2光子顕微鏡を使用して、糸球体プロセスに対する慢性片側尿管閉塞の影響を定量化

この研究で提示されたデータでは、腎機能、炎症、および線維症に対する片側尿管閉塞の劇的な影響を示しています。片側尿管閉塞の病態生理学的メカニズムを理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞間相互作用、細胞内イベントを研究し、機能している腎臓内で構造と機能を動的に関連付けることができることです。

尿管手術のデモンストレーションは、私たちの研究室の外科医であるシルビアカンポスビルダーバック博士によって行われます。まず、ラットに麻酔をかけ、正中線に沿って切開を行い、左腎臓を見つけて周囲の腹膜器官から分離します。腎動脈、腎静脈、尿管を含む腎茎を見つけた後、繊細な構造を損傷することなく尿管を分離します。

鉗子を使用して、尿管の周りに3-0縫合糸をループして結び、次に最初の結び目の両側に数ミリメートルの結び目を結び、完全な閉塞を保証します。尿管が結ばれたら、連続する筋肉層を慎重に閉じてから、腹部を完全に閉じます。外科用ステープルで外皮を閉じます。

外科的準備のために、麻酔をかけたラットを静脈アクセスラインを横に置き、剃毛した左脇腹をテーブルの上に平らにまっすぐに向けます。ラットの前足が後足と同様に互いに接触していることを確認してください。ラットの位置が決まったら、肋骨のすぐ下の左脇腹を触診して腎臓を感じ、腹部の自然な位置を決定し、剃毛された領域に沿って永久マーカーを使用して線を引き、腎臓の中心を鼻から尾の方向に二等分します。

一対の歯付き鉗子を使用して皮膚をつかんで上に持ち上げ、一対の止血剤で永久マーカーラインをつまんで、下にある血管系を押しつぶし、出血を防ぎます。出血を最小限に抑えるために、薄い外側の筋肉層に対して手順を繰り返します。薄い内腹筋層を最終的に切開するには、腎臓を触診してサイズと位置を推定し、鉗子で内筋層を持ち上げてから、腎臓の推定サイズの約1/3の止血剤で腎臓の上の皮膚を二等分する線を押しつぶします。

鉗子で筋肉層のグリップを維持しながら、最後の切開を行います。次に、両手で鉗子を使用して、腎臓の下極にある腎臓脂肪を握り、下向きに機能するハンドオーバーハンドテクニックで保持します。片手で脂肪をしっかりと握り、脂肪を引っ張り、切開部から腎臓を非常に穏やかに絞ります。

腎臓が通過しない場合は、切開部を簡単に広げます。毛細血管ループに留まった白血球または白血球を特定するには、留置静脈アクセスラインを介してラット体重1キログラムあたり8マイクログラムのHoechst 33342核染色を投与します。顕微鏡では、露出した腎臓を皿の端に少し回転させて置き、腎臓の腹側がカバースリップに接触し、背側が端から反対側を向くようにします。

動きをさらに最小限に抑えるために、生理食塩水で湿らせた2つの滅菌2x2ガーゼパッドを腎臓の背側に詰めて、腎臓の腹部側の端との接触を強化します。サンプルを配置したら、デュアルパスローダミンFITCキューブを使用して、落射蛍光照明下で顕微鏡接眼レンズを通して見ます。サンプル位置で動きが検出された場合は、ガーゼが腎臓の下に押し込まれないように調整して微調整します。

胸部が皿からさらに離れるように、ラットを少し転がします。落射蛍光照明を使用して腎臓の表面をスキャンし、電動ステージコントローラーに関連するソフトウェアを使用して糸球体の位置をマークします。2光子照明下の各カラーチャネルについて、背景画像として機能するために、マークされた各糸球体の上部の浅い3Dボリュームを取ります。

イメージングソフトウェアの表示オプションで、疑似カラーパレットを使用して、糸球体毛細血管ループのバックグラウンド蛍光のかすかな強度を視覚化します。表在血管を焦点として、蛍光Texas Red RAP血清アルブミンまたはTRRSAをゆっくりと注入し、尿細管周囲血管系および毛細血管ループの強度が飽和度をわずかに下回るまで、全身分布による蛍光の上昇と下降を観察します。10分後、マークおよび画像化されたすべての糸球体の3Dボリュームを1マイクロメートル間隔で取得します。

キャピラリーループまたは管周囲血管のいずれかの適切な容器を見つけ、画像取得ソフトウェアのラインスキャン機能では血管が垂直である必要があるため、回転機能を使用して画像を回転させます。容器が回転して平らになったら、[取得]メニューのXT機能を選択し、4, 000行をスキャンするように設定します。焦点面をセグメントの最大直径にして、検査する容器を横切る線を配置します。

次に、カラー合成画像を左クリックし、[スナップショットの取得]タブを選択して、ラインスキャンが撮影された領域の参照画像を生成します。すぐに[開始]ボタンをクリックして、船舶のラインスキャンをキャプチャします。その後、ラインスキャンを画像処理ソフトウェアにインポートして、RBC流量を決定します。

[計測]ドロップダウンメニューで、[領域統計の表示]ダイアログボックスを開き、[単一線描画]ツールを選択して、RBCシャドウの勾配に一致する線を描画します。線の幅と高さをメモした後、方程式を使用して速度を計算し、平均5回の計算を取得して、各線スキャンの速度を報告します。糸球体をイメージングフィールドの中心に配置し、糸球体表面から始まり30〜35マイクロメートルで終わる3Dデータセットを取得します。

Z 方向に 1 マイクロメートルのステップ サイズを使用します。毛細管ループ内の赤色色素と対応する核染色の排除を探すことにより、青色ヘキストチャネルとテキサスレッドアルブミンチャネルを比較することにより、WBCを特定します。WBCが3つの光学切片にわたって静止しているように見える場合は、細胞を接着として定義し、1マイクロメートル間隔で撮影した糸球体の上部から10個の光学切片あたりの発生として値を報告します。

ミュンヘンウィスターフロムターまたはMWFラットのフィールドあたりの糸球体の数は、未処理のラットよりも5週間のUUOグループで増加しました。.Sprague-Dawleyラット、またはSDラットは、片側尿管閉塞の5週間後に、表面糸球体がない状態から野あたり2.02に変化しました。腎表面を見るために3次元再構成画像が観察された。

SDラットの5週間の片側尿路閉塞は、MWFで見られるような正常な尿細管上皮に似た領域をもたらさず、未治療で、部分的に5週間のUUO MWFラットで見られました。.腎血管動態の研究では、腎血流は、未処置ラットと比較して、5週間のUUO MWFおよびSD群で有意に減少した。糸球体毛細血管ループ内のRBC速度は、未処理のMWFラットと比較して、5週間のUUO MWFおよびSDラットで有意に低下した。

さらに、未治療のMWFラットは、上から10個の光学切片あたりのWBCが少なかったのに対し、5週間のUUO MWFラットと5週間のUUO SDラットでは数が増加しました。片側尿路閉塞では、アルブミン透過性の増加が見られました。ボーマン腔内のアルブミン蓄積は、片側尿路閉塞後に強烈でした。

S1セグメントは未処置のMWFラットにおける生理学的条件下で観察されるような大量のアルブミンのエンドサイトーシスである。同じ取り込みは、5週間の片側尿路閉塞後のMWFまたはSDラットでは見られませんでした。.経時的にプロセスを研究するための繰り返しイメージング、イメージングのための特定の領域の固定、およびその後の固定された組織の利用など、より高解像度の顕微鏡検査を実行するための多くの異なる方法をこの技術と組み合わせて行うことができます。

この手法は破壊的技術と見なされます。これにより、調査員は多くの新しい質問に答えることができます。そうすることで、新しい洞察が提供され、パラダイムシフトデータが得られました。