Name: ミュラーグリア細胞における2,7-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: 学ぶDCFH-DAプローブとフローサイトメトリーを用いたミュラーグリア細胞における活性酸素種の定量法。この再現性の高いプロトコルは、神経細胞の酸化ストレス評価とグリア機能研究に応用されます。

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著者らは、CIBICI(アルゼンチン、コルドバ、コリセトバ)のマリア・ピラール・クレスポとポーラ・アレハンドラ・アバディに、フローサイトメトリーの支援に、ガブリエラ・フルランとノエリア・マルドナドの細胞培養支援に感謝したい。我々はまた、ビデオ制作と編集のためにビクター・ディアス(FCQの制度コミュニケーション担当長官)にも感謝する。
この記事は、Secretaría de Ciencia y Tecnología、Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021、Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT)、Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (すべてM.C.S.への資金提供を受けたものです。

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<li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase%2C+NOX1%2C+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidation+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li>
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<li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M%C3%BCller+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li>
<li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells%3A+The+role+of+M%C3%BCller+glial+cells+and+NRF2%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199(2019).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M%C3%BCller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc%28-%29%2C+the+Na%28%2B%29-independent+glutamate-cystine+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li>
<li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li>
<li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li>
<li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li>
<li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li>
<li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc%CE%B3R+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167(2019).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357(2011).</li>
<li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture%3A+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li>
<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes%3A+challenges+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li>
</ol>

著者らは、開示する利益相反はありません。

癌、炎症性疾患、虚血/再灌流、虚血性心疾患、糖尿病、網膜症などのいくつかの病理学的状態、および老化などの生理学的状況は、ROSの過剰産生6、7、8、9、10、11につながる。したがって、ROSの変調に関与する経路の検出、測定、および理解は、多くの疾患にとって重要な標的である。DCFH-DAのようなROSレベルを測定するためのプローブの使用は、科学文献26、27、28でアクセス可能で、広く説明され、受け入れられています。この記事では、MGCのフローサイトメトリーに...

神経網膜は、明確に定義されたニューロン層を提示する非常に組織化された組織である。これらの中で、ニューロン(神経節、アマクリン、双極性、水平、および視細胞)は、互いに、またミュラーグリア細胞(MGC)およびアストロサイトと相互接続され、適切な光伝達および視覚情報の処理をもたらす1,2。MGCは、網膜部分全体にわたっており、したがって、複数の保護プロセスを調節するすべての細胞型と相互作用することができるため、網膜恒常性の維持に重要な役割を果たすことが知られている。MGCは、ニューロンにエネルギーを供給する解糖系、ニューロン老廃物の除去、神経伝達物質のリサイクル、神経栄養因子の放出など、網膜ニューロンの維持と生存のためにいくつかの重要な機能を有することが報告されている3,4,5。
一方、炎症、酸化ストレスおよびニトロソストレスは、網膜症6、7、8、9、10、11を含む多くのヒト疾患の病因および進行に関与している。細胞内の酸化還元バランスは、ROSレベルの厳密な調節に依存する。ROSは、主に好気呼吸の結果として生理学的条件下で絶えず生成される。ROSファミリーの主要メンバーには、スーパーオキシドアニオン(O2͘͘͘•−)、ヒドロキシルラジカル(•OH)、様々な過酸化物(ROOR')、ヒドロペルオキシド(ROOH)、および無ラジカル過酸化水素(H2O2)12,13などの反応性フリーラジカルが含まれる。ここ数年で、ROSが重要なプロセスを制御することによって細胞内で重要なシグナル伝達役割を果たすことが明らかになりました。MGCは、転写核因子エリスロイド-2関連因子2(Nrf2)の活性化およびその後の抗酸化タンパク質の発現によって強力な抗酸化防御を有し、病理学的条件下でのROSの過剰産生を排除する14、15、16。ROSの誇張された産生またはROSを除去する能力の欠陥のために細胞が酸化還元バランスを失うと、酸化ストレスの蓄積はタンパク質、脂質、およびDNAの有害な修飾を促進し、細胞ストレスまたは死に至る。網膜抗酸化防御系の増加は、ROPおよびRD17、18、19、20、21、22、23、24などの網膜障害の分解能および予防を改善する。したがって、リアルタイムでのROS生産の測定は強力で便利なツールです。
細胞内のROS産生または酸化ストレスを測定するためのいくつかの方法がある。これらの中でも、2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)プローブは、細胞25、26、27、28の酸化還元状態を直接定量するために最も広く使用されている技術の1つである。このプローブは親油性であり、非蛍光性である。細胞膜を横切るこのプローブの拡散は、2つのエステル結合における細胞内エステラーゼによる切断を可能にし、比較的極性が高く細胞膜不透過性の生成物である2',7'-ジクロロフルオレセイン(H2DCF)を生成する。この非蛍光分子は細胞内に蓄積し、その後のROSによる酸化は高蛍光生成物DCFを生成する。プローブの酸化は、フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡(530nmでの発光および485nmでの励起)によって検出することができる複数のタイプのROS(ペルオキシ亜硝酸塩、ヒドロキシルラジカル、一酸化窒素、または過酸化物)の作用の産物である。この技術の限界は、スーパーオキシドおよび過酸化水素がH2DCF25,29と強く反応しないことである。この記事では、DCFH-DAプローブを使用して、フローサイトメトリーによってROSを測定および定量します。そのため、蛍光プローブを細胞に負荷する前に、MGCをROS誘導剤AまたはBで刺激することにより、ROS産生を誘導します。また、酸化防止剤化合物を使用しています。最後に、このプロトコルを使用して得られた代表的で信頼性の高いデータを示します。

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-DCFH-DA</td><td>Sigma</td><td>35845-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCanto</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva ソフトウェア</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿 100x20 mm</td><td>Cell Star- Greiner Bio-One</td><td>664 160</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo</td><td>Sorvall legend micro 17 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes (15 ml)</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Tubes (50 ml)</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cryovial CRYO.S - Greiner Bio-One</td><td>126263</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td><td>ド Sigma-Aldrich</td><td>W387520-1KG</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム-水素-七水和物</td><td>メルク</td><td>106575</td><td></td></tr><tr><td>DMEM フェノールレッド</td><td>Gibco by life technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'修正されたイーグル」S medium (DMEM)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA), 二ナトリウム塩, 二水和物</td><td>メルク</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Internegocios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 ソフトウェア</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>メルク</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤, ノイバウアーチャンバー</td><td>BOECO,ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>ESCO</td><td>AC2-6E8</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (GlutaMAX)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>A12860-01</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;M36008</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco by life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルク</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>メルク</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>丸型ポリスチレンチューブ 5 ml (フローサイトメトリーチューブ)</td><td>ファルコン - コーニング</td><td>BD-352008</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>822335</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>メルク</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN マイクロ遠心チューブ 1.5 ml</td><td>ターソン</td><td>500010-N</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート 6 ウェル</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011006</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー</td><td>メルク</td><td>111732</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 0.5% 10X</td><td>Gibco by life technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>Labnet International, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

酸化還元バランスは、細胞の恒常性を維持する上で重要な役割を果たしている。活性酸素種(ROS)の生成の増加は、タンパク質、脂質、およびDNAの修飾を促進し、最終的に細胞機能の変化および細胞死につながる可能性がある。したがって、Keap1 / Nrf2のような抗酸化経路を活性化するか、酸化還元捕捉剤(ビタミンA、C、およびE、β-カロチン、およびポリフェノールなど)を改善することによって、有害な侮辱に応答して抗酸化防御を高めることは細胞にとって有益である。炎症および酸化ストレスは、糖尿病性網膜症(DR)および未熟児網膜症(ROP)などの網膜症の病因および進行に関与している。ミュラーグリア細胞(MGC)は神経網膜組織の恒常性維持において重要な役割を果たしているため、これらの細胞保護機構を研究するための理想的なモデルと考えられています。この意味で、再現性のある簡単な方法でROSレベルを定量することは、抗酸化細胞防御機構に関与する経路または分子の寄与を評価するために不可欠である。この記事では、DCFH-DAプローブによるROSの測定とMGCのフローサイトメトリーに必要な手順について詳しく説明します。ソフトウェアによるフローサイトメトリーデータ処理の主要な手順がここに提供されるため、読者はROSレベル(FITCの幾何学的手段)を測定し、蛍光ヒストグラムを分析できます。これらのツールは、細胞侮辱後のROSの増加を評価するだけでなく、細胞に保護効果をもたらすことができる特定の分子の抗酸化効果を研究するのに非常に役立ちます。

プロトコルのセクションで説明したように、我々は、ROS誘導剤AまたはBで刺激されたMIO-M1細胞からの蛍光プローブDCFH-DAによるROS産生のフローサイトメトリー検出を実証する代表的および定量的データを示した。予想通り、我々は、自己蛍光レベルを超える非刺激細胞におけるFITC蛍光の変化を観察した(図1A、「基礎対照」対「自家蛍光制御」の比較、ドットプロットグラフ)。これは、MIO-M1細胞におけるROSの基礎産生のために起こった。(図1Bは、「基底制御」対「自己蛍光制御」を比較し、ヒストグラムグラフ)。
興味深いことに、細胞をROS誘導物質AまたはBで刺激した場合、FITC蛍光の有意な増加が観察された(図1B、「ROS誘導因子A」サンプル対「基礎対照」および「ROS誘導物質B」試料対「基底対照」、ヒストグラムグラフ)。また、細胞をROS誘導剤AまたはBの前に抗酸化化合物で処理した場合、蛍光レベルは基...

ここでは、ミュラーグリア細胞(MGC)中の2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブ(DCFH-DA)を用いて細胞活性酸素種(ROS)を検出するための、体系化され、アクセス可能で再現可能なプロトコルを提案する。この方法は、フローサイトメーターを用いて全細胞ROSレベルを定量する。このプロトコルは非常に使いやすく、適切で再現性があります。

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

ROS産生、または細胞内の酸化ストレスを測定するためのいくつかの方法があります。これらの中でも、2'7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブは、酸化還元状態を直接測定するために最も広く用いられている技術の一つである。このプローブは親油性であり、非蛍光性である。細胞膜を横切るこのプローブの拡散は、2つのエステル結合での細胞内エステラーゼ切断を可能にし、比較的極性が高く細胞膜非透過性の生成物を生成する。これらの非蛍光分子は細胞内に蓄積し、その後のROSによる酸化は蛍光性の高い生成物ジクロロフルオレセインを生じる。プローブの酸化は、複数のタイプのROSの作用の産物である。これは、フローサイトメトリーまたは共焦点顕微鏡によって検出することができる。この記事では、ジクロロフルオレセインジアセテートプローブを使用して、フローサイトメトリーによってROSを測定および定量しました。6ウェルプレートをインキュベーターから層流フードに移す。上清を吸引する。細胞をPBSで1回洗浄した。1ウェルあたり2mLの低血清DMEMを加える。6穴プレートをインキュベーター内で2時間インキュベートした。細胞を抗酸化物質で6時間処理する。ROS誘導物質AまたはBで細胞を30分間処理する。上清を吸引する。細胞をPBSで3回洗浄し、全ての刺激を除去した。層流フードの明かりを消し、暗闇の中で作業します。フェノールレッドを含まないDMEMに1mLのジクロロフルオレセインジアセテートプローブを加える。フェノールレッドを含まない1mLのDMEMを対照自家蛍光制御細胞に加える。6ウェルプレートをインキュベーター内で30分間インキュベートする。氷の上のプレートを実験室に移す。1ウェルあたり2mLの冷たいPBSで細胞を3回洗浄する。0.5 mL の冷剥離バッファーを各ウェルに加えます。P1000ピペットを使用して上下に静かにピペッティングして細胞を回収します。ラベルの付いた1.5 mLチューブに集めます。そしてそれらを600 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を慎重に捨て、そして軽く叩いてペレットを解離させる。1mLのFACSバッファーを加え、細胞を各標識チューブに洗浄する。必要に応じて、ペレットを完全に解離させるために、最も低い強度の渦を使用してください。600 x gで4°Cで5分間遠心分離し、この手順をさらに2回繰り返します。全部で3回の洗浄。細胞ペレットを200LのFACS緩衝液に再懸濁する。渦を用いて各チューブ内のペレットを完全に穏やかに解離させる。標識した5mL用フローサイトメーターチューブに移した。フローサイトメーターで分析するまでチューブを氷上に保管してください。フローサイトメトリーソフトウェアを使用して、新しい実験を作成します。試料をクリックすると、チューブのリストが開きます。ダブルクリックして名前を変更します。自家蛍光制御チューブをアスピレーターアームの上に置き、ベースを左だけ慎重に動かします。「データ集録」をクリックし、「データを記録」をクリックして、目的の停止条件を選択します。目的の細胞の周りにゲートを描き、死んだ細胞と破片を除きます。チューブを取り外します。[次のチューブ] をクリックし、基本対照サンプルを実行します。[データの取得] をクリックし、[データの記録] をクリックします。ソフトウェアを開きます。[サンプルの追加] アクション ボタンを使用してサンプルを追加します。[サンプルの追加] をクリックします。[実験日] フォルダーを選択し、[選択] をクリックします。ワークスペース内の最初のサンプル (この場合は自家蛍光コントロール) をダブルクリックします。ポリゴン ゲートを描画して、目的のセルを分離し、死んだセルと破片を除外します。プロットをヒストグラムに変更します。M 内をダブルクリックします。

quantification-reactive-oxygen-species-using-27-dichlorofluorescein

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Neuroscience

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このビデオは、GFP発現トランスジェニックマウスから得られた3D腸オルガノイドのROSレベルを定量化するフローサイトメトリーアッセイを示しています。この方法は、ROS産生に対する試験化合物の有効性を調査するためのin...

酸化ストレスを定量化するためのフローサイトメトリーアッセイ:蛍光プローブを使用して腸管オルガノイドの活性酸素種を定量するアッセイ

このビデオは、マウスの眼に硝子体内送達後の蛍光バイオ粒子のミクログリア取り込みを測定するためのフローサイトメトリーを示しています。フローサイトメトリーは、CD11bを発現する生細胞を検出し、緑色蛍光を示す食作用性ミクログリア細胞を、Ly6C発現単球やLy6G発現好中球などの他の骨髄系細胞と区別します。...

フローサイトメトリーを用いた硝子体内送達蛍光粒子のミクログリア取り込みの測定

組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。...

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

本研究は、フローサイトメトリー、FcγR の活性化から生じる活性酸素種 (ROS) 生産を検出するための使用方法を示します。このメソッドは、抗菌および酸化還元シグナル免疫複合体、微生物のオプソニン、または直接 FcγR...

FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイト メーターによる測定

急性骨髄性白血病(AML)のマウスモデルから、マウスの健康な造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)におけるミトコンドリア活性酸素種(ROS)を検出するために多パラメータフローサイトメトリーを用いる方法について説明する。MLL-AF9.

マウス造血幹細胞および前駆細胞およびMLL-AF9駆動白血病におけるミトコンドリア活性酸素種のフローサイトメトリック解析

ここでは、2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセインジアセテート(DCFH-DA)を用いて全細胞活性酸素種(ROS)を検出するプロトコルを提示する。この方法は、蛍光顕微鏡で接着細胞における細胞ROS局在を可視化し、蛍光プレートリーダーでROS強度を定量化することができる。このプロトコルは、シンプルで効率的で費用対効果が高いプロトコルです。...

2',7'-ジクロロジドロフルオレセイン・ジアセテート染色による接着性細胞中の全活性酸素種の検出

このプロトコルは、細胞内の細胞内区画特異的な酸化還元状態の評価を記述する。レドックス感受性蛍光プローブは、無傷の細胞でのレシオメトリック分析を可能にします。...

細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

大腸菌 は、新生児グラム陰性細菌性髄膜炎の主な原因である。細菌感染の間、好中球によって産生される活性酸素種は主要な殺菌的役割を果たす。ここでは、大...

髄膜炎性大腸菌に感染した好中球における活性酸素種のリアルタイム定量

この研究は、単離された脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いた全体的なヒストン修飾の定量化のためのプロトコルについて説明しています。この研究には、データ収集に使用されたミクログリア分離プロトコルも含まれています。...

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

ここでは、フローサイトメトリーを使用してvGLUT1陽性シナプスとpHRodo...

フローサイトメトリーを用いたシナプス材料のミクログリア包絡の定量化

学ぶDCFH-DAプローブとフローサイトメトリーを用いたミュラーグリア細胞における活性酸素種の定量法。この再現性の高いプロトコルは、神経細胞の酸化ストレス評価とグリア機能研究に応用されます。

ミュラーグリア細胞における2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテートプローブとフローサイトメトリーを用いた活性酸素種の定量

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