マウスのCisterna Magna を介して 尾側脳幹および上部頸椎脊髄をマイクロインジェクションする定位的外科的アプローチ

このプロトコルは、尾側脳幹および上部頸部の関心領域へのアクセスの再現可能な経路のための段階的なガイドラインを提供する。この技術は、尾側脳幹および上部頸部の限られた関心領域に少量の注射を送達する場合の精度を高める。この技術は、これまでも、そして他の動物モデルにも適用することができる。

神経学の准教授であり、ヴァンダーホルスト研究所の主任研究者であるVeronique VanderHorst博士は、この手順を実証します。酸素の流れがノーズコーンに向けられていることを確認してください。マウスを定位フレームに移動し、柔軟なノーズコーンにノーズを置きます。

マウスを定位フレーム内に配置して、イヤーバーのみを使用します。目に潤滑剤を置きます。マウスの頭を 90 度の角度に前屈させて、手動で機首を誘導します。

この位置を固定するには、マウスアダプタのイヤーバーの柱の間にプラスチック製のバリアを柱と平行に配置し、頭蓋骨の平らな部分を基準にします。マウスの下に加熱パッドを置き、小さな箱で本体を持ち上げて、首と体の残りの部分がテーブルに平行に配置されていることを確認します。体の下にドレープを置きます。

メロキシカム徐放性キログラム当たり4ミリグラムの単回用量を、体重1グラム当たり2マイクロリットルの体積で皮下に注射する。手術用切開部位を最初にアルコール70%プレップパッドで洗浄し、次にベタインプレップパッドで、次にアルコールプレップパッドで再度洗浄し、乾燥させます。手を消毒し、滅菌手袋を着用し、手術部位にドレープを置きます。

マウスのつま先をつまむか、角膜反射をチェックして、マウスが適切に麻酔をかけられていることを確認します。イソフルランを減らしてレベルを2.0に維持する。1回の滑らかな動きで後頭骨の端から肩に向かって外科用10枚の刃で1〜1.2センチメートルの切開を行う。

トラペジウス筋の正中線ラペを慎重に切開し、対になったロンガス頭蓋炎筋を露出させる。対をなす縦頭蓋炎筋の間に両方のリトラクターフックを置き、一方を左に、もう一方を右に向ける。鈍い椎間板切除鉗子を使用して、正中線が容易に見える後頭部から始めて、対になった縦鎌状頭蓋炎筋の左右の腹を分離します。

鈍い鉗子を正中線の後頭部の骨を横切って槽硬膜に接するところまで導き、硬膜を横切ってアトラスまで進みます。リトラクターを再配置し、止血剤を再配置して張力を調整します。鈍い椎弓切除鉗子を使用して、正中線で筋肉をさらに分離し、脳幹と小脳の良好な視界を得る。

小脳と脳幹が硬膜の下に現れるまで、必要に応じて上記の手順を繰り返します。鈍い椎剃嚢切除鉗子を使用して、脳幹の明確な視界があるまで鉗子を正中線から横方向に動かすことによって結合組織の小さな鎖の硬膜をきれいにし、より多くの横方向の空間を作り出す。開いた硬膜を通して詳細なランドマークで脳幹の背側表面を見てください。

角度の付いた鉗子を使用して後頭骨からアトラスまで伸びる硬膜をつかみ、スプリングハサミを使用して硬膜に約0.5〜1.5ミリメートルの小さな開口部を作ります。硬膜が開いたら、滅菌Qチップで余分な脳脊髄液を排出する。中心管が第4心室に開く点であるobexは、標準的な前後および中側ゼロ点である。

定位アームを使用して、ピペットまたはシリンジをターゲットに配置します。背側の腕を背側零点から形成される背側表面に下げます。その後、ピペットを脳幹に下げ、溶液を注入する。

注射後1〜5分間針を所定の位置に放置して、3〜50ナノリットルの容量を使用する場合、針の追跡を避けてください。次に、定位アームを使用してピペットまたはシリンジを持ち上げ、複数のターゲットに対してこれを繰り返します。手術野からフックを慎重に取り外します。

対になったロンガスキャピティスの筋肉は、水槽マグナを完全に覆う中立的な位置に戻ります。台形筋と硬膜は縫合糸を保持するには壊れやすいため、正中線で閉じないでください。3ナイロンまたはポリプロピレン縫合糸で皮膚を閉じます。

貯水槽マグナアプローチは、標準的な定位アプローチでは到達しにくいか、一貫性のない標的化を起こしやすい尾側脳幹および上部頸索構造を標的にすることを可能にする。マウスでは、舌下核、腹側呼吸群、尾側脳幹における隣接する網状形成などの構造が、舌下核および腹内側髄質についてここに例示されているように、胸槽マグナアプローチを使用して日常的に標的化されてきた。標準アプローチに対する槽マグナアプローチの精度を決定するために、腹側および背側領域について、前後面、髄側面、および背側平面における意図された標的部位と実際の標的部位との間の距離を測定した。

この結果は、標準的なアプローチと比較して、前後面、髄側面、および背側平面における誤差が有意に小さいことを示し、これらの標的に対する槽マグナアプローチの精度が向上したことが浮き彫りになった。このプロトコルを試みるときは、頭部の前方屈曲および身体の隆起が説明どおりに行われることを確認することが重要である。次に、筋肉や硬膜を操作する前に、重要なランドマークを認識することが重要です。

これらのランドマークが認識されない場合、または失われた場合、方向を保ち、意図したとおりに手順を実行することは困難です。この技術は、尾側脳幹および上部頸部内の機能的解剖学的組織に関連する概念的問題に対処するのに役立った。