Covid-19の多検体免疫ビーズアッセイを使用した血清変換の動的モニタリング

本日実証するこの方法は、COVID-19感染またはワクチン接種に関連する抗体の血清変換を日常的な分析で評価するためのハイスループットソリューションを提供します。興味深いことに、このアプローチにより、同じ分析物上の複数のエピトープを評価することができます。これは、細胞シグナル伝達研究や免疫応答のモニタリングなど、生物科学において多数の用途があります。

今日、このテクニックを皆さんに実演していただくのは、私の研究室のポスドク研究員であるイマド・タルホニ博士です。まず、ユニークなビーズ領域を持つ磁気微小球の3つの異なるバイアルを選択し、使用した各バイアルのビーズIDとロット情報を記録します。次に、選択したミクロスフェアストックを60秒間ボルテックスし、5分間超音波処理します。

6つのビーズを1.5ミリリットルの低タンパク質結合微量遠心管に10回1.0回移し、管を磁気分離器に挿入する。60秒間の分離を可能にする。チューブを磁気分離器に入れたまま、ビーズペレットを乱すことなく上澄み液を慎重に取り除きます。

磁気分離器からチューブを取り出し、ビーズを100マイクロリットルのHPLCグレードの水と渦で30秒間再懸濁します。再度、チューブを磁気分離器に戻して60秒間置き、続いて上澄み液を除去します。洗浄プロトコルを 2 回繰り返します。

最後の洗浄後、磁気分離器からチューブを取り出し、洗浄したミクロスフェアを90マイクロリットルの活性化緩衝液(pH 6.2)に30秒間ボルテックスで再懸濁する。次に、10マイクロリットル当たり50ミリグラムのアンヒドロキシ−スルホスクシンアミドおよび10マイクロリットル当たり50ミリグラムのEDC溶液で、10マイクロリットルのミクロスフェアをボルテックスにより10秒間連続的に処理する。その後、ミクロスフェアを室温で20分間インキュベートし、10分ごとに穏やかな渦を巻き起こす。

インキュベーション後、ミクロスフェアを前述のように50ミリモルのMESまたはカップリングバッファー(pH5.0)で2回洗浄します。洗濯を2回繰り返します。完了したら、磁気分離器からチューブを取り出し、ビーズを100マイクロリットルのカップリングバッファーで30秒間ボルテックスで再懸濁し、続いて直ちに所望の量のタンパク質をチューブに加える。

カップリングバッファーで全容量を150マイクロリットルにし、ボルテックスによる反応を30秒間混合する。その後、チューブを室温で回転させて2時間インキュベートする。インキュベーション後、ミクロスフェアをPBSクエンチバッファーで2回洗浄し、洗浄したミクロスフェアをボルテックスによる0.05%アジ化ナトリウムを含む100マイクロリットルのクエンチバッファーに30秒間再懸濁する。

自動セルカウンターを使用して回収されたミクロスフェアの数をカウントし、観察されたビーズ濃度を記録します。アッセイ性能のために、結合されたミクロスフェアを渦によって30秒間再懸濁し、60〜90秒間超音波処理する。次に、各ビーズコロイドの必要量を各チューブから取り出し、ビーズコロイドを新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに結合させる。

次に、チューブを磁気分離器に挿入し、60秒間分離させます。チューブを磁気分離器に入れたまま、ビーズペレットを乱すことなく上澄み液を除去します。ビーズを分離器から除去した後、ビーズを100マイクロリットルのアッセイバッファーに再懸濁する。

チューブを磁気分離器に60秒間入れる前に30秒間ボルテックスし、ビーズを分離した。洗濯を2回繰り返します。次に、適切な量のアッセイバッファーを添加して3プレックス作業ミクロスフェア混合物の濃度を調整し、各ターゲットについて1マイクロリットルあたり100マイクロスフェアの最終濃度を生成する。

25マイクロリットルのミクロスフェア混合物を96ウェルプレートの各ウェルにアリコートする。血漿または血清検体をアッセイバッファーで500倍希釈し、所望する滴定に従って標準検体を調製する。ブランクサンプルとして25マイクロリットルのアッセイバッファーを加え、希釈した検体または標準品のそれぞれを96ウェル検体プレートの各指定されたウェルに加えます。

完了したら、プレートをアルミシールまたはホイルで覆い、毎分700回転に設定したプレートシェーカー上で室温で1時間インキュベートする。原稿に記載されているように、アッセイバッファーを用いて、抗ヒト検出抗体または二次抗体溶液を1マイクロリットルあたり4マイクログラムで調製する。プレートを磁気分離器の上に置き、素早く洗浄してから、プレートをバイオハザード容器の上に強制的に反転させてウェルから液体を除去します。

プレートを反転させたまま、厚い紙の束にプレートを強制的に叩きます。次いで、各ウェルを100マイクロリットルのアッセイ緩衝液で洗浄し、バイオハザード容器上で強制的に反転させて液体を除去する。洗浄を2回繰り返します。

最後の洗濯の後、使用済みの紙の束をすべてバイオハザード容器に捨てます。次に、25マイクロリットルの二次抗体作用溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートをアルミ箔で覆い、プレートシェーカー上で毎分700回転でインキュベートする。30分間のインキュベーション後、先に実証したように、プレートのウェルをアッセイバッファーで2回洗浄する。

次いで、96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのアッセイバッファーを加える。プレートをアルミホイルで覆い、室温でプレートシェーカーで5分間インキュベートする。60マイクロリットルのサンプルを、システムマニュアルに従って計器分析器で分析します。

検体キャプチャインキュベーション時間を最適化するために、プレートを30分、60分、および120分の持続時間インキュベートします。インキュベーション後、60マイクロリットルのアッセイ混合物を分析装置上で分析する。1:5の連続希釈系列に基づく7点標準曲線を、スパイクS1、膜抗体、およびヌクレオカプシドについて評価した。

アッセイ内精度試験をプレート上で実施し、変動パーセント係数、標準偏差、および平均として計算されたアッセイ精度を評価した。アッセイ間の精度のために、ビーズセットの3つの異なるバッチをアッセイごとに調製した。標準およびヒト血漿サンプルを用いたアッセイの精度変数を計算した。

インキュベーションの120分における平均蛍光強度値の中央値は、スパイクS1、メンブレン、およびヌクレオカプシド抗体に対するIgG力価に対して最適であり、速い一次抗体結合動態を示す。デュアルチャネル性能における二次抗体濃度の最適化は、すべての濃度の線形測定において広範囲のシグナルを実証した。二次抗体の異なる時間インキュベーションから観察されたシグナルと、すべてのインキュベーション時間におけるシグナル変化の詳細がここに示されている。

デュアルチャネルアッセイの特異性評価では、ブランクチャネルとシングルレポーターチャネルとの間にごくわずかな交差シグナル汚染が観察された。COVID 19 ワクチン接種後の血清変換イベントの図では、観察されたスパイク S1 IgA および IgM 値は、IgG アイソタイプ力価よりも約 40 倍低かった。この方法は、免疫不全の個体におけるワクチンに対する応答をモニターするのに重要な意味を有する。

これにより、これらの患者が本当にこれらのワクチン接種によって保護されているかどうかを判断することができます。