Name: 細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 探索するSeahorse細胞外フラックス解析を用いた単一3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝。がん研究における薬剤スクリーニングと代謝経路の評価に有用な生理学的モデルを提供します。

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著者は、宣言する利益相反を持っていません。

主な調査結果と成果 この論文では、XFe96 XF Analyzerを搭載した一連のがん由来細胞株を使用して、単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べるための詳細なプロトコルを提供します。強制凝集のための細胞忌避技術を用いて、A549、HepG2/C3A、MCF7、およびSK-OV-3細胞スフェロイドの迅速な培養のための方法が開発され、記述されている。このプロトコルは、(1)スフェロイド培養プロトコルの最適化、および技術メーカーからの特定のスフェロイドアッセイマイクロプレートへのスフェロイドの取り扱いと移動を元の培養容器から含む、XF技術によるスフェロイド代謝のプロービングに関する多くの考慮事項に対処します。(2)使用する呼吸器化合物の濃度および化合物浸透の時間依存性;(3)使用する注入戦略;(4)実験群間でデータを正規化する方法。これらすべての考慮事項は、現在の論文で検討されており、以下でさらに詳しく説明します。これらの方法は、XFe96 Flux アナライザーで単一の 3D スフェロイドを使用して一貫した代謝酸素フラックスデータを生成するための簡略化されたアプローチとして提示...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

生物学的研究におけるin vitroモデルの進歩は、過去20年間で急速に進歩しました。このようなモデルには、臓器オンチップモダリティ、オルガノイド、および3Dマイクロ組織スフェロイドが含まれ、これらはすべて、in vitroおよびin vivo研究間の翻訳を改善するための共通の焦点となっている。高度なin vitroモデル、特にスフェロイドの使用は、組織工学、幹細胞研究、癌、および疾患生物学1,2,3,4,5,6,7、および遺伝毒物学8,9,10、ナノ材料毒物学11を含む安全性試験を含むいくつかの研究分野にまたがり、 12、13、14、および薬物安全性および有効性試験8、15、16、17、18、19。
正常な細胞形態は、生物学的表現型および活性にとって重要である。細胞を3Dマイクロティッシュスフェロイドに培養することで、細胞は形態、表現型機能、およびアーキテクチャを採用することができ、 これは生体内で 観察されるものに似ていますが、古典的な単層細胞培養技術では捕捉が困難です。 インビボ および インビトロ の両方で、細胞機能は、細胞のコミュニケーションおよびプログラミング(例えば、細胞 - 細胞接合の形成、細胞ニッチを形成する機会)に限定されない細胞微小環境によって直接影響を受ける。即時環境におけるホルモンおよび成長因子への細胞曝露(例えば、炎症反応の一部としての細胞サイトカイン曝露);物理的および化学的マトリックスの組成(例えば、細胞が硬い組織培養プラスチックまたは弾性組織環境で増殖されるかどうか);そして最も重要なのは、細胞代謝が栄養と酸素へのアクセス、ならびに乳酸などの代謝性老廃物の処理によってどのように影響を受けるかということです。
代謝フラックス分析は、定義された in vitro システム内の細胞代謝を調べるための強力な方法です。具体的には、XF技術は、無傷の細胞および組織の細胞生体エネルギーの生きたリアルタイム変化の分析を可能にする。多くの細胞内代謝事象が数秒から数分のオーダーで起こることを考えると、イン ビトロで無傷の細胞および組織における細胞代謝フラックスのリアルタイム変化を理解するためには、リアルタイムの機能的アプローチが最も重要である。
本論文では、強制凝集アプローチを用いた in vitro 3Dスフェロイドモデルとして、がん由来細胞株A549(肺腺がん)、HepG2/C3A(肝細胞がん)、MCF-7(乳腺がん)、SK-OV-3(卵巣腺がん)を培養するためのプロトコルを提供する(図1)。また、(i)Agilent XFe96 XFアナライザーを使用して単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べる方法を詳細に説明し、(ii)単一の3Dスフェロイドを使用してXFアッセイを最適化する方法を強調し、(iii)このアプローチを使用して3Dスフェロイド代謝をプローブする重要な考慮事項と制限について説明します。最も重要なのは、この論文では、酸素消費速度(OCR)の計算が酸化的リン酸化を決定し、したがって細胞スフェロイドのミトコンドリア機能を決定することを可能にするデータセットがどのように収集されるかを説明する。このプロトコールについては分析されていないが、細胞外酸性化率(ECAR)は、XF実験においてOCRデータとともに測定される別のパラメータである。ただし、ECAR は XF データセットから不適切または誤って解釈されることがよくあります。テクノロジーメーカーの基本的なアプローチに従ってECARを計算することの限界について解説します。

<table><tbody><tr><td>A549</td><td>ECACC&</td><td>nbsp;#86012804</td><td>肺がん細胞株</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>103576-100</td><td>フェノールレッド、重炭酸ナトリウム、グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウムを含まない 1 mM HEPES を含む XF アッセイ培</td></tr>地 <tr><td>Agilent Seahorse XFe96 細胞外フラックス分析装置</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>単一スフェロイドにおけるスフェロイド酸素摂取率測定装置</td></tr><tr><td>アンチマイシン A</td><td>メルクライフサイエンス</td><td>A8674</td><td>ミトコンドリア呼吸複合体III阻害剤</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>トクリス バイオテクネ</td><td>5737</td><td>ミトコンドリアプロトノフォアアンカプラー</td></tr><tr><td>黒壁マイクロプレート</td><td>グライナーバイオワン</td><td>655076</td><td>蛍光ベースのアッセイ用</td></tr><tr><td>CELLSTAR細胞忌避表面 96 Uウェルマイクロプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>スフェロイド生成用マイクロプレート</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 細胞生存率アッセイ</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>3D微小組織スフェロイドにおける細胞生存率測定用アッセイ</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R&Dシステムズバイオテクネブランド</td><td>3439-100-01</td>ス<td>フェロイドの付着を容易にするXFe96スフェロイドマイクロプレートをコーティングするための分子細胞接着剤</td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>メルクライフサイエンス</td><td>G8270</td><td>細胞培養増殖およびXFアッセイ培地</td></tr><tr><td>Dulbecco'のためのサプリメントModified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td>HepG2/C3Aスフェロイド用培養培地</td></tr><tr><td>EVOS XL Core イメージングシステム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AMEX1000</td><td>位相コントラストイメージング顕微鏡</td></tr><tr><td>EZ-PCR マイコプラズマテストキット</td><td>バイオロジカルインダストリーズ</td><td>20-700-20</td><td>細胞培養におけるマイコプラズマスクリーニング</td></tr><tr><td>FIJIはJust Image J</td><td></td><td></td><td>照合された画像の解析</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>Supplement for cell culture medium</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;#CRL-10741</td><td>Hepatic carcinoma cell line, a clonal derivative of the parent HepG2 cell line</td></tr><tr><td>Lactate-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>Assay for measurement of lactate within spheorid culture medium</td></tr><tr><td>L-glutamine (200 mM solution)</td><td>Merk Life Sciences</td><td>G7513</td><td>細胞培養増殖およびXFアッセイ培地用サプリメント</td></tr><tr><td>M50 実体顕微鏡</td><td>Leica Microsytems</td><td>LEICAM50</td><td>Stereo dissection micrscope; speolidの取り扱いに使用</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ECACC</td><td>#86012803</td><td>乳房腺がん細胞株</td></tr><tr><td>オリゴマイシン from Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck Life Science</td><td>O4876</td><td>ATP Synthase Inhibitor</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>細胞培養培地に添加された抗生物質</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>イニ窒素</td><td>P7589</td><td>スペロイド中のdsDNAの分析</td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>メルクライフサイエンス</td><td>R8875</td><td>ミトコンドリア呼吸複合体I阻害剤</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875091</td><td>A549、MCF7、SK-OV-3の培養培地スフェロイド</td></tr><tr><td>Seahorse Analytics</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>ビルド421</td><td>https://seahorseanalytics.agilent.com</td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XFe96 スフェロイド FluxPak</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>102905-100</td><td>各タツノオトシゴXFe96スフェロイドFluxPakの内容:タツノオトシゴXFe96スフェロイドマイクロプレート6枚(102978-100)、XFe96センサーカートリッジ6個、タツノオトシゴXFキャリブラント溶液500mL(100840-000)</td></tr><tr><td>血清ピペット:5、10、25mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606107;607107;760107</td>細胞<td>培養用消耗品</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACC&</td><td>nbsp;#HTB-77</td><td>卵巣腺癌細胞株</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム(100 mM溶液)</td><td>メルクライフサイエンス</td><td>S8636</td><td>細胞培養増殖およびXFアッセイ培地用サプリメント</td></tr><tr><td>T75 cm2 細胞培養フラスコ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>組織培養処理フラスコ 細胞培養維持用フラスコ</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>細胞解離試薬</td></tr><tr><td>ウェーブコントローラーソフトウェア</td><td>アジレント・テクノロジーズ株式 会社。</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>幅広オリフィスチップ</td><td>STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td><td>スフェロイドハンドリング用の広い開口部付きピペットチップ</td></tr></tbody></table>

細胞外フラックス解析を用いた単一3d微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

スフェロイドと呼ばれる三次元(3D)細胞凝集体は、近年、 in vitro 細胞培養の最前線となっている。細胞を2次元の単一細胞単層(2D培養)として培養するのとは対照的に、スフェロイド細胞培養は、細胞外マトリックスタンパク質の発現、細胞シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質産生、分化、および増殖を含む、 生体内に存在する生理学的細胞アーキテクチャおよび特性を促進し、調節し、サポートする。3D培養の重要性は、腫瘍学、糖尿病、幹細胞生物学、組織工学など、多くの研究分野で認識されています。過去10年間で、スフェロイドを産生し、その代謝機能と運命を評価するための改良された方法が開発されました。
細胞外フラックス(XF)分析装置は、XF24膵島捕捉プレートまたはXFe96スフェロイドマイクロプレートのいずれかを使用して、スフェロイドなどの3Dマイクロ組織におけるミトコンドリア機能を探索するために使用されてきました。しかしながら、XF技術を用いたスフェロイドにおけるミトコンドリアエネルギー代謝のプロービングの明確なプロトコルおよび最適化は、詳細には記載されていない。この論文では、XFe96 XFアナライザーを搭載したスフェロイドマイクロプレートを使用して、単一の3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝を調べるための詳細なプロトコルを提供します。異なるがん細胞株を使用して、XF技術は、異なるサイズだけでなく、異なる体積、細胞数、DNA含量およびタイプの3Dスフェロイドにおける細胞呼吸を区別できることが実証されている。
オリゴマイシン、BAM15、ロテノン、およびアンチマイシンAの最適なミトコンドリアエフェクター化合物濃度は、3Dスフェロイドにおけるミトコンドリアエネルギー代謝の特異的パラメータをプローブするために使用される。この論文では、回転楕円体から得られたデータを正規化する方法についても説明し、XF技術を使用して回転楕円体代謝を探索する際に考慮すべき多くの考慮事項について説明します。このプロトコルは、高度な in vitro スフェロイドモデルの研究を促進するのに役立ちます。

十分に形成されたコンパクトなスフェロイドを得るために、各細胞株を播種密度および培養期間について個別に最適化した(図3)。A549、HepG2/C3A、およびSK-OV-3細胞株は、最初に緩い凝集体を形成し、培養7日後まで周囲が明確に定義された丸いスフェロイドに進行しなかった。逆に、MCF-7細胞は3日以内にスフェロイドを形成することができた。すべてのスフェロイドモデルについて、培養期間後の初期細胞播種密度とスフェロイド体積との間に明確な相関関係があった。スフェロイドサイズおよび形態は、播種密度に最適化した。形態学および円形度は、すべてのモデルにおいて回転楕円体サイズの増加とともに低下し始めた。細胞株の播種戦略は、A549およびSK-OV-3細胞について4×103細胞/ウェルで最適化した。HepG2/C3A細胞は、以前は他の場所で1×103細胞/ウェルに最適化されており、MCF-7細胞はすべてのアッセイで4×103細胞/ウェルで使用されていました。最適化された播種戦略では、回転楕円体体積は5.46×107...

これらのプロトコルは、タツノオトシゴの細胞外フラックス分析を使用して、3Dがん細胞株由来スフェロイドにおけるミトコンドリアエネルギー代謝を調べるのに役立ちます。

細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

私たちのプロトコルは、研究者がミトコンドリアのエネルギー代謝とシームレスなスフェロイドをプローブし、いくつかの異なる細胞株、細胞数、表現型、ならびに分野の創薬および癌研究における薬物治療の比較を可能にすることを可能にする。我々の研究は、細胞単層実験と比較して優れた生理学的モデルを提供する3Dスフェロイドを用いてミトコンドリアエネルギー代謝を探索するための詳細なプロトコルを提示する。生物学的観察は、硝子体スフェロイドからin vivo腫瘍に外挿し、スフェロイド腫瘍代謝を標的とする可能性のある経路を同定することができる。例えば、スフェロイド成長中の炭水化物有用性。タツノオトシゴの細胞外フラックス96器具のすべてのデータは非常に敏感である。アッセイプレート内のin vitroスフェロイドの位置決めは、単一のスフェロイドレベルで正確なデータを得るために最も重要です。倍率4倍の位相差を備えた倒立光学顕微鏡を使用して回転楕円体の生存率を確認し、無傷の回転楕円体構造、形態、およびサンプル間の全体的な均一性を確保します。センサーカートリッジをハイドレートするには、約20ミリリットルのキャリブラントを円錐形のチューブにアリコートします。キャリブラントを入れた円錐形チューブを非二酸化炭素37°Cのインキュベーターに入れ、一晩置きます。アッセイキットの内容物を取り出す。センサーカートリッジをユーティリティプレートの横に逆さまに置きます。200マイクロリットルの滅菌二重蒸留水をマルチチャンネルP300ピペットを用いてユーティリティプレートの各ウェルにピペットで入れた。センサーカートリッジをユーティリティープレートの上に置きます。各井戸の水位がセンサープローブを水没させるのに十分な高さであるかどうかを確認します。組み立てたセンサーカートリッジを非二酸化炭素37°Cのインキュベーターに移し、一晩放置します。スフェロイドアッセイマイクロプレートをコーティングするには、敗血症技術を用いて、スフェロイドマイクロプレートのウェルあたり30マイクロリットルの滅菌0.1ミリグラムあたり0.1ミリグラムの滅菌ポリD-リジン溶液を加える。回転楕円体マイクロプレートの各ウェルから溶液を吸引し、プレートを反転させ、ティッシュペーパーにしっかりと叩いて残留溶液を除去します。プレートの各ウェルを200マイクロリットルの滅菌二重蒸留水で洗浄する。最後の洗浄後、マイクロプレートを反転させ、ティッシュペーパーにしっかりと叩いて残留水を取り除きます。プレートを30分間風乾させてから、後で使用してください。原稿に記載されているようにXF RPMI培地を準備します。補充されたXF RPMIアッセイ培地をアッセイの1時間前に摂氏37度に予温する。コーティングしたスフェロイドアッセイ用マイクロプレートを非二酸化炭素摂氏37度のインキュベーター内で予温した。キャリブラントとセンサーカートリッジが入った円錐管をエアインキュベーターから取り出します。センサーカートリッジをユーティリティプレートから取り外し、作業台に逆さまに置きます。P300マルチチャンネルピペットを使用して、ユーティリティプレートから水を吸引し、廃棄します。200マイクロリットルの予温キャリブラントをユーティリティプレートの各ウェルに加える。センサーカートリッジをユーティリティプレートに置き、センサーがキャリブラントにしっかりと沈んでいることを確認します。組み立てたセンサーカートリッジを、ポート注入溶液をロードする準備ができるまで、非二酸化炭素、摂氏37度のインキュベーターに移します。スフェロイド培養プレートをインキュベーターから取り出し、顕微鏡下でスフェロイドを観察して、スフェロイド移動ステップの前にその完全性を確保します。任意のバックグラウンド補正ウェルを含むスフェロイドプレートの各ウェルに180マイクロリットルの予温アッセイ培地をロードする。7センチメートルのペトリ皿を3ミリリットルのアッセイ培地で部分的に充填する。スフェロイドを96ウェル培養プレートからシャーレに移し、広いオリフィスピペットチップを装填したマルチチャンネルピペットを用いて、容量を10〜50マイクロリットルに設定した。幅の広いオリフィスピペットチップを取り付けたシングルチャンネルピペッターの体積を20マイクロリットルに設定し、単一のスフェロイドを慎重に吸引します。このスフェロイドアッセイマイクロプレートの各ウェルの中央に先端を直接置き、毛細管現象を起こしてピペットチップからスフェロイドを抜き取る。ピペッターの内容物をペトリ皿にピペッティングして顕微鏡下で進化を確認します。このスフェロイドがすべてスフェロイドアッセイマイクロプレートに移されたら、プレートを非二酸化炭素37°Cのインキュベーターに最低1時間移します。原稿に記載されているように各化合物の作業ストック濃度を調製し、完全に補充された予温XF RPMIアッセイ媒体を使用する。較正されたP100マルチチャンネルピペットを用いて、各化合物の20マイクロリットルの作業溶液をすべての対応するポートに分配した。センサー・カートリッジをロードするためのアナライザーを準備します。十分に形成されたコンパクトなスフェロイドを得るために、各細胞株を、播種密度および培養期間について個別に最適化した。最適化された播種戦略では、SK-OV-3の回転楕円体体積は約5.46 x 10から7マイクロメートル立方体であり、A549では1.45 x 10から8マイクロメートル立方体であった。すべての回転楕円体タイプは、初期播種密度と回転楕円体体積との間に線形相関を有していた。完全な回転楕円体対称性は円形度が1.0であり、1.0からの偏差は円形度の損失を示した。すべてのスフェロイドタイプにおいて、酸素消費率はスフェロイドサイズとともに増加し、MCF-7スフェロイドで最も高く、SK-OV-3スフェロイドで最も低いスフェロイド体積に直線的に相関していた。MCF-7スフェロイドは、実験を通して車両制御に応答しなかった。MCF-7スフェロイドにおける酸素消費速度は、1ミリリットル当たり0.5マイクログラムの最初の注射に続く5つの測定サイクル後にオリゴマイシンで低下した。BAM15に応答して、酸素消費率は、2回目の注入前に増加した。一方、ロテノンとアンチマイシンAの組み合わせはそれを低下させた。基底ミトコンドリア呼吸を正確にプロービングするためのプロトコル。ADPリン酸化呼吸、リーク呼吸、カップリング効率、最大呼吸能力、および予備呼吸能力は、癌由来の3Dスフェロイドを用いて開発された。すべての呼吸器化合物は、選択された化合物について予想される動力学的酸素消費速度プロファイルをもたらし、ウェル当たり毎分20〜30ピコモールの酸素の平均安定した基礎呼吸速度を明らかにした。マイクロプレート内のスフェロイドの位置と化合物注入後の測定サイクル数により、化合物添加間で呼吸数が安定するようにします。アンカプラーでミトコンドリア呼吸能力を探索する場合、濃度が重要であるだけでなく、ミトコンドリアのエネルギー代謝を調べる実験でアンカプラーの前に通常添加されるオリゴマイシンの存在下で呼吸を切り離す能力も重要です。

exploring-mitochondrial-energy-metabolism-single-3d-microtissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

細胞内のミトコンドリアの機能をプロファイリングするための方法の説明が表示されます。基礎呼吸速度、ATP...

C2C12筋芽細胞を用いた生体エネルギープロファイル実験

このプロトコルは、膵臓癌細胞（Patu8902）および活性化膵臓線維芽細胞）(PS1)の共培養から生成された3Dスフェロイドに対して細胞外フラックスアッセイを行う技術について説明し、解糖とミトコンドリア呼吸という2つの主要なエネルギー産生経路を測定するためのものです。...

3Dスフェロイドにおける細胞外フラックスアッセイ:膵臓腫瘍スフェロイドの代謝活性を測定する方法

ここでは、メソッドは、膵臓がん細胞と線維芽細胞、細胞外フラックス アナライザーを使用して代謝機能の測定に続いての 3 次元 (3 D)...

準備と膵臓癌細胞と線維芽細胞の共培養を 3 次元回転楕円体の代謝アッセイ

この手法では、酸素消費量と細胞外酸性化率 explanted マウス網膜組織細胞フラックス...

細胞外のフラックスを用いた Explanted 網膜組織のエネルギー代謝の測定

このプロトコルの目的は、心臓の酸素消費量を変えることができるさまざまな要因を検討するモデル...

細胞外フラックス アナライザーを使用してプライマリの培養マウス新生児心筋酸素消費量の分析

本研究では、マイクロプレートベースの呼吸法と組み合わせて組み換えパーフリンゴライシンOを用いてミトコンドリア呼吸基質フラックスを試験する改変プロトコルについて説明する。このプロトコルを用いて、メトホルミンが2つの異なる腫瘍細胞株のミトコンドリア呼吸にどのように影響するかを示す。...

組換えペルフリンゴライシンO-透過細胞におけるミトコンドリア基質フラックスの測定

ここで提示された方法は、HSPCの細胞外酸性化速度(ECAR)および酸素消費速度(OCR)をリアルタイムで測定するために、細胞外フラックス分析装置を使用して、非付着性マウス造血幹および原始前駆細胞(HSPC)における細胞生体エネルギーを評価するための最適化されたプロトコルを要約する。...

細胞外フラックス分析装置を用いたマウス造血幹および原始前駆細胞における細胞生体エネルギーの評価

代謝細胞外フラックス分析装置を用いてマウスおよびヒト好中球およびHL60細胞のミトコンドリア呼吸を測定する段階的プロトコルについて説明する。...

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

ここでは、骨髄、脾臓、梗塞性心筋からマクロファージを抽出し、その後、生細胞の代謝フラックスを評価する方法を詳しく紹介します。...

脾臓および心臓マクロファージおよび骨髄単球における ex vivo 代謝フラックスの解析

ここでは、3次元(3D)神経膠腫スフェロイドと細胞外フラックス分析によるイメージングベースの正規化を統合した代謝プロファイリングプラットフォームを確立します。このアプローチにより、薬物治療に対する腫瘍代謝反応をより正確に評価できるようになり、耐性の潜在的なメカニズムについての洞察が得られます。...

薬物スクリーニングのための三次元脳腫瘍スフェロイドの代謝プロファイリングの進歩

このプロトコルは、一次マウスのマイクログリアにおける代謝再プログラミングを定量化するために解糖系ストレステストを費用対効果の高い方法で行います。分離および炎症刺激後、新たに調製されたpH調整試薬を用いて細胞外酸性化速度(ECAR)を測定し、その後タンパク質正規化を施して解糖分解シフトの正確かつ再現性のある評価を可能にします。...

細胞外フラックスアッセイを用いた一次ミクログリアにおける解糖系の研究

探索するSeahorse細胞外フラックス解析を用いた単一3Dスフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝。がん研究における薬剤スクリーニングと代謝経路の評価に有用な生理学的モデルを提供します。

細胞外フラックス解析を用いた単一3D微細組織スフェロイドのミトコンドリアエネルギー代謝の探索

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