Name: 呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶマウス骨格筋からのミトコンドリア単離と呼吸法アッセイの効率的なプロトコル。複数サンプルの同時処理が可能で、老化や薬物スクリーニング、がん研究など幅広い分野でのミトコンドリア機能解析に応用できます。

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ホモジナイザーとCABDプロテオミクスおよび畜産施設を技術サポートに使用してくれたJuan J. Tenaに感謝します。この研究は、スペイン教育文化スポーツ省のJ.D.H.へのフェローシップFPU16/03264、C.V.-G.へのフェローシップ助成金#22450、制度助成金MDM-2016-0687(CABDの遺伝子規制および形態形成省マリア・デ・マエズトゥ・エクセレンス・ユニット)、BFU2017-83150-PからJ.J..Cへのフェローシップ・フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー協会(AFM)を通じて支援されまし.C。アンダルシア暫定軍事政権はP18-RT-4572、欧州連合(EU)のFEDER資金提供プログラム、スペイン科学・イノベーション・大学省はRED2018-102576-TをPNに助成金を支給しています。

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Alberts, B., et al. The mitochondrion. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%2C+4th+edition%22">Molecular Biology of the Cell, 4th edition</a>. , Garland Science. New York. (2002).</li>
<li>Turunen, M., Olsson, J., Dallner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+function+of+coenzyme+Q%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Metabolism and function of coenzyme Q.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1660 (1-2), 171-199 (2004).</li>
<li>Alcázar-Fabra, M., Trevisson, E., Brea-Calvo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+syndromes+associated+with+coenzyme+Q10+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Clinical syndromes associated with coenzyme Q10 deficiency.</a> Essays in Biochemistry. 62 (3), 377-398 (2018).</li>
<li>Banerjee, R., Purhonen, J., Kallijärvi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+coenzyme+Q+junction+and+complex+III%3A+biochemistry+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial coenzyme Q junction and complex III: biochemistry and pathophysiology.</a> The FEBS Journal. , (2021).</li>
<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Villalba, J. M., Navas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+coenzyme+Q+biosynthesis+pathway+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of coenzyme Q biosynthesis pathway in eukaryotes.</a> Free Radical Biology & Medicine. 165, 312-323 (2021).</li>
<li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 63-72 (2012).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6 (7), 21746(2011).</li>
<li>Pala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+states+govern+skeletal+muscle+stem+cell+fates+during+prenatal+and+postnatal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic states govern skeletal muscle stem cell fates during prenatal and postnatal myogenesis.</a> Journal of Cell Science. 131 (14), 212977(2018).</li>
<li>Shintaku, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+regulates+skeletal+muscle+oxidative+metabolism+cooperatively+with+alternative+NF-%C4%B8B%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MyoD regulates skeletal muscle oxidative metabolism cooperatively with alternative NF-ĸB.</a> Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+method+for+real-time+assessment+of+cellular+metabolism+in+intact+long+skeletal+muscle+fibre+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles.</a> The Journal of Physiology. 594 (24), 7197-7213 (2016).</li>
<li>Schuh, R. A., Jackson, K. C., Khairallah, R. J., Ward, C. W., Spangenburg, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+respiration+in+intact+single+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial respiration in intact single muscle fibers.</a> American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (6), 712-719 (2012).</li>
<li>Rosenblatt, J. D., Lunt, A. I., Parry, D. J., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+satellite+cells+from+living+single+muscle+fiber+explants%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 31 (10), 773-779 (1995).</li>
<li>Keire, P., Shearer, A., Shefer, G., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+skeletal+muscle+myofibers+as+a+means+to+analyze+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of skeletal muscle myofibers as a means to analyze satellite cells.</a> Methods in Molecular Biology. 946, 431-468 (2013).</li>
<li>Shintaku, J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aerobic+respiration+in+intact+skeletal+muscle+tissue+by+microplate-based+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of aerobic respiration in intact skeletal muscle tissue by microplate-based respirometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1460, 337-343 (2016).</li>
<li>Bharadwaj, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+respirometric+assessment+of+mitochondria+isolated+from+skeletal+muscle+tissue+obtained+by+percutaneous+needle+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52350(2015).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452(2011).</li>
<li>Iuso, A., Repp, B., Biagosch, C., Terrile, C., Prokisch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+bioenergetics+in+isolated+mitochondria+from+various+mouse+tissues+using+Seahorse+XF96+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial bioenergetics in isolated mitochondria from various mouse tissues using Seahorse XF96 analyzer.</a> Methods in Molecular Biology. 1567, 217-230 (2017).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+Seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the Seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li>
<li>Das, K. C., Muniyappa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+mitochondrial+energy+dynamics+in+the+mice+heart%3A+role+of+superoxide+dismutase-2%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Age-dependent mitochondrial energy dynamics in the mice heart: role of superoxide dismutase-2.</a> Experimental Gerontology. 48 (9), 947-959 (2013).</li>
<li>Aw, W. C., Bajracharya, R., Towarnicki, S. G., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+bioenergetic+functions+from+isolated+mitochondria+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing bioenergetic functions from isolated mitochondria in Drosophila melanogaster.</a> Journal of Biological Methods. 3 (2), 42(2016).</li>
<li>Sakamuri, S. S. V. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+respiratory+function+in+isolated+cardiac+mitochondria+using+Seahorse+XFe24+analyzer%3A+applications+for+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 analyzer: applications for aging research.</a> Gerontology. 40 (3), 347-356 (2018).</li>
<li>Boutagy, N. E., Pyne, E., Rogers, G. W., Ali, M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217(2015).</li>
<li>Sperling, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+respiration+in+isolated+murine+brain+mitochondria%3A+implications+for+mechanistic+stroke+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromolecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring respiration in isolated murine brain mitochondria: implications for mechanistic stroke studies.</a> Neuromolecular Medicine. 21 (4), 493-504 (2019).</li>
<li>Boutagy, N. E., Rogers, G. W., Pyne, E. S., Ali, M. M., Hulver, M. W., Frisard, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53216(2015).</li>
</ol>

著者らは、開示すべき利益相反がないことを宣言する。

ミトコンドリア呼吸を研究するために使用されるすべての方法には限界があります。したがって、特定の実験的な質問に最も適した方法を選択することが重要です。この研究は、ミトコンドリア機能を調査するためにさまざまな呼吸アッセイを実行するために、マウス骨格筋からミトコンドリアを単離するための最新かつ詳細なプロトコルを提供する。実際、マイクロプレートベースの技術を用いた単離ミトコンドリアにおけるミトコンドリア生体エネルギー学の研究は、再現性、信頼性、および複雑さの点で組織特異的呼吸を研究するのに価値がある。さらに、単離されたミトコンドリアの使用は、基質の利用可能性に対する制御を与え、基礎となる生物学的プロセスの理解を容易にする。単離されたミトコンドリアを使用することのもう一つの肯定的な側面は、膜貫通ATPアーゼの大部分が失われるため、ADP注射後に生成されたATPが再び新しいADPに変換されないため、状態IIIを研究することが可能であることである。さらに、本明細書に記載のアッセイにおいて、オリゴマイシンは、非特異的ATP合成の可能性をブロックするために添加される20。
<p class="jov...

ミトコンドリアは細胞内の主要な代謝小器官1です。これらの特殊な膜密閉細胞小器官は、栄養分子を使用して、OXPHOSによってアデノシン三リン酸(ATP)の形でエネルギーを生成する。このプロセスは、ETC2における一連の酸化還元反応におけるドナー分子からの電子の移動に依存する。CoQは、抗酸化機能を示すすべての細胞膜および循環リポタンパク質で内因的に産生される唯一の酸化還元活性脂質である3。これはETCの必須成分であり、NADH依存性複合体IおよびFADH2依存性複合体IIから複合体IIIに電子を伝達するが、他の多くのレダクターゼは、複数の細胞代謝経路における必須ステップとしてミトコンドリアCoQのユビキノールへの還元を駆動することができる4,5。
このプロセスを通して、ミトコンドリア内膜を横切って電気化学的プロトン勾配が作成され、ATP合成酵素複合体V2によって生物学的に活性なエネルギーに変換される。その結果、ミトコンドリアの機能不全は、主に高エネルギー要求を有する組織(脳、心臓、骨格筋)に影響を及ぼす無数の病理学的状態をもたらす6,7。したがって、ミトコンドリアの生体エネルギー学を正確に解析し、健康や病気、特に骨格筋などの高エネルギー組織におけるミトコンドリアの生体エネルギー学の役割を調べる方法を開発することが不可欠です。
クラーク型酸素電極は、ミトコンドリア呼吸の研究で古典的に使用されています8。しかし、このシステムは徐々に高分解能技術に取って代わられており、Agilent Seahorse XF分析装置などのマイクロプレートベースの酸素消費技術が特に人気があります9。骨格筋分野では、これらの研究は通常、主にC2C12不死化マウス筋芽細胞株またはサテライト細胞に由来する初代培養細胞において、培養細胞において実施される10,11。しかし、これらの研究は、特に特定の侮辱、非遺伝的介入、または遺伝子操作による組織レベルでのミトコンドリア生物学および機能を調査する場合、インビボでの状況を完全に要約していない。
さらに、細胞内の呼吸アッセイは、ATPおよびアッセイ基質のミトコンドリア外要求またはシグナル伝達事象を含む追加の要因のためにより複雑であり、結果の解釈を誤解させる可能性がある。あるいは、筋肉から単離されたばかりの筋線維の単一または束を用いることもできる。しかし、単離方法は技術的に困難であり、いくつかの筋肉タイプに対してのみ実現可能である。この場合、屈筋デジトルム・ブレビス(FDB)および伸筋デジトルム・ロンガス(EDL)筋が主に使用されていますが10,12,13が,他の筋肉型の使用についても記述されている報告もあります14,15。
骨格筋切片の生体エネルギープロファイリングも報告されている16。この方法の主な利点は、無傷の筋肉を研究できることである(著者らは、単離された筋線維と比較して、線維をスライスしても結果を妨げないことを示している)。しかし、基質およびアッセイ阻害剤へのミトコンドリアのアクセスは限られているため、測定できるパラメータはごくわずかです16。最後に、単離されたミトコンドリアも同様に採用することができる9、17、18、19。この場合、ミトコンドリアは細胞質ゾル環境を失い、その機能に影響を与える可能性があります。対照的に、この方法は、基質および阻害剤へのアクセスを保証し、多数のサンプルタイプの分析を可能にし、典型的にはより少ない材料を必要とする。
本稿では、マイクロプレートベースの呼吸法アッセイを用いてマウス骨格筋から単離されたミトコンドリアの生体エネルギープロファイリングを行う方法を記載する(図1)。特に、3つのプロトコルが詳述されている:カップリングアッセイ、ETCとOXPHOS機構との間の結合の程度を評価するためのCA;電子フローアッセイにより、個々のETC錯体の活性を測定するEFA;BOXアッセイにより、ミトコンドリアβ酸化能を決定した。特に、従来の呼吸法と比較して、少量のサンプルしか必要としません。ここで使用される分離プロトコルは、他の場所で公開されている方法から変更されています18。

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A5285</td><td>ストックは -20 °C;C</td></tr><tr><td>AKT 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>C67E7</td><td>Rabbit (宿主種)</td></tr><tr><td>抗ヤギ HRP</td><td>Sigma</td><td>401504</td><td>ウサギ (宿主種)</td></tr><tr><td>anti-Mouse HRP</td><td>Cell Signaling</td><td>#7076</td><td>Horse (Host species)</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Stock at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>anti-Rabbit HRP</td><td>Cell Signaling</td><td>#7074</td><td>ヤギ (宿主種)</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td>Stock at RT</td></tr><tr><td>Bactin antibody</td><td>Sigma</td><td>MBS4-48085</td><td>ヤギ (宿主種)</td></tr><tr><td>Bio-Rad Protein Assay Kit II</td><td>バイオ・ラッド</td><td>5000002</td><td>5x Bradford 試薬と、標準曲線</td></tr><tr><td>BSA、フラクション V、脂肪酸を含まない</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td>4°Cでストック。C</td></tr><tr><td>C チューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>紫色の蓋</td></tr><tr><td>カルネキシン抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>MA3-027</td><td>マウス (宿主種)</td></tr> <tr><td>D-マンニトール</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>RT</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BDH</td><td>280254D</td><td>4 °Cでストック;C</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td>RT</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>ストック -20 °C;C</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>ホモジナイザー</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>RT</td></tr><tr><td>HSP70抗体</td><td>Proteintech</td><td>10995-1-AP</td><td>ウサギ (宿主種)</td></tr><tr><td>LDH-A 抗体</td><td>Santa Cruz バイオテクノロジー</td><td>SC27230</td><td>ヤギ (宿主種)</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>ChemCruz</td><td>sc-255260A</td><td>RTでの在庫</td></tr><tr><td>リンゴ酸</td><td>Sigma</td><td>P1645</td><td>RT</td></tr><tr><td>の在庫 マイクロプレート分光光度計</td><td>BMG LABTECH GmbH</td><td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td><td>RT</td></tr><tr><td>Milli-Q 水</td><td>ミリポアシステム</td><td>F7HA17757A</td><td>超純水</td></tr><tr><td>mtTFA 抗体</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td><td>SC23588</td><td>ヤギ (宿主種)</td></tr><tr><td>Na+/K+-ATPase & alpha;1</td>抗体 <td>Novus Biologicals</td><td>NB300-14755</td><td>マウス (宿主種)</td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>ストック -20 °C;C</td></tr><tr><td>パルミトイル-L-カルニチン</td><td>Sigma</td><td>P1645</td><td>ストック -20 °;C</td></tr><tr><td>PBS錠</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>RTの1倍ストック</td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>ChemCruz</td><td>sc-203211</td><td>RTのストック</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>シグマ</td><td>60377</td><td>RTピル</td></tr><tr><td>ビン酸</td><td>シグマ</td><td>107360</td><td>4°Cのストック;C</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>Σ</td><td>R8875</td><td>ストック -20 °;C</td></tr><tr><td>Seahorse XF24 ミトコンドリアフラックス分析装置</td><td>Agilent Technologies</td><td>420179</td><td>XFe24 model</td></tr><tr><td>Seahorse XFe24 FluxPak mini</td><td>Agilent Technologies</td><td>102342-100</td><td>キットには、カートリッジ、マイクロプレート、および校正液が含まれています</td></tr><tr><td>コハク酸</td><td>シグマ</td><td>S7626</td><td>RT</td></tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>シグマ</td><td>S9378</td> RT <td></td></tr><tr><td>TIMM23 抗体のストック</td><td>Abcam</td><td>ab230253</td>ウサギ<td>(宿主種)</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T7394</td><td>ストック-20°C;C</td></tr><tr><td>TOMM20</td>抗体 <td>Abcam</td><td>ab56783</td><td>マウス(宿主種)</td></tr><tr><td>VDAC抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15895</td><td>ウサギ(宿主種)</td></tr></tbody></table>

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

細胞のエネルギーの大部分は、細胞の要求に応じて調節されるミトコンドリア酸化リン酸化(OXPHOS)系に収束する異なる経路によるグルコース、脂肪酸、およびアミノ酸の分解によって得られる。脂質分子コエンザイムQ(CoQ)は、一定の酸化/還元サイクルを通じて電子輸送鎖(ETC)内の複合体IIIに電子を伝達することによって、このプロセスにおいて不可欠である。ミトコンドリアの状態、そして最終的には、細胞の健康状態は、呼吸測定アッセイを用いてETC酸素消費量を測定することによって評価することができる。これらの研究は、典型的には、数日間培養された樹立または初代細胞株において行われる。両方の場合において、得られた呼吸パラメータは、任意の所与の器官または組織において正常な生理学的状態から逸脱していてもよい。
さらに、骨格筋から単離された培養単繊維の固有の特性は、このタイプの分析を妨げている。この論文は、マウス骨格筋から新たに単離されたミトコンドリアにおける呼吸の分析のための最新かつ詳細なプロトコルを提示する。また、プロセスのどの段階でも発生する可能性のある潜在的な問題に対するソリューションも提供します。ここで提示された方法は、多様なトランスジェニックマウスモデルにおける酸素消費速度を比較し、薬物治療または加齢または性別などの他の要因に対するミトコンドリア応答を研究するために適用することができる。これは、ミトコンドリアの生体エネルギー学の代謝と調節に関する重要な質問に答えるための実行可能な方法です。

ここに提示されたプロトコルは、マウス骨格筋からのミトコンドリアの単離によるミトコンドリア呼吸の in vivo 分析を可能にする。この方法の概要を 図 1 に示します。後肢から骨格筋を解剖した後(図2)、組織は均質化され、ミトコンドリアは等張条件下で連続遠心分離によって精製される。単離プロセス中に得られた異なる画分の純度は、異なる細胞小器官マーカーに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって分析することができる。 図3A は、単離された画分における別個のタンパク質集団を示す異なる画分からの一般的なタンパク質プロファイルを示す。
図3Bは、すべてのミトコンドリア含量がミトコンドリア画分中にあることを示しており、外側(VDACおよびTOMM20)および内側(TIMM23)のミトコンドリア膜のマーカー、さらにはヌクロイド関連タンパク...

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

この言葉は、マウスの骨格筋からミトコンドリアを処理する際の呼吸分析を表しています。このプロトコルにより、精製時間が大幅に短縮され、複数のサンプルを同時に処理できます。ユナイテッドバックグラウンドの任意の8つの性別の動物由来のミトコンドリアは、このプロトコールを使用して切断することができ、多種多様な実験条件下での呼吸の研究を可能にする。この方法は、加齢、薬物検査、癌、または発達を含むミトコンドリア機能が関連するすべての研究分野に適しています。他の組織や生物にも適応させることができます。ミトコンドリアを損傷から保護するために、手順中にすべてを氷の上に置き、すべての材料が冷たいことを確認してください。1サンプルあたり3つの50ミリリットルのビーカーを氷の上に置き、ビーカー1つに10ミリリットルのPBS、ビーカー2に10ミリモルEDTA PBSを10ミリリットル、ビーカー3に4ミリリットルのIB1を加えます。安楽死させたマウスの右後肢に70%エタノールをスプレーして毛皮が脱落するのを防ぎ、四肢をコルク解剖板にテープで固定し、左前肢をテープで固定します。膝からつま先までの皮膚を通して滅菌使い捨てメスで切開を行います。足首の高さで歯付きの鉗子で皮膚をつかみ、足首の周りを細かいはさみで切ります。片手に細かい先端ピンセットで皮膚を下層の筋肉組織から離し、もう片方の手に歯付きの鉗子で引き上げます。足首から膝までのすべての骨格筋を解剖し、細かいピンセットとハサミを使用して脛骨前筋上のすべての結合組織を除去します。伸筋桁長筋の4つの遠位腱を見つけ、つま先の挿入の近くにそれらを切断する。脛骨前遠位腱を見つけ、足首の下の挿入の近くで切断する。足首の上の脛骨前部と伸筋桁長腱を引っ張って、緩んだ端を解放します。腱の緩んだ端をつかみ、筋肉を引き上げることによって骨の他の筋肉組織から筋肉を緩めます。これらの筋肉の近位腱を膝蓋骨にできるだけ近づけて切断する。マウスを逆さまにして、腓腹筋とヒラメの筋肉の抽出を進めます。上腕二頭筋、大腿骨、腓腹筋の間に形成されたポケットをつかみ、細いはさみを使ってこれらの筋肉を分離して近位腱を視覚化します。遠位アキレス腱を細かいハサミで掴んで慎重に切ります。近位腓腹筋腱を切断し、下層のヒラメでそれを解放する。残りの筋肉を慎重に解剖し、マウスを初期位置に再固定して大腿四頭筋を解剖します。脂肪組織を捨て、大腿四頭筋と大腿骨の間に細かいピンセットを挿入して、筋肉を骨から分離します。遠位大腿四頭筋腱をつかみ、膝蓋骨にできるだけ近づけて腱を切断する。大腿四頭筋を引き上げ、近位挿入時に細かいはさみで解放します。左後肢についても同じことを繰り返します。すべての筋肉をビーカーで1つ、次に2つ、続いてビーカー3つをすすいでください。最後に、ビーカー3のすべての筋肉を氷の上の鋭いはさ

isolation-mitochondria-from-mouse-skeletal-muscle-for-respirometric

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、骨格筋から単離したミトコンドリアの呼吸を研究するための手順を説明します。このメソッドは、Scorranoから翻案されました...

骨格筋からのミトコンドリア単離

広筋のヘイケボタルの生検、精製されたミトコンドリアの準備、および呼吸計測プロファイリングのための方法が記載されている。小さな筋肉量の使用は、臨床研究用途のためにこの技術に適しています。...

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

提示された方法は、マウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用したマイクロプレートベースの呼吸測定アッセイのコレクションの性能について、段階的な指示を提供します。これらのアッセイは、一般的に使用される動物モデルにおけるミトコンドリア酸素消費量の機構的変化/適応を測定することができます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウス骨格筋の最小量から単離されたミトコンドリアを使用して

ここでは、以前に報告された方法の修正版を提示し、少量のマウス骨格筋から高品質で精製されたミトコンドリアを分離することを可能にします。この手順により、マイクロプレートベースの呼吸器アッセイ中に高機能で呼吸する高度に結合したミトコンドリアが得られます。...

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

ここでは、麻酔をかけたブタから大腿四頭筋の標本を採取し、ミトコンドリアを分画遠心分離によって分離します。次に、ミトコンドリア呼吸鎖複合体I、II、およびIVの呼吸数を高解像度呼吸測定を使用して決定します。...

高解像度の呼吸計測測定のための差動遠心分離することにより骨格筋から無傷ミトコンドリアの単離

ミトコンドリアは、骨格筋の表皮形成性の高いレベルを示す重要な代謝小器官です。細胞質ゾルからのタンパク質のインポートは、レチクルムの拡張とミトコンドリア機能の維持に不可欠なオルガネラ生物形成のための重要な経路です。 したがって、タンパク質のインポートは、細胞の健康のバロメーターとして機能します。...

骨格筋ミトコンドリアのタンパク質輸入能の測定

ミクロ解剖植技術は、骨格筋幹細胞のソースとして、若年成人や胚の筋肉から増殖性骨格筋細胞を単離するための堅牢で信頼性の高い方法です。一意に、これらの細胞は、クローン的に生体移植のために使用される骨格筋幹細胞株を生成するために導出されている。...

大人と胚骨格筋のMicroexplantの文化と骨格筋幹細胞の単離

酵素的解離、線維/脂肪細胞とマウス骨格筋からの筋原性前駆細胞のフローサイトメトリーによる表面標識および精製方法。...

骨格筋からの前駆体の精製

ここで紹介する方法は、高エネルギーのレーザーパルスと時間でこれらの損傷とその回復のその後の分析でライブゼブラフィッシュ胚の正確な傷害を含む。我々はまた、遺伝的に単一標識又は骨格筋細胞のグループが中に、レーザー光誘起損傷後に追跡することができる方法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

学ぶマウス骨格筋からのミトコンドリア単離と呼吸法アッセイの効率的なプロトコル。複数サンプルの同時処理が可能で、老化や薬物スクリーニング、がん研究など幅広い分野でのミトコンドリア機能解析に応用できます。

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

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