+defect+and+severe+renal+disease+in+podocin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (2), 550-560 (2004).</li>
<li>Schießl, I., Bardehle, S., Castrop, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+nephrons+in+BALB%2Fc+and+C57BL%2F6+mice+facilitate+in+vivo+multiphoton+microscopy+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Superficial nephrons in BALB/c and C57BL/6 mice facilitate in vivo multiphoton microscopy of the kidney.</a> PloS One. 8 (1), 52499(2013).</li>
<li>Chevalier, R., Forbes, M., Thornhill, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureteral+obstruction+as+a+model+of+renal+interstitial+fibrosis+and+obstructive+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy.</a> Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).</li>
<li>Forbes, M., Thornhill, B., Chevalier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximal+tubular+injury+and+rapid+formation+of+atubular+glomeruli+in+mice+with+unilateral+ureteral+obstruction%3A+a+new+look+at+an+old+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Proximal tubular injury and rapid formation of atubular glomeruli in mice with unilateral ureteral obstruction: a new look at an old model.</a> American Journal of Physiology. Renal physiology. 301 (1), 110-117 (2011).</li>
<li>Yang, H. -C., Zuo, Y., Fogo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today.+Disease+Models%22%5BJournal%5D)">Models of chronic kidney disease.</a> Drug Discovery Today. Disease Models. 7 (1-2), 13-19 (2010).</li>
<li>Hackl, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+fate+of+glomerular+epithelial+cells+in+vivo+using+serial+multiphoton+imaging+in+new+mouse+models+with+fluorescent+lineage+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking the fate of glomerular epithelial cells in vivo using serial multiphoton imaging in new mouse models with fluorescent lineage tags.</a> Nature Medicine. 19 (12), 1661-1666 (2013).</li>
<li>Kitching, A., Kuligowski, M., Hickey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+leukocyte+recruitment+to+glomeruli+in+mice+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of leukocyte recruitment to glomeruli in mice using intravital microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 466, 109-117 (2009).</li>
<li>Savin, V. J., Terreros, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filtration+in+single+isolated+mammalian+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Filtration in single isolated mammalian glomeruli.</a> Kidney International. 20 (2), 188-197 (1981).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).</li>
<li>El Karoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+stress+drives+proteinuria-induced+kidney+lesions+via+Lipocalin+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum stress drives proteinuria-induced kidney lesions via Lipocalin 2.</a> Nature Communications. 7, 10330(2016).</li>
<li>VA, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+measurements+of+gene+signatures+in+different+analytes+using+the+Nanostring+nCounter+Assay+System%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Multiplexed measurements of gene signatures in different analytes using the Nanostring nCounter Assay System.</a> BMC Research Notes. 2, 80(2009).</li>
<li>Springer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+transcriptome+and+bioinformatics+approach+to+unilateral+ureteral+obstructive+uropathy+in+the+fetal+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">A combined transcriptome and bioinformatics approach to unilateral ureteral obstructive uropathy in the fetal sheep model.</a> The Journal of Urology. 187 (2), 751-756 (2012).</li>
<li>Braun, F., Becker, J., Brinkkoetter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+or+let+die%3A+Is+there+any+cell+death+in+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Live or let die: Is there any cell death in podocytes.</a> Seminars in Nephrology. 36 (3), 208-219 (2016).</li>
<li>Kim, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+angiopoietin-1+in+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Electrolyte+%26+Blood+Pressure+E+%26+BP%22%5BJournal%5D)">The role of angiopoietin-1 in kidney disease.</a> Electrolyte & Blood Pressure E & BP. 6 (1), 22-26 (2008).</li>
<li>Liu, F., Zhuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+receptor+tyrosine+kinase+signaling+in+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of receptor tyrosine kinase signaling in renal fibrosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (5), 972(2016).</li>
<li>Martini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+biology+identifies+shared+transcriptional+networks+in+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Integrative biology identifies shared transcriptional networks in CKD.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 25 (11), 2559-2572 (2014).</li>
<li>Mühlberger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+bioinformatics+analysis+of+proteins+associated+with+the+cardiorenal+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Integrative bioinformatics analysis of proteins associated with the cardiorenal syndrome.</a> International Journal of Nephrology. 2011, 809378(2010).</li>
<li>Satirapoj, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periostin%3A+novel+tissue+and+urinary+biomarker+of+progressive+renal+injury+induces+a+coordinated+mesenchymal+phenotype+in+tubular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%2C+Dialysis%2C+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Periostin: novel tissue and urinary biomarker of progressive renal injury induces a coordinated mesenchymal phenotype in tubular cells.</a> Nephrology, Dialysis, Transplantation. 27 (7), 2702-2711 (2012).</li>
<li>Fengxin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+contributes+to+renal+fibrosis+by+promoting+tubular+epithelial+cell+cycle+arrest+at+G2%2FM%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Numb contributes to renal fibrosis by promoting tubular epithelial cell cycle arrest at G2/M.</a> Oncotarget. 7 (18), 25604-25619 (2016).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+glomerular+permeability+of+fluorescent+macromolecules+using+2-photon+microscopy+in+Munich+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in Munich Wistar rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (74), e50052(2013).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (3), 489-494 (2009).</li>
<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+normal+kidney+filters+nephrotic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells%3A+retrieval+is+disrupted+in+nephrotic+states%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The normal kidney filters nephrotic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells: retrieval is disrupted in nephrotic states.</a> Kidney International. 71 (6), 504-513 (2007).</li>
<li>Sandoval, R. M., Wang, E., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+bottom+and+using+it%3A+Offsets+and+sensitivity+in+the+detection+of+low+intensity+values+in+vivo+with+2-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Finding the bottom and using it: Offsets and sensitivity in the detection of low intensity values in vivo with 2-photon microscopy.</a> Intravital. 2 (1), 23674(2014).</li>
<li>Kuligowski, M. P., Kitching, A. R., Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+recruitment+to+the+inflamed+glomerulus%3A+a+critical+role+for+platelet-derived+P-selectin+in+the+absence+of+rolling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte recruitment to the inflamed glomerulus: a critical role for platelet-derived P-selectin in the absence of rolling.</a> Journal of Immunology. 176 (11), 6991-6999 (2006).</li>
<li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nature Medicine. 19 (1), 107-112 (2013).</li>
<li>Finsterbusch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patrolling+monocytes+promote+intravascular+neutrophil+activation+and+glomerular+injury+in+the+acutely+inflamed+glomerulus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Patrolling monocytes promote intravascular neutrophil activation and glomerular injury in the acutely inflamed glomerulus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (35), 5172-5181 (2016).</li>
<li>Shroff, U. N., Gyarmati, G., Izuhara, A., Deepak, S., Peti-Peterdi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+view+of+macula+densa+cell+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">A new view of macula densa cell protein synthesis.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (6), 689-704 (2021).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

糸球体生理学の研究は、多くの異なるアプローチ、特にマイクロパンクチャーの使用、孤立した糸球体の灌流、および顕微鏡検査を見てきました。ミュンヘンWistarラット、FromterおよびSimonsen株における表面糸球体の利用可能性は、 in vivo 動的研究を可能にした。この技術を採用する研究者にとって重要な注意点の1つは、組織内の自己蛍光が一貫しているように、研究間で一貫した画像を維持するために取得パラメータを設定する必要があることです。デュアルパスフルオレセイン/ローダミン落射蛍光キューブを利用し、ゲイン設定を緑と赤の発光チャンネルに調整して、接眼レンズを通して見られるものをコンピューター画面上で模倣することで、異なる顕微鏡システム間でも自家蛍光で一貫したカラーシグネチャが保証されます。
Fromter株は、総糸球体数が減少し、~75%正常であり、男性は12週齢頃に高血圧を自発的に発症し、進行性のタンパク尿とそれに続く限局性糸球体硬化症を伴い、最終的には腎不全で死亡するため、広く使用されています12。これらのラットの使用と、光毒性の低減、浸透深度の改善、および複数の蛍光プローブを同時に観察できる2光子顕微鏡の追加により、新しい発見への道が開かれました1,4,5。コンピュータのハードウェアとソフトウェアの開発により、定量データは現在、すべての2光子実験室の標準となっています。複数の定量的手法が開発され、生理学的および疾患条件下での糸球体、近位尿細管、血管、および間質プロセスに適用されています1、4、5、27、28、29、30。
トランスジェニックマウス生成施設は、腎臓の生理学と病理学の研究に新しい次元を追加し、これが2光子顕微鏡と組み合わされて、腎臓の構造と機能における特定の遺伝子産物の重要性をさらに明らかにするのは時間の問題でした。しかし、マウス糸球体は、非常に若いマウスを除いて、腎臓の表面から100μm以上に位置しています9。二光子顕微鏡は、分解能として20〜50μmの深さで行うのが最適であり、その後、放出された光の光散乱とヘモグロビンとの相互作用からの吸収により、蛍光強度が急速に減少します。そのため、表面糸球体を誘導する必要があった。一般的に使用されるアプローチは、12週間の長期の片側閉塞モデルです。これらのモデルではベースラインの決定ができないため、UUOの効果を調査中のプロセスから分離することはできません。
MWFラットを使用して、ベースライン糸球体機能を次のUUOと比較することができます。このUUOモデルは、炎症と急速な線維症を誘発することが知られており、CKDと線維症の研究に使用されています10、11、12。予想通り、MWFラットとSDラットの両方で表面糸球体が増加しました。さらに、MWFラットとSDラットについてUUO後に得られた定量結果は非常に同等でした。ここで記録された血流の減少は、UUO後の顕微鏡データと微小穿刺データ3を比較して以前に報告されていました。また、尿細管組織像と間質組織像が著しく変化し、PTはほとんど機能せず、ここで報告されているように、アルブミンエンドサイトーシスが不足していることもよく知られていました。図2および図3の研究は、糸球体および尿細管周囲毛細血管における赤血球体流量の劇的な減少とWBC接着の増強を示しています。流量の減少は、WBC接着およびルーロー形成による毛細管閉塞による可能性が高い。
炎症をさらに評価するために、アルブミン透過性を定量化し、10倍に増加することを示しました。さらに、単離された糸球体は、さまざまな腎臓病状態における腎臓炎症で増加することが以前に知られている多くの遺伝子のmRNA発現が増加したことを示しました17、19、20、21、22、23、24、25、26.糸球体表面密度とアルブミン透過性の増加は、12週間のUUOデータによって示されるように、進行性であった。本データは、糸球体がUUOモデルにおいて著しい構造的損傷、炎症、および分子変化を受けることを直接示した最初のデータである。結果は、UUO後の羊腎臓生検を分析した腎臓組織全体の以前の研究と一致しており、複数の炎症マーカーが上昇していることを発見しました19。本結果は、以前は皮質組織についてのみ知られていた糸球体内に顕著な炎症が存在することを示している。
現在のデータは、12週間後のヒドロネフローゼと正常な糸球体の間で接着分子発現、補体沈着、および好中球浸潤に変化が見られなかったマウスでの以前の研究とは異なります31。さらに、ヒッキー研究所は、マウスの糸球体における免疫反応を研究するために12週間のUUOモデルを使用しました。彼らは、4週齢のマウス糸球体と閉塞後糸球体の間で好中球の浸潤に違いは見られませんでした32,33。これらの後の研究は、閉塞した腎臓の骨盤から尿が排出された後に実施されました。閉塞の原因となる体液を人工的に除去することなく、生体内の糸球体機能に対するUUOの効果を決定したかったため、これを行いませんでした。最後に、マウスでのUUOの使用は、表面下100μmを超える糸球体のイメージングに置き換えられています。可能ですが、分解能と強度のトレードオフがあり、50 μm34を超えるとどちらも大幅に低下します。
提示された結果は、組織学的変化、管状糸球体の形成、炎症、線維症、血行動態に関する既存の文献からのデータを1つまとめても驚くべきことではありません10,11,12。WBC接着、ルーロー形成、糸球体分子炎症マーカー、アルブミン透過性の増加など、提示されたデータは、このUUOモデルで5週間でも進行中であり、12週間でも存在する広範な炎症をさらに示しています。明らかに、慢性UUOは生理学的状態ではなく、表面糸球体を誘導するためのUUOの使用は傷害モデルを表しています。生理学的条件下で表面糸球体を有するMWFラットは、損傷が発生するにつれて縦断的に研究することができる。トランスジェニックラットを生成することは可能であり、多くの研究者が特定の質問をするためにバイオセンサーを使用してそれらを作成しています。特に、ウィスコンシン医科大学は現在、MWFラットのコロニーを持っており、生理学的および病理学的条件下で糸球体プロセスを研究する目的でトランスジェニックラットを製造しています。これらのMWFラットは、正常、罹患、および遺伝子組み換えラットの糸球体プロセスを研究する絶好の機会を提供します。

糸球体プロセス、特に足細胞生物学を理解することは、50年以上の目標でした。表面糸球体を有するミュンヘンWistarラットは、生理学的および病理学的プロセスの多くの側面を理解するために、マイクロパンクチャー研究を含むこれらの研究において中心的な役割を果たしてきました1,2,3。糸球体成分を生体内に研究するための顕微鏡法の利用は、この毒性曝露を最小限に抑え、浸透深さを増加させる2光子顕微鏡法の出現まで、光毒性の影響のために制限されていました1,2。コンピュータのハードウェアとソフトウェアの急速な進歩に加えて、これにより、単一の設定で何時間もの3次元(3D)および4次元(時間)の研究が可能になりました1,4,5。
糸球体毛細血管血流の定量化、薬物に応答した血管収縮および拡張、透過性、ならびに透過性および炎症に対する電荷の影響は、研究されてきた糸球体プロセスのほんの一部です。さらに、近位尿細管のS1セグメントが識別可能であり、S1およびS2尿細管上皮の挙動の違いを定量化することができる1,4。マウスでの研究は、特にマウストランスジェニック施設の普遍的な利用可能性により、糸球体疾患プロセスの分子生物学の理解に急速な進歩をもたらしました。個々のタンパク質は、特にタンパク尿に関して、ノックアウト研究における糸球体機能障害の原因です6,7,8。しかし、糸球体イメージング研究のためのマウスモデルの利用は、研究された多数の系統において糸球体が表面から100μm以上下にあるため、制限されていました9。
これにより、研究者はマウスモデルを開発および利用し、研究可能な表面糸球体をもたらしました。最も一般的なモデルは、完全なUUO10,11,12の使用です。延長されたUUO期間の終わりに、マウス腎臓には多数の表面糸球体が存在し、研究することができ、研究されている13,14。これらのマウス研究では、糸球体生物学に対する長期UUOの影響を決定するためのベースラインまたは対照研究はありませんでした。.これは急速な線維症と皮質破壊をもたらす重度で長期にわたる損傷モデルであるため10,11,12、糸球体のプロセスと機能に影響を与えると仮定しました。この質問に答えるために、表面糸球体を有するミュンヘンウィスターフロムター(MWF)ラットを使用して対照/ベースラインパラメータを研究し、ベースライン所見を5週間のUUO後のMWFラットの糸球体研究と比較しました。また、UUO後に表面糸球体を持たないSprague Dawley(SD)ラットについても研究しました。この知見は、MWFラットとSDラットのUUOを5週間投与すると、実際に表面糸球体の数が増加することを示している。しかし、これらは糸球体の血流、炎症、および高分子の透過性とサイズに著しい変化を伴う異常な糸球体でした。

<table><tbody><tr><td>70 & マイクロ;m 滅菌セルストレーナー</td><td>Corning</td><td>#421751</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;m 滅菌細胞ストレーナー</td><td>Corning</td><td>#421752</td><td></td></tr><tr><td>CA マイクロハサミ モデル 1C300</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>Cat# 72930</td><td></td></tr><tr><td>電気加熱パッド</td><td>サンビーム</td><td>クローガー</td><td></td></tr><tr><td>ハンドリング鉗子</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>Cat# 72962</td><td></td></tr><tr><td>ケリー止血鉗子 (ストレート)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>Cat#72930</td><td></td></tr><tr><td>ライカダイブ SP-8 マルチフォトン倒立顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>注: バージョン 7.1r1</td><td></td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee チタンサファイアレーザー</td><td>スペクトル物理学</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>メイヨー 解剖ハサミ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>Cat# 78180-1C3</td><td></td></tr><tr><td>メタモルフ 画像処理ソフトウェア</td><td>分子動力学</td><td>Cat# 78266-04</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corportation</td><td>2007 バージョン</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RNA Assay Kit</td><td>Invitrogen/ThermoFisher</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>Reptitherm アンダータンクヒーター</td><td>Zoomed</td><td>Amazon</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup Kit (Spin columns)</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RPE buffer</td><td>Qiagen</td><td>1018013</td><td></td></tr><tr><td>Strate-Line Autoclave Tape</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 11-889-1</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagent</td><td>Sigma</td><td>T9424</td><td></td></tr><tr><td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Cat# 70665-07</td><td></td></tr></tbody></table>

2光子顕微鏡を使用して、糸球体プロセスに対する慢性片側尿管閉塞の影響を定量化

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

腎臓の動的生理機能を探索するために、適切な動物疾患モデルに新しい顕微鏡法を適用することは依然として課題です。表面糸球体を有するラットは、生体内2光子顕微鏡を使用して生理学的および病態生理学的プロセスを調査するユニークな機会を提供します。糸球体毛細血管血流の定量化、および薬物、透過性、および炎症に応答した血管収縮および拡張は、研究できるプロセスのほんの一部です。さらに、トランスジェニックラット、すなわち蛍光色素および他の分子バイオマーカーアプローチで標識された足細胞は、タンパク質間相互作用および特定の分子変化の影響を直接監視および定量するためのより高い分解能を提供する。
生後4週間後に表面糸球体が欠損するマウスでは、数週間の片側尿管閉塞(UUO)を使用して表面糸球体を誘導しています。この誘導モデルではベースライン研究ができないため、生理学的条件下で表面糸球体を有するミュンヘンヴィスターフレムター(MWF)ラットのUUOモデルで糸球体プロセスに対するUUOの効果を定量化しました。5週間以上のUUOモデルは、総腎形態、尿細管周囲および糸球体微小血管系、ならびに尿細管上皮の構造および機能に有意な変化を誘発した。糸球体および尿細管周囲赤血球(RBC)の流れは、おそらく糸球体および尿細管周囲毛細血管内の白血球(WBC)の付着の有意な増加により、有意に減少しました(p < 0.01)。アルブミンの糸球体ふるい係数は、未処理のMWFの0.015±0.002から5週齢のUUO MWFラットの0.045±0.05に増加しました。UUOを12週間投与すると、アルブミンの表面糸球体密度と糸球体ふるい係数(GSC)がさらに増加しました。糸球体全体でろ過された蛍光アルブミンは、近位尿細管に再吸収されませんでした。これらのデータは、UUOを使用して表面糸球体を誘導すると、正常な糸球体プロセスと疾患の変化を研究および解釈する能力が制限されることを示唆しています。

ここでは、表面糸球体を有するミュンヘンWistar Fromterラットにおける2光子顕微鏡を使用して、糸球体の動態と機能に対する長期の尿管閉塞の影響を定量化するプロトコルを紹介します。

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

この研究で提示されたデータでは、腎機能、炎症、および線維症に対する片側尿管閉塞の劇的な影響を示しています。片側尿管閉塞の病態生理学的メカニズムを理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞間相互作用、細胞内イベントを研究し、機能している腎臓内で構造と機能を動的に関連付けることができることです。尿管手術のデモンストレーションは、私たちの研究室の外科医であるシルビアカンポスビルダーバック博士によって行われます。まず、ラットに麻酔をかけ、正中線に沿って切開を行い、左腎臓を見つけて周囲の腹膜器官から分離します。腎動脈、腎静脈、尿管を含む腎茎を見つけた後、繊細な構造を損傷することなく尿管を分離します。鉗子を使用して、尿管の周りに3-0縫合糸をループして結び、次に最初の結び目の両側に数ミリメートルの結び目を結び、完全な閉塞を保証します。尿管が結ばれたら、連続する筋肉層を慎重に閉じてから、腹部を完全に閉じます。外科用ステープルで外皮を閉じます。外科的準備のために、麻酔をかけたラットを静脈アクセスラインを横に置き、剃毛した左脇腹をテーブルの上に平らにまっすぐに向けます。ラットの前足が後足と同様に互いに接触していることを確認してください。ラットの位置が決まったら、肋骨のすぐ下の左脇腹を触診して腎臓を感じ、腹部の自然な位置を決定し、剃毛された領域に沿って永久マーカーを使用して線を引き、腎臓の中心を鼻から尾の方向に二等分します。一対の歯付き鉗子を使用して皮膚をつかんで上に持ち上げ、一対の止血剤で永久マーカーラインをつまんで、下にある血管系を押しつぶし、出血を防ぎます。出血を最小限に抑えるために、薄い外側の筋肉層に対して手順を繰り返します。薄い内腹筋層を最終的に切開するには、腎臓を触診してサイズと位置を推定し、鉗子で内筋層を持ち上げてから、腎臓の推定サイズの約1/3の止血剤で腎臓の上の皮膚を二等分する線を押しつぶします。鉗子で筋肉層のグリップを維持しながら、最後の切開を行います。次に、両手で鉗子を使用して、腎臓の下極にある腎臓脂肪を握り、下向きに機能するハンドオーバーハンドテクニックで保持します。片手で脂肪をしっかりと握り、脂肪を引っ張り、切開部から腎臓を非常に穏やかに絞ります。腎臓が通過しない場合は、切開部を簡単に広げます。毛細血管ループに留まった白血球または白血球を特定するには、留置静脈アクセスラインを介してラット体重1キログラムあたり8マイクログラムのHoechst 33342核染色を投与します。顕微鏡では、露出した腎臓を皿の端に少し回転させて置き、腎臓の腹側がカバースリップに接触し、背側が端から反対側を向くようにします。動きをさらに最小限に抑えるために、生理食塩水で湿らせた2つの滅菌2x2ガーゼパッドを腎臓の背側に詰めて、腎臓の腹部側の端との接触を強化します。サンプルを配置したら、デュアルパスローダミンFITCキューブを使用して、落射蛍光照明下で顕微鏡接眼レンズを通して見ます。サンプル位置で動きが検出された場合は、ガーゼが腎臓の下に押し込まれないように調整して微調整します。胸部が皿からさらに離れるように、ラットを少し転がします。落射蛍光照明を使用して腎臓の表面をスキャンし、電動ステージコントローラーに関連するソフトウェアを使用して糸球体の位置をマークします。2光子照明下の各カラーチャネルについて、背景画像として機能するために、マークされた各糸球体の上部の浅い3Dボリュームを取ります。イメージングソフトウェアの表示オプションで、疑似カラーパレットを使用して、糸球体毛細血管ループのバックグラウンド蛍光のかすかな強度を視覚化します。表在血管を焦点として、蛍光Texas Red RAP血清アルブミンまたはTRRSAをゆっくりと注入し、尿細管周囲血管系および毛細血管ループの強度が飽和度をわずかに下回るまで、全身分布による蛍光の上昇と下降を観察します。10分後、マークおよび画像化されたすべての糸球体の3Dボリュームを1マイクロメートル間隔で取得します。キャピラリーループまたは管周囲血管のいずれかの適切な容器を見つけ、画像取得ソフトウェアのラインスキャン機能では血管が垂直である必要があるため、回転機能を使用して画像を回転させます。容器が回転して平らになったら、[取得]メニューのXT機能を選択し、4, 000行をスキャンするように設定します。焦点面をセグメントの最大直径にして、検査する容器を横切る線を配置します。次に、カラー合成画像を左クリックし、[スナップショットの取得]タブを選択して、ラインスキャンが撮影された領域の参照画像を生成します。すぐに[開始]ボタンをクリックして、船舶のラインスキャンをキャプチャします。その後、ラインスキャンを画像処理ソフトウェアにインポートして、RBC流量を決定します。[計測]ドロップダウンメニューで、[領域統計の表示]ダイアログボックスを開き、[単一線描画]ツールを選択して、RBCシャドウの勾配に一致する線を描画します。線の幅と高さをメモした後、方程式を使用して速度を計算し、平均5回の計算を取得して、各線スキャンの速度を報告します。糸球体をイメージングフィールドの中心に配置し、糸球体表面から始まり30〜35マイクロメートルで終わる3Dデータセットを取得します。Z 方向に 1 マイクロメートルのステップ サイズを使用します。毛細管ループ内の赤色色素と対応する核染色の排除を探すことにより、青色ヘキストチャネルとテキサスレッドアルブミンチャネルを比較することにより、WBCを特定します。WBCが3つの光学切片にわたって静止しているように見える場合は、細胞を接着として定義し、1マイクロメートル間隔で撮影した糸球体の上部から10個の光学切片あたりの発生として値を報告します。ミュンヘンウィスターフロムターまたはMWFラットのフィールドあたりの糸球体の数は、未処理のラットよりも5週間のUUOグループで増加しました。.Sprague-Dawleyラット、またはSDラットは、片側尿管閉塞の5週間後に、表面糸球体がない状態から野あたり2.02に変化しました。腎表面を見るために3次元再構成画像が観察された。SDラットの5週間の片側尿路閉塞は、MWFで見られるような正常な尿細管上皮に似た領域をもたらさず、未治療で、部分的に5週間のUUO MWFラットで見られました。.腎血管動態の研究では、腎血流は、未処置ラットと比較して、5週間のUUO MWFおよびSD群で有意に減少した。糸球体毛細血管ループ内のRBC速度は、未処理のMWFラットと比較して、5週間のUUO MWFおよびSDラットで有意に低下した。さらに、未治療のMWFラットは、上から10個の光学切片あたりのWBCが少なかったのに対し、5週間のUUO MWFラットと5週間のUUO SDラットでは数が増加しました。片側尿路閉塞では、アルブミン透過性の増加が見られました。ボーマン腔内のアルブミン蓄積は、片側尿路閉塞後に強烈でした。S1セグメントは未処置のMWFラットにおける生理学的条件下で観察されるような大量のアルブミンのエンドサイトーシスである。同じ取り込みは、5週間の片側尿路閉塞後のMWFまたはSDラットでは見られませんでした。.経時的にプロセスを研究するための繰り返しイメージング、イメージングのための特定の領域の固定、およびその後の固定された組織の利用など、より高解像度の顕微鏡検査を実行するための多くの異なる方法をこの技術と組み合わせて行うことができます。この手法は破壊的技術と見なされます。これにより、調査員は多くの新しい質問に答えることができます。そうすることで、新しい洞察が提供され、パラダイムシフトデータが得られました。

using-2-photon-microscopy-to-quantify-effects-chronic-unilateral

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

このビデオでは、片側尿管閉塞マウスモデルを生成する手順を示しています。この手順では、マウスの尿管の1つを切断して尿の流れを遮断します。...

片側尿管閉塞マウスモデル:マウスモデルにおける腎臓からの尿の流れを遮断する外科的処置

技術が直接表面糸球体でgloemrularろ過を視覚化し、定量化するために、高解像度intavital...

ミュンヘンWistar系ラットにおける2光子顕微鏡を用いた蛍光高分子の糸球体透過性を定量化

不可逆的な片側性尿管閉塞(UUO)のマウスモデルは、切断された尿管が膀胱内に吻合することによって尿管閉塞が緩和される可逆的なUUOのモデルとともに提示されます。これらのモデルにより、腎臓の炎症や瘢痕化、組織のリモデリングの研究が可能になります。...

不可逆とリバーシブル片側尿管閉塞のマウスモデル

このプロトコルでは、糸球体疾患のマウス ・...

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

腎生理の 2 の基礎的な技法を組み合わせることボウマンのマウスの尿中領域内でマイクロ ピペットを配置する 2 光子顕微鏡の使用を提案します。2...

2 光子顕微鏡による促進マウス Bowman 腔のそれによって

抗体標識、光学クリアリング、および高度光顕微鏡検査の組み合わせにより、完全な構造または器官の3次元解析が可能になります。ここでは、厚い腎臓スライスの免疫標識、エチルシナメートによる光学クリアリング、および3次元腎臓構造の可視化と定量を可能にする共焦点イメージングを組み合わせる簡単な方法です。...

免疫標識腎組織の光学クリアリングとイメージング

一方的な尿管閉塞(UUO)を有するマウスの腎臓におけるマイクロRNA発現を定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を説明する。このプロトコルは、UUOを有するマウスおよび他の病理学的状態の文脈における腎臓マイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。...

一方的な尿管閉塞を有するマウス腎臓におけるマイクロRNA表現の定量リアルタイムPCR評価

本プロトコルは、単行尿管閉塞の段階的な再現可能なモデルを記述しています。...

可逆的片側尿管閉塞の未熟マウスモデル

このプロトコルは、マウスで片側尿管閉塞(UUO)を誘発する方法を説明しています...

腎臓間質性線維症を調査するための片側尿管閉塞モデル

この論文では、研究者がマウスで可逆的な片側性尿管閉塞を実施できるようにするための詳細な手順を提供します 標準化されたモデルを使用して、...

長期にわたる片側性尿管閉塞の回復後の長期的な構造的および機能的転帰を評価するためのマウスモデル

学ぶ2光子顕微鏡を用いた糸球体プロセスの定量化法。ラットの慢性片側尿管閉塞による腎機能・炎症・線維化の影響をリアルタイムで観察し、細胞動態と病態生理機序を解明する革新的なイメージング技術です。

2光子顕微鏡を使用して、糸球体プロセスに対する慢性片側尿管閉塞の影響を定量化

さらに動画を探す