Name: 豚腎臓およびマウス肝臓からのFAHD1タンパク質の抽出および精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学ぶ FAHD1タンパク質の抽出・精製法。豚腎臓とマウス肝臓から生理学的形態を保持したまま抽出し、抗体開発や酵素機能研究に応用可能な生化学的手法を解説します。

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著者らは、Ayse ÖztürkとEva Albertiniによる技術支援に非常に感謝しています。肝臓組織の生成に用いたマウスは、大学-Dozの監督下で維持した。Pidder Jansen-Dürr博士(インスブルック大学生物医学老化研究所、Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).

<ol><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li>
<li>Kang, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li>
<li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence%2C+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li>
<li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).</li>
<li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li>
<li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284(2020).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+crystallization%2C+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729(2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+%28FAHD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molcules%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009(2021).</li>
<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).</li>
<li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins%3A+Between+meaning+and+different+methods%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Technologies+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li>
<li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802(2018).</li>
<li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li>
<li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li>
<li>Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sørensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
<li>Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: 
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<li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%3A+A+5-year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li>
</ol>

著者らは競合する金銭的利益を持っていない。

プロトコルの重要なステップ タンパク質の取り扱いに関する一般的なガイドラインに従うことは、氷上や適度なpHおよび塩条件下での作業など、不可欠です。プロテアーゼ阻害剤の使用は、この方法にとって有益であるが、プロテアソーム阻害剤の使用は強く推奨される。サンプルを凍結および融解すると、常にタンパク質沈殿(少なくとも部分的に)が生じる可能性があるため、初期タンパク質溶解物の融解アリコート(ステップ2)は、中断することなく連続的に処理する必要があります。解凍後の遠心分離および濾過は、一般に、微小沈殿を除去するために推奨される。
組織から得られた最初のタンパク質溶解物には、タンパク質以外にも多くの物質が含まれています。イオン交換クロマトグラフィーカラムは、溶解物を透明化するために使用することができる。抽出したいタンパク質がイオン交換カラムに結合しなくても、フロースルーは入力溶液よりもはるかに明確で、後続のステップで処理が容易です。これは、マウス腎臓からのFAHD1の抽出について示される( 図5A...

真核生物FAHドメイン含有タンパク質1(FAHD1)は、二官能性オキサロ酢酸(OAA)デカルボキシラーゼ(ODx)1およびアシルピルビン酸加水分解酵素(ApH)2として作用する。それはミトコンドリア2に局在し、酵素1、2、3、4、5、6の広範なFAHスーパーファミリーに属する。そのApH活性はわずかな関連性しかないが、FAHD1のODx活性はTCAサイクルフラックス1、7、8、9の調節に関与している。OAAは、トリカルボン酸サイクルにおける中央クエン酸合成酵素反応に必要とされるだけでなく、電子伝達系の一部として、およびカタプレロティック代謝産物としてコハク酸デヒドロゲナーゼの競合阻害剤としても作用する。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)におけるFAHD1遺伝子発現のダウンレギュレーションは、解糖系への付随的な切り替えに関連する細胞増殖速度10の有意な低下、およびミトコンドリア膜電位の有意な阻害をもたらした。作業モデルは、ミトコンドリア機能障害関連老化(MiDAS)11様表現型8を指し、ミトコンドリアOAAレベルはFAHD1活性1,8,9によって厳密に調節される。
組換えタンパク質は、組織からではなく細菌12から発現および精製を介して得る方が容易である。しかし、細菌で発現されるタンパク質は、翻訳後修飾の欠如の可能性によって偏っているか、単に問題となる可能性がある(すなわち、プラスミド喪失、細菌ストレス応答、歪んだ/未形成のジスルフィド結合、分泌不良、タンパク質凝集、タンパク質分解的切断など)。特定の用途では、タンパク質は、そのような修飾を含むため、および/または起こり得る人工物を排除するために、細胞溶解物または組織から取得する必要がある。組織から精製されたタンパク質は、FAHD113などの選択された酵素に対する高品質の抗体、および/または強力で特異的な薬理学的阻害剤の開発を支持する。
この原稿は、ブタ腎臓およびマウス肝臓からのFAHD1の抽出および精製のための一連の方法を提示する。記載されている方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)を必要としますが、それ以外の場合は一般的な実験装置を使用します。代替的な方法は、他の場所で見出すことができる14、15、16、17。全タンパク質抽出後、提案されたプロトコルには試験段階が含まれ、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーのサブプロトコルが議論される(図1)。これらのサブプロトコールを定義した後、目的のタンパク質は、イオン交換およびFPLCによるサイズ排除クロマトグラフィーを用いた逐次戦略を介して抽出される。これらのガイドラインに基づいて、最終プロトコールは、関心のある他のタンパク質に対して個別に適合され得る。
<img alt="組織処理ワークフロー:遠心分離、沈殿、クロマトグラフィー。ウェスタンブロット分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1: このプロトコルの全体的な戦略 上から下へ:タンパク質は組織から抽出されます。組織ホモジネートを調製し、遠心分離し、濾過した。上清およびペレット由来サンプルのペアごとに、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィー(FPLC)の試験を実施して、最適な条件をプローブする必要があります。これらのサブプロトコールを確立した後、タンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、および反復サイズ排除クロマトグラフィー(FPLC)の逐次手順 を介して 、様々なpHおよび塩濃度で抽出され得る。すべてのステップはウェスタンブロットによって制御される必要があります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.22 以上mフィルターユニット</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP、0.22 &micro;m、PES 33 mm、滅菌されていない</td></tr><tr><td>0.45 &micro;mフィルターユニット</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP、0.45 & micro;m、PES 33 mm、滅菌されていない</td></tr><tr><td>15 mL ファルコンチューブ</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>遠心チューブ</td></tr><tr><td>50 mL ファルコンチューブ</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>遠心チューブ</td></tr><tr><td>96 ウェル UV マイクロプレート</td><td>サーモフィッシャー</td><td>8404</td><td>UV/VIS 透明平底 96 ウェルプレート</td></tr><tr><td>アクリルアミド/ビス溶液 (40%、29:1 の比率)</td><td>BIO-RAD</td><td>#1610147</td><td>40%アクリルアミド/ビスアクリルアミド、ポリアクリルアミドゲル&Aumlをキャストするための29:1(3.3%架橋剤)溶液</td></tr><tr><td>;KTA FPLCシステム</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td> <td>-</td> <td>GEヘルスケアのFPLCシステムを使用;異なるカスタムバージョンが存在する;この作業は"&Auml;KTA pure" システム</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15、PLGC Ultracel-PL Membran、10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC901024</td><td>centrifigal filters for protein enrichment;10 kDa molecular mass filter;15 mL</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4、PLGC Ultracel-PL Membran、10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC801024 13</td><td>centrifigal filters for protein enrichment;10 kDa molecular mass filter;4 mL</td></tr><tr><td>Ammonium sulfate powder</td><td>MERCK</td><td>A4418</td><td>分子生物学のための硫酸アンモニウム、&ge;99.0%</td></tr><tr><td>アンモニウムペルサルファト試薬グレード、98%</td><td>MERCK</td><td>215589</td><td>アクリルアミドゲル重合用触媒。</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant blue R 250</td><td>MERCK</td><td>1125530025</td><td>Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Imperial Chemical Industries PLCの商標 CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 &deg;C)</td></tr><tr><td>透析チューブセルロース膜</td><td>MERCK</td><td>D9277</td><td>透析による緩衝液の交換のためのセルロース膜。</td></tr><tr><td>Eppendof tubes 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>525-1042</td><td>microcentrifugal tubes; オートクレーブ済み</td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>28989334</td><td>HiLoad Superdex 75 pg プレパックカラムは、組換えタンパク質の高分解能サイズ排除クロマトグラフィー用</td></tr><tr><td>Immun-Blot PVDF Membrane</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620177</td><td>PVDFメンブレンは、蛍光およびマルチプレックス蛍光アプリケーション向けに最適化されたタンパク質ブロッティングメンブレンです。</td></tr><tr><td>ミニトランスブロット電気泳動転写セル</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703930</td><td>ミニトランスブロットセルを使用して、ミニプロティアンプレキャストゲルおよびハンドキャストゲルを迅速にブロッティングします。</td></tr><tr><td>ミニプレキャストゲル用ミニプロティアンテトラ垂直電気泳動セル</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>4ゲル垂直電気泳動システムには、電極アセンブリ、コンパニオンランニングモジュール、タンク、電源ケーブル付き蓋、ミニセルバッファーダムが含まれています。</td></tr><tr><td>Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516701</td><td>Mono Q カラムは、タンパク質分析またはタンパク質の小規模で高分解能のポリッシング用の強陰イオン交換クロマトグラフィーカラムです。</td></tr><tr><td>Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516901</td><td>Mono S カラムは、タンパク質分析またはタンパク質の小規模高分解能ポリッシング用の強陽イオン交換クロマトグラフィーカラムです。</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>タンパク質電気泳動(SDS-PAGE)およびウェスタンブロッティングのサイズ標準として使用するための、10種類の青色、オレンジ色、緑色染色タンパク質(10〜180 kDa)の混合物です。</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo-Fischer</td><td>23225</td><td>タンパク質濃度を測定するための、2成分、高精度、界面活性剤対応タンパク質アッセイです。</td></tr><tr><td>ソニファイア250;超音波細胞破壊器w /コンバーター</td><td>ブランソン</td><td>-</td><td>https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td></tr><tr><td>豚抗ウサギ免疫グロブリン/ HRP(アフィニティ単離)</td><td>アジレントダコ</td><td>P0399</td>で使用される<td>抗体は、すべてのクラスのウサギ免疫グロブリンと反応します。</td></tr><tr><td>TEMED、1,2-ビス(ジメチルアミノ)エタン、TMEDA</td><td>MERCK</td><td>T9281</td><td>TEMED(N、N、N&prime;、N&prime;-テトラメチルエチレンジアミン)は、ポリアクリルアミドゲルの迅速な重合を可能にする分子です。</td></tr><tr><td>チューブローラー</td> <td>-</td><td>-</td> <td>一般的なチューブローテータローラ、例えば https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td></tr><tr><td>チューブローテーター</td>の新モデル <td>-</td><td>-</td> <td>一般的なチューブローテータホイール、例えば https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td></tr><tr><td>ULTRA-TURRAXの新モデル。T 25 digital</td><td>IKA</td><td>0003725000</td><td>新モデル https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td></tr></tbody></table>

豚腎臓およびマウス肝臓からのfahd1タンパク質の抽出および精製

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

フマリアセト酢酸加水分解酵素ドメイン含有タンパク質1(FAHD1)は、真核生物においてFAHスーパーファミリーの最初の同定されたメンバーであり、ミトコンドリアにおいてオキサロ酢酸デカルボキシラーゼとして作用する。この記事では、豚の腎臓およびマウス肝臓からFAHD1を抽出および精製するための一連の方法を提示する。対象となる方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)によるイオン交換クロマトグラフィー、FPLCによる分取および分析ゲルろ過、およびプロテオミクスアプローチです。全タンパク質抽出後、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーを探索し、イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いた逐次戦略 を介して FAHD1を抽出した。この代表的なアプローチは、目的の他のタンパク質(有意なレベルで発現)に適合させ、他の組織について改変してもよい。組織から精製されたタンパク質は、高品質の抗体、および/または強力で特異的な薬理学的阻害剤の開発をサポートし得る。

FAHD1タンパク質は、提示されたプロトコールを用いてブタ腎臓およびマウス肝臓から抽出した。マウス組織の場合、最終精製工程の後に数μgを得るために複数の臓器が必要である。このため、この記事では、豚の腎臓からのFAHD1の抽出に焦点を当てており、これははるかに例示的な実験です。マウス肝臓からのFAHD1の抽出は、このプロトコルの困難および可能性のある落とし穴を提示するために行われる。一般に、精製したいタンパク質の高い発現レベルを示す器官を使用することが推奨される。ヒトタンパク質アトラス22 は、モデル系における発現を推定するのに役立ち得るか、またはこれらのレベルを評価するために異なる粗組織溶解物を用いて予備的なウェスタンブロット実験を行ってもよい。すべてのウェスタンブロット解析で使用されたポジティブコントロールは、わずかに高い分子量で実行されるタグ付き組換えタンパク質でした。
第1の実験として、ブタ腎臓からのFAHD1の抽出が提示される。組織均質化(ステップ1)および全タンパク質抽出(ステップ2)のプロセスを 補足図1<...

このプロトコールは、ブタ腎臓およびマウス肝臓からフマリアセトアセテート加水分解酵素ドメイン含有タンパク質1(FAHD1)を抽出する方法を記載する。列挙された方法は、目的の他のタンパク質に適合させ、他の組織に対して改変してもよい。

豚腎臓およびマウス肝臓からのFAHD1タンパク質の抽出および精製

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

細菌からの組換えタンパク質の精製は、十分に確立された方法である。ただし、これらの手法を使用すると、いくつかの問題が発生する可能性があります。組織からタンパク質を抽出する方法を持つことは確かに魅力的です。この方法の主な利点は、そのフォールディングおよび触媒活性に影響を与える可能性のあるすべての相互効果を含む、その生理学的形態でタンパク質を抽出できることである。このアプローチは、目的の他のタンパク質に適合させ、他の組織に対して改変してもよい。組織から精製されたタンパク質は、高品質の抗体および薬理学的阻害剤の開発をサポートし得る。開始するには、250ミリリットルのPBSを50ミリモルのフッ化ナトリウム、1ミリモルのフェニルメチルスルホニルフルオリド、1ミリリットル当たり2マイクログラムのアプロチニン、および1ミリモルの活性化オルトバナジン酸塩と混合することによってタンパク質溶解緩衝液を調製する。0.22マイクロメートルのシリンジフィルターユニットを使用して溶液をろ過します。組織1グラムあたり2ミリリットルの溶解バッファーでチューブを準備し、氷の上に置きます。組織サンプルを調製するために、ポリスチレンフォームボックス内の氷上に置かれた予め洗浄されたガラス板上にそれぞれ約100ミリグラムの組織を解剖する。その後の溶解のために組織片を調製したチューブに移す。飽和硫酸アンモニウム溶液を調製するために、500ミリリットルの二重蒸留水を摂氏70度に加熱する。攪拌しながら、硫酸アンモニウムが溶解しなくなるまで硫酸アンモニウム粉末を徐々に加える。この飽和溶液を室温まで冷却し、摂氏4度で一晩保存する。豚腎臓組織を均質化するために、好ましくは試料を氷上に保ちながら超音波プローブによって懸濁液を超音波処理する。マウスの肝臓組織の場合は、電気ホモジナイザーを使用し、PBSで定期的に洗浄して、サンプルを氷上に保管しながら目詰まりを防ぎます。サンプルから20マイクロリットルを取り出し、均質化された組織の細胞が適切に破壊されているかどうかを顕微鏡で確認します。それ以外の場合は、均質化を繰り返します。チューブを10,000倍のGで4°Cで30分間遠心分離します。上清を新鮮なチューブに集め、氷の上に置きます。続いて、0.45マイクロメートルおよび0.22マイクロメートルのシリンジフィルターユニットを使用して上清をろ過する。上清を10ミリリットルのバッチにアリコートし、短期保存の場合は摂氏マイナス20度、長期保存の場合は摂氏マイナス80度で凍結します。SDS-PAGEまたはウェスタンブロット分析用に50マイクロリットルのサンプルを用意するには、SDSサンプルバッファーの5倍量を10マイクロリットルの上清に加え、95°Cで10分間煮沸します。製造元の指示に従って、不連続な12.5%ポリアクリルアミドSDS-PAGEゲルを調製する。SDS−PAGE分析を行うために、続いてゲルのウェルにタンパク質マーカーラダーをロードし、5ナノグラムのヒトFAHD1組換えタンパク質をポジティブコントロールとして、20マイクロリットルのサンプルを分析対象として、残りのウェルに20マイクロリットルの調製されたSDS−PAGEサンプルバッファーをロードする。SDS ランニングバッファを使用して、SDS-PAGE ゲルを 125 ボルトで実行します。SDS−PAGEが完了した後、ウェスタンブロット分析を行い、FAHD1に対して惹起された利用可能な抗体を用いて膜をプローブする。前述のように上清アリコートを調製した後、解凍後の処理か、または試料を凍結せずにタンパク質抽出の直後に処理する。0.22マイクロメートルのフィルターユニットを使用してサンプルをろ過し、解凍後に起こりうる沈殿物を排除します。氷上に6本の1.5ミリリットルのチューブを準備し、250マイクロリットルのサンプルを各チューブに移します。調製したチューブに硫酸アンモニウムの希釈シリーズを調製し、タンパク質溶解緩衝液で最終容量を1,000マイクロリットルにする。サンプルを摂氏4度でチューブローテーター上で一晩インキュベートします。卓上遠心分離機を用いて、摂氏4度で30分間、10,000倍Gで遠心分離し、すべての上清を別々のチューブに慎重に移した。得られたペレットを空気乾燥し、それぞれを1,000マイクロリットルの二重蒸留水に再懸濁する。前のステップからの再懸濁ペレットおよび上清の各ペアについて、40マイクロリットルとSDSサンプルバッファーの5倍の10マイクロリットルを混合し、液体の大部分が気化するまで開いた蓋で摂氏95度で沸騰させる。次いで、ペレットを二重蒸留水中の50%ジメチルスルホキシドの混合物に再懸濁する。再懸濁ペレットおよび上清に由来するサンプルをペアでロードすることによってSDS−PAGEを行い、続いてウェスタンブロット分析を行った。ただし、ゲルを80ボルトで3時間実行してください。FPLCシステムをアニオン交換カラムまたはカチオン交換カラムでセットアップします。20%エタノールの5つのカラム容量で20%エタノールでカラムを洗浄し、続いて5カラム容量のダブル蒸留水で洗浄します。注入またはサンプルポンプを使用してサンプルをカラムに塗布し、フロースルーを収集します。カラムを 1 カラム容量の低塩緩衝液で洗浄します。3 つのカラム容量内で、100% 低塩バッファーから 100% 高塩バッファーへのリニアグラジエント溶出を設定します。1ミリリットルの分画を連続的に収集します。グラジエントが終了したら、1カラム容量の範囲にわたってクロマトグラムにタンパク質関連ピークが検出されなくなるまで、高塩バッファーで実行を続けます。0.5モルの水酸化ナトリウムと二重蒸留水に溶解した1ミリリットルの25%SDSを塗布してカラムを洗浄します。3 つのカラム容量の二重蒸留水と 3 つのカラム容量の 20% エタノールで、2 つの蒸留水でカラムを連続して洗浄します。すべてのピークフラクションとフロースルーのSDS-PAGEサンプルを収集します。回収した画分を液体窒素中でスナップ凍結し、マイナス80°Cで保存します。ウェスタンブロットを介してそれらをプローブした後、目的のタンパク質を含む画分を解凍してプールし、他のものを廃棄する。精製ステップを実行するには、超遠心分離フィルターユニットを使用してタンパク質溶液の体積を2ミリリットルまで減らします。0.45マイクロメートルおよび0.22マイクロメートルのシリンジフィルターユニットで溶液を順次ろ過し、微量沈殿を除去します。サイズ排除クロマトグラフィーカラムを、1ミリモルのジチオスレイトールを含む1カラム容量のランニングバッファーで平衡化する。サンプルをカラムにロードし、前述のようにすべてのタンパク質が溶出するまでクロマトグラフィーユニットを実行します。前述のSDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析用に50マイクロリットルのサンプルを準備します。1カラム容量の二重蒸留水と1カラム容量の20%エタノールで20%エタノールで連続してカラムを洗浄します。ウェスタンブロット分析を実施した後、全てのFAHD1含有画分をプールする。超遠心フィルターユニットを使用して、タンパク質溶液の体積を2ミリリットルまで減らします。ウェスタンブロットスクリーニングは、上清中にブタFAHD1の存在を示し、バンドは25キロダルトンで、タグ付き陽性対照は34キロダルトンで実行される。溶解物からのブタFAHD1を陰イオン交換クロマトグラフィーで精製し、結合タンパク質を溶出により除去した。ブタFAHD1を含む画分をウェスタンブロット分析により同定し、プールし、濃縮した。タンパク質サンプルをSECにより精製し、ウェスタンブロット分析により同定した。豚FAHD1タンパク質の収量は約1ミリグラムで、純度は80%でした。ウェスタンブロット分析は、マウスFAHD1タンパク質を他のタンパク質と共にフロースルー中に検出した。フロースルーをサイズ排除クロマトグラフィーに適用した。FAHD1を含む画分をプールし、濃縮し、SDS−PAGE分析に適用した。しかし、タンパク質の収量はあまり高くなかった。豚FAHD1の特異的酵素活性は、全タンパク質当たりのFAHD1の相対量を増加させると純度レベルとともに増加する。硫酸アンモニウムのより高い濃度は、より低い電圧で解決することができる笑顔効果を引き起こす。さらにタンパク質が15%濃度で溶解液および上清中に見出された。しかし、より高い濃度では、サンプルが沈殿し、検出できないことがあります。ここで提示されたプロトコルは、タンパク質が解けることを要求する。クロマトグラフィーの沈殿およびpHまたはサイズ調整に最適な条件を試験および定義する必要があります。酵素機能の研究、タンパク質構造の調査、抗体の開発は、細菌から抽出されたタンパク質ではなく組織から抽出されたタンパク質を有する場合に大きく支持される。

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Biochemistry

生物化学

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豚腎臓およびマウス肝臓からのFAHD1タンパク質の抽出および精製

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