Name: Covid-19の多検体免疫ビーズアッセイを使用した血清変換の動的モニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶ多検体免疫ビーズアッセイによるSARS-CoV-2抗体動態モニタリング法。IgA・IgM・IgG同時測定でワクチン効果評価や免疫応答解析に応用可能なハイスループット技術です。

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著者らは、施設の使用に対するラッシュバイオマーカー開発コア、被験者登録と生物標本処理のためのラッシュバイオリポジトリ、ウォルダー財団のシカゴコロナウイルス評価ネットワーク(シカゴCAN)イニシアチブ助成金番号SCI16(J.R.S.およびJ.A.B.)および21-00147(J.R.S.およびJ.A.B.)およびスイムアクロスアメリカ財団(J.A.B.)からの賞に感謝したい。

すべての被験者は、プロトコルORAの下でラッシュ大学医療センターの完全な治験審査委員会(IRB)の承認を得て、書面によるインフォームドコンセントで登録され20101207、倫理的研究実施のためのすべての機関ガイドラインが遵守された。血液は、従来の瀉血を介してラベンダー真空乾燥機(K2EDTA)に採取され、推奨されるプロトコルで処理された。得られた血漿を、評価が行われるまで-80°Cでアーカイブした。
1. 抗原結合ミクロスフェアの作製
<ol><li>ユニークなビーズ領域を持つ磁気微小球の3つの異なるバイアルを選択し、使用した各バイアルのビーズIDとロット情報を記録します。 注: 以下のステップは、個別の微小球領域ごとに実行されます。微小球は光に敏感であり、長期間の光への曝露から保護されるべきである。洗浄ステップ中は、ミクロスフェアを乱さないように注意してください。邪魔された場合は、2 回目の 60 秒間の分離を許可します。</li>
	<li>60秒間微小球ストックを渦巻き、凝集ビーズを解離させるために使用前に5分間超音波処理する。</li>
	<li>1.0 x106 ビーズを 1.5 mL の低タンパク質結合マイクロ遠心分離管に移します。</li>
	<li>チューブを磁気分離器に挿入し、60秒間分離できるようにします。チューブを磁気分離器に入れたまま、ビーズペレットを乱すことなく上澄み液を慎重に取り除きます。</li>
	<li>磁気分離器からチューブを取り出し、ビーズを100 μLのHPLCグレードの水で再懸濁し、30秒間渦巻きます。チューブを磁気分離器に60秒間戻し、続いて上澄み液を除去する。この洗浄プロトコルを 2 回繰り返します。</li>
	<li>磁気分離器からチューブを取り出し、洗浄したミクロスフェアを90 μLの100 mM一塩基性リン酸ナトリウム、pH 6.2(活性化バッファー)に30秒間ボルテックスで再懸濁します。</li>
	<li>10 μL の 50 mg/mL Sulfo-NHS (活性化バッファーで希釈) をミクロスフェアに加え、10 秒間穏やかに渦巻きます。50 mg/mL EDC 溶液 (活性化バッファーで希釈) を 10 μL 加え、10 秒間穏やかに渦巻きます。微小球を室温(RT)で20分間インキュベートし、10分ごとに穏やかな渦を巻き起こします。</li>
	<li>LC/MS グレードの水の代わりに 50 mM MES、pH 5.0 (カップリングバッファー) で洗浄手順 1.4 ~ 1.5 を繰り返し、合計 2 回の洗浄を行います。</li>
	<li>磁気分離器からチューブを取り出し、ビーズを100μLのカップリングバッファーで30秒間ボルテックスで再懸濁し、その後すぐに所望の量のタンパク質を添加した。</li>
	<li>カップリングバッファーで総容量を150 μLにします。ボルテックスによるカップリング反応を30秒間混合し、RTで回転させて2時間インキュベートする。 注:本明細書に定義されるアッセイのために、コンジュゲーションは、以下のタンパク質濃度で実施した:スパイクS1:5μg;ヌクレオカプシド:5μg;メンブレン:12.5μg。</li>
	<li>LC/MSグレードの水の代わりにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)-1%ヤギ血清アルブミン、0.01%ポリソルベート-20(クエンチバッファー)で洗浄ステップ1.4を繰り返し、合計2回の洗浄を行います。洗浄したミクロスフェアを、0.05%アジ化ナトリウムを含む100 μLのクエンチバッファーにボルテックスで30秒間再懸濁します。 メモ: ビーズが完全にクエンチされるまでに、少なくとも 6 時間待ってから、他の手順に進みます。</li>
	<li>自動細胞カウンターまたは血球計数器を使用して回収されたミクロスフェアの数をカウントします。観察されたビーズ濃度を記録します。</li>
	<li>結合微小球を暗所で4°Cで冷蔵する。</li>
</ol>2. 手続き
<ol><li>アッセイ性能(基本プロトコル)<ol>
<li>結合された微小球を渦によって30秒間再懸濁し、〜60〜90秒間超音波処理する。</li>
		<li>各ビーズコロイドの必要量をそれぞれのチューブから取り出し、ビーズコロイドを新しい1.5mL微量遠心チューブに結合させる。</li>
		<li>チューブを磁気セパレータに挿入し、60秒間分離させます。チューブを磁気分離器に入れたまま、ビーズペレットを乱すことなく上澄み液を慎重に取り除きます。</li>
		<li>分離器からビーズを取り出し、ビーズを100 μLのPBS-1%ウシ血清アルブミン、0.01%ポリソルベート-20(アッセイバッファー)で再懸濁し、30秒間ボルテックスします。チューブを磁気分離器に入れ、60秒間分離を行えるようにします。この洗浄プロトコル(すなわち、ステップ2.1.3-2.1.4)を2回繰り返す</li>
		<li>適切な量のアッセイバッファーを添加して、3-plex 作業ミクロスフェア混合物の濃度を調整し、各ターゲットについて 1 μL あたり 100 個のミクロスフェアの最終濃度を生成します。</li>
		<li>ステップ2.1.5で調製したミクロスフェア混合物12.5 μLを384ウェルプレートの各ウェルにアリコートするか、96ウェルプレートの各ウェルに25 μLをアリコートする。</li>
		<li>血漿/血清検体をアッセイバッファーで500倍に希釈します。所望の滴定に従って標準標本を調製する。</li>
		<li>ブランクサンプルとして12.5 μLのアッセイバッファーを追加し、希釈した検体または標準品のそれぞれを384ウェル検体プレートの各指定ウェルに、またはブランク、希釈標本または標準品を96ウェル検体プレートの各ウェルに25 μL加えます。</li>
		<li>プレートをアルミシールまたはホイルで覆い、700rpmに設定したプレートシェーカー上でRTで1時間インキュベートします。 注: 希釈曲線の概略図を 表 1 に示します。</li>
		<li>抗ヒト検出抗体の溶液(二次抗体溶液)を、ステップ2.1.11で規定されているようにアッセイバッファーを用いて4μg/mLで調製する。</li>
		<li>スーパーブライト436(SB)/ヤギ抗ヒトIgA、フィコエリスリン(PE)コンジュゲート検出抗体を4μg/mLで結合させたヤギ抗ヒトIgMを調製する。またはヤギ抗ヒトIgM、SBコンジュゲート/ヤギ抗ヒトIgG、PEコンジュゲートは4μg/mLで抗体を検出します。 注: 384 ウェルプレートフォーマットの場合、12.5 μL/ウェルの調製済み二次抗体溶液が必要であり、96 ウェルプレートフォーマットの場合、25 μL/ウェルが必要です。</li>
		<li>プレートを磁気分離器の上に置き、急速に洗浄し、バイオハザード容器上で強制的に反転させてウェルから液体を除去します。プレートを反転させたまま、厚い紙の束にプレートを強制的に叩きます。</li>
		<li>各ウェルを 100 μL のアッセイバッファーで洗浄し、前述のようにバイオハザード容器上で強制的に反転させて液体を除去します。これらのステップ (2.1.12-2.1.13) を繰り返して、合計 2 回の洗浄を行います。使用済みの紙の束はすべてバイオハザード容器に捨てます。</li>
		<li>384ウェルプレートの各ウェルに12.5 μLの二次抗体作用溶液を、または96ウェルプレートの各ウェルに25 μLを加える。プレートをアルミシールまたはホイルで覆い、700rpmに設定したプレートシェーカー上でRTで30分間インキュベートします。</li>
		<li>洗浄手順2.1.12-2.1.13を繰り返します。</li>
		<li>384ウェルプレートの各ウェルに75 μLのアッセイバッファー、または96ウェルプレートの各ウェルに100 μLを加えます。プレートをアルミシールまたはホイルで覆い、700rpmに設定したプレートシェーカー上でRTで5分間インキュベートします。</li>
		<li>システムマニュアルに従って、機器分析器を介して60 μLを分析します。</li>
	</ol></li>
	<li>検体捕捉インキュベーション時間の最適化<ol>
<li>セクション 2.1 のステップは、ステップ 2.1.9 のインキュベーション時間が 30 分、60 分、および 120 分であった期間を使用して実行します。 注:インキュベーションは、別個のプレートで、またはステップ2.1.6でステップ2.1.9に進む時間まで一時停止することによって行うことができる。所望のインキュベーション時間を達成する。</li>
		<li>メーカーの推奨に従って、60 μL のアッセイ混合物を使用して分析装置でプレート読み取りを進めます。</li>
	</ol></li>
	<li>二次抗体濃度の最適化<ol>
<li>セクション2.1で詳述されているように、この手順を実行しますが、二次抗体作用溶液(ステップ2.1.10-2.1.11で調製)中の試薬の最終濃度を以下のように変更した以外は例外です。 ヤギ抗ヒト(またはウサギ)IgM、SBコンジュゲート検出抗体(8、4、2、1および0.5μg/mL) ヤギ抗ヒト(またはウサギ)IgA、PEコンジュゲート検出抗体(8、4、2、1および0.5μg/mL)。 ヤギ抗ヒト(またはウサギ)IgG、PEコンジュゲート検出抗体(8、4、2、1および0.5μg/mL)。 ヤギ抗ヒト(またはウサギ)IgG、PEコンジュゲート/ヤギ抗ヒト(またはウサギ)IgM、SBコンジュゲート検出抗体(8、4、2、1および0.5μg/mL)。 ヤギ-抗ヒト(またはウサギ)IgA、PE-コンジュゲート/ヤギ-抗ヒト(またはウサギ)IgM、SB-コンジュゲート検出抗体(8、4、2、1および0.5 μg/mL)。</li>
		<li>メーカーの推奨に従って、60 μL のアッセイ混合物を使用して分析装置でプレート読み取りを進めます。</li>
	</ol></li>
	<li>二次抗体インキュベーション時間の最適化<ol>
<li>セクション 2.1 で詳述されているように、この手順を、ステップ 2.1.14 で定義した 15 分、30 分、60 分、および 120 分のインキュベーション期間で実行します。</li>
		<li>メーカーの推奨に従って、60 μL のアッセイ混合物を使用して分析装置でプレート読み取りを進めます。</li>
	</ol></li>
	<li>最適化されたデュアルチャネルアッセイによる対象検体の評価<ol>
<li>Covid-19ワクチン(すなわち、2回目の投与)投与の完了に対して、-21、-11、-1/0、+14、+28、+60、+90、および+120日目に被験者血漿サンプル(n = 4)を採取する。 注:0日目は、ワクチン接種が完了した時点を表す。</li>
		<li>IgG/IgM または IgA/IgM デュアルチャネルアッセイのいずれかとして、ベースプロトコル (セクション 2.1.) を使用してすべてのアッセイを実行します。</li>
		<li>結果を、各特異的免疫グロブリンおよびアッセイについて観察された最大中央蛍光強度(MFI)値に正規化する。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

ボルジア博士は、特許出願中のこの原稿で使用されている血清学的検査の発明者です。この記事は、著者の競合によってもたらされる潜在的なバイアスを避けるために統計分析が提示されていない状態でのみ記述的な方法で提示されています。

SARS-CoV-2曝露に対する免疫応答の評価は、RT-PCRに基づく感染状態のサーベイランスと併せて、Covid-19からの回復過程を明確にし、潜在的な治療価値を有する回復期血漿を同定し、集団規模で感染率を調査する手段として役立つ処方箋としてよく説明されている10,11。ヒト被験者における血清変換を理解するための異なる例には、タンパク質(抗原)アレイ12、イムノブロット13、迅速イムノクロマトグラフィー構築物14、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)15、16、17が含まれる。これらの前述の技術の各々は、軽微な修飾で複数の免疫グロブリンアイソタイプを個々に評価することができる。しかし、これらの手順は、この原稿で提示されているように、複数のアイソタイプの並列分析を可能にするために実質的に再利用することができず、コストとスループットの要因を人口ベースのスケールテスト戦略におけるそれらの管理の制限としてレンダリングする。これらのアプリケーションのいくつかはまた、提示されたとおりに、または多重ELISA18、19などの改変されたフォーマットのいずれかで、複数の抗原のレベルを並列に連結する機会を提供する。最後に、イムノビーズプラットフォームは、複数の抗原のレベルを並行して評価する可能性を提供する20,21が、アッセイごとに単一のエピトープ(すなわち、免疫グロブリンアイソタイプ)に限定されていたが、「デュアルチャネル」アッセイ能力を有する最近の装置が採用されていない限り、
このレポートでは、Covid-19ワクチン接種を受けた個人の血清変換のケーススタディにおいて、「デュアルチャネル」モードで機器を使用するイムノビーズアッセイにおける複数のエピトープの信頼性の高い測定を確立するプロトコルが列挙されています。この方法は、実験室の自動化システムの統合により改善される可能性のある手動アッセイ設計を使用して、優れた精度(%CV値は通常<20%)を示しました。選択されたすべての分析物およびエピトープについてのアッセイ感度およびダイナミックレンジは、日常的な評価に適していた。市販の抗抗原IgAおよびIgM免疫試薬の欠如は、定量をIgGアイソタイプに制限したが、そのような制限は、キャリブラントとして特定の検体に対して半定量的評価または評価を提供する能力を排除するものではない22、23。
検証済みのイムノビーズアッセイは、Covid-19ワクチンで免疫された個人のコホートにおける血清変換を調査するために割り当てられました。他の同様のプラットフォームとは対照的に、インストルメンテーションファミリは、手動ワークフローで1日あたり数百人、自動スキームで1日あたり数千人の個人で血清変換の探査を可能にします。全体として、これらの知見は、「デュアルチャネル」アプローチが、同一のアッセイに対して複数のエピトープを並列に記述するための適切な感度を有し、マルチアナライトのコンテキストで実行可能であることを確認する。フィコエリスリンおよびスーパーブライト436蛍光色素でそれぞれ実施されるチャネル1およびチャネル2に対する感度の違いは、特定の実験に対して実行可能な分析結果が確実に取得されるように、特定の実験の設計を保証する可能性がある。すなわち、より低い有病率のエピトープまたは分析物に対するチャネル1の予約は、未知数の観察値を含むアッセイのダイナミックレンジを維持するために必要であり得る。この考慮事項を超えて、アッセイ設計は明白であり、分析能力が限られているラボで容易にアクセスできるはずです。図 5で述べたように、チャネル1からチャネル2への干渉を考慮する際には、この考慮事項を考慮する必要があります。したがって、存在量の多いアイソタイプからの干渉は、デュアルチャネル形式で測定した場合、存在量がはるかに低いアイソタイプに対して誤解を招く分析誤差を引き起こす可能性があります。分析物濃度が大きく異なる状況への干渉のこの可能性は、アッセイ設計段階で適切に処理されない場合、アプローチに大きな制限を表す可能性があります。
結論として、Covid-19感染またはワクチン接種に対する免疫応答に関連する主要な免疫グロブリンアイソタイプからの抗体価を迅速に測定する方法が提示された。このアプローチを縦断的に適用して血清変換を評価することで、疾患の経過を管理および/または監視したり、あるいは将来のCovid-19ブースターワクチンプログラムをガイドしたりするために、よりよく使用できる洞察が得られる可能性があります。

生物学的サンプル中の複数の疾患関連バイオマーカーの同時測定により、病理学的プロセスに関する記述的および予測的な洞察が可能になります。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの従来の単一分析物免疫学的手順は、臨床および研究の両方の場面で定量分析の礎石となってきましたが、これらの技術は、スループット、各測定に必要な検体の量、および疾患コース全体で頻繁に絡み合う複数の生物学的要素の研究を大幅に制限する費用対効果に関してかなりの制限を持つ可能性があります1.微小球ベースの多重化技術は、アッセイを組み合わせてラボのスループットを向上させ、サンプルの不足を軽減し、反復検査を減らしてコスト削減を最大化する能力のために、診断施設と研究施設の両方にとって不可欠なプラットフォームとなっています1,2,3,4。近年、この多重化能力のさらなる増強が、デュアルレポーター機能を有する機器によって導入されている。デュアルレポーター機能は、検出用に2つの蛍光チャネルを実装し、別の次元の多重化を提供し、同じ分析物上の複数のエピトープの検出を可能にします。
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、現在のコロナウイルス病2019(COVID-19)パンデミック5の原因となる病原体です。RT-PCR検査は、疾患経過の開始時の感染確認に不可欠ですが、抗体価の血清学的検査は、以前の曝露または回復に関する個人の正確かつ完全な批判に不可欠であることが証明されています。予防接種に対する応答;および/またはCovid-19ワクチン接種の有効性の評価6,7。
このレポートでは、フローベースのマルチプレックスリーダーデュアルレポートシステムを利用する複数のSARS-CoV-2ウイルス抗原の血清変換を測定する方法を説明します。具体的には、スパイク S1、ヌクレオカプシド、およびメンブレン (別名マトリックス) 糖タンパク質のアッセイを含む 3 プレックス SARS-CoV-2 抗原パネルに対する 2 つの抗体サブタイプ (IgG/IgM または IgA/IgM として構成) の同時検出について説明します。このアプローチは、縦断的な血清変換のキャプチャに理想的な企業を提供し、Covid-19パンデミックに対する武器庫の貴重なツールに貢献します。

<table><tbody><tr><td>384ウェルブラックサイドポリスチレンマイクロタイタープレート</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-565-346</td><td></td></tr><tr><td>活性化緩衝液 (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)</td> <td>社内</td><td></td><td></td>で調製</tr><tr><td>アッセイ緩衝液 (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)</td> <td>Prepared in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, heat shock fraction</td><td>MilliporeSigma</td><td>A-7888-50G</td><td></td></tr><tr><td>カップリングバッファー (50 mM MES, pH 5.0)</td><td>Prepared in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)</td><td>MyBioSource</td><td>MBS8574735</td><td></td></tr><tr><td>Disposable pipette tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)</td><td>Thermo Fisher</td><td>PIA35391</td><td></td></tr><tr><td>ヤギアルブミン、フラクションVパウダー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A2514-1G</td><td></td></tr><tr><td>IgAヤギ反ヒト、R-PE、ポリクローナル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>OB205009</td><td></td></tr><tr><td>IgGヤギ抗ヒト、R-PE、ポリクローナル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>OB204009</td><td></td></tr><tr><td>IgGヤギ抗ウサギ、R-PE、ポリクローナル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>OB403009</td><td></td></tr><tr><td>IgMヤギ反ヒト、R-PE、ポリクローナル</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td>OB202009</tr><tr><td>IgM マウス 抗ヒト SB 436 クローン SA-DA4</td><td>サーモフィッシャー</td><td>62999842</td><td></td></tr><tr><td>装置分析装置</td><td>ルミネックス</td><td>INTELLIFLEX-RUO</td><td></td></tr><tr><td>低結合微量遠心チューブ (1.5 mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-698-794</td><td></td></tr><tr><td>MagPlex-C Microspheres, Region XXX</td><td>Luminex Corp.</td><td>MC10XXX-01</td><td></td></tr><tr><td>MES水和物(2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸水和物)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートアルミシールテープ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>07-200-683</td><td></td></tr><tr><td>ポリソルベート-20</td><td>サーモフィッシャー</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>クオリティバイオロジカル PBS、pH 7.2</td><td>サーモフィッシャー</td><td>50-751-7328</td><td></td></tr><tr><td>クエンチバッファー (PBS, 1% ヤギ血清アルブミン, 0.01% ポリソルベート-20)</td><td>Prepared in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)</td><td>Sino Biologicals</td><td>40588-V08B</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)</td><td>Sino Biologicals</td><td>40591-V08H</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb</td><td>Sino Biologicals</td><td>40592-T62</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb</td><td>Sino Biologicals</td><td>40588-R0004</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb</td><td>ProSci</td><td>10-516</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)</td><td>Thermo Fisher</td><td>PIA39269</td><td></td></tr><tr><td>Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)</td><td>社内</td><td></td><td></td></tr><tr><td>で調製水、LC/MSグレード</td><td>サーモフィッシャー</td><td>W-64</td><td></td></tr></tbody></table>

covid-19の多検体免疫ビーズアッセイを使用した血清変換の動的モニタリング

Dynamic Monitoring of Seroconversion using a Multianalyte Immunobead Assay for Covid-19

複数のバイオマーカーを協調して尋問するためのマルチプレックス技術は、数十年前から存在してきました。しかしながら、同じ分析物上の複数のエピトープを評価する方法は、依然として限定的である。この報告は、SARS-CoV-2感染またはワクチン接種に対する免疫応答に関連する一般的な免疫グロブリンアイソタイプ(例えば、IgA、IgM、およびIgG)の血清学的試験のための多重化免疫ビーズアッセイの開発および最適化について記載している。アッセイは、デュアルチャネル機能を備えたフローベースのマルチプレックス蛍光リーダーを使用して達成されました。最適化は、分析物の捕捉時間、検出抗体濃度、および検出抗体のインキュベーション時間に焦点を当てました。分析アッセイ性能特性(例えば、アッセイ範囲(定量の下限および上限を含む)、およびアッセイ内およびアッセイ間の精度)は、「デュアルチャネル」モードを使用して、IgG/IgMまたはIgA/IgM血清型の組み合わせのいずれかについて確立されました。IgG で 30 分、IgM で 60 分、IgA で 120 分という分析物の捕捉時間は、ほとんどのアプリケーションに適しており、アッセイ性能とスループットのバランスが取れていました。最適な検出抗体を 4 μg/mL で 30 分間インキュベーションすることが観察され、全体的に優れた精度 (分散係数 (%CV) ≤ 20%) および観察された感度値を考慮すると、一般的な用途に推奨されます。IgG アイソタイプのダイナミックレンジは、各アッセイ (スパイク S1、ヌクレオカプシド、およびメンブレン糖タンパク質) で数桁に及び、臨床応用のための 1:500 希釈係数での堅牢な力価評価をサポートします。最後に、最適化されたプロトコルを、SARS-CoV-2ワクチンレジメンを完了した被験者(n = 4)のスパイクS1血清変換のモニタリングに適用した。このコホート内で、スパイクS1 IgGレベルは、2回目の投与投与後14日目に、IgMまたはIgAアイソタイプよりもはるかに高い(〜40倍)シグナル強度で最大力価に達することが観察された。興味深いことに、我々は、主に被験者依存性であった高度に変動するスパイクS1 IgG力価崩壊速度が観察されたことを観察した。

この記事では、SARS-CoV-2感染またはワクチン接種に対する免疫応答から生じる2つの免疫グロブリンアイソタイプ(IgA、IgM、またはIgGのいずれか)の抗体価の動的変化を同時にモニタリングするための便利な方法について説明します。この「マルチアナライトCovid-19免疫応答パネル」は、「デュアルチャネル」機能を備えたフローベースのマルチプレックスリーダーを使用して読み取られるコード化されたミクロスフェア上に構築された3つの間接イムノアッセイを採用しています。

Covid-19の多検体免疫ビーズアッセイを使用した血清変換の動的モニタリング

Multiplex technologies for interrogating multiple biomarkers in concert have existed for several decades; however, methods to evaluate multiple epitopes ...

本日実証するこの方法は、COVID-19感染またはワクチン接種に関連する抗体の血清変換を日常的な分析で評価するためのハイスループットソリューションを提供します。興味深いことに、このアプローチにより、同じ分析物上の複数のエピトープを評価することができます。これは、細胞シグナル伝達研究や免疫応答のモニタリングなど、生物科学において多数の用途があります。今日、このテクニックを皆さんに実演していただくのは、私の研究室のポスドク研究員であるイマド・タルホニ博士です。まず、ユニークなビーズ領域を持つ磁気微小球の3つの異なるバイアルを選択し、使用した各バイアルのビーズIDとロット情報を記録します。次に、選択したミクロスフェアストックを60秒間ボルテックスし、5分間超音波処理します。6つのビーズを1.5ミリリットルの低タンパク質結合微量遠心管に10回1.0回移し、管を磁気分離器に挿入する。60秒間の分離を可能にする。チューブを磁気分離器に入れたまま、ビーズペレットを乱すことなく上澄み液を慎重に取り除きます。磁気分離器からチューブを取り出し、ビーズを100マイクロリットルのHPLCグレードの水と渦で30秒間再懸濁します。再度、チューブを磁気分離器に戻して60秒間置き、続いて上澄み液を除去します。洗浄プロトコルを 2 回繰り返します。最後の洗浄後、磁気分離器からチューブを取り出し、洗浄したミクロスフェアを90マイクロリットルの活性化緩衝液(pH 6.2)に30秒間ボルテックスで再懸濁する。次に、10マイクロリットル当たり50ミリグラムのアンヒドロキシ−スルホスクシンアミドおよび10マイクロリットル当たり50ミリグラムのEDC溶液で、10マイクロリットルのミクロスフェアをボルテックスにより10秒間連続的に処理する。その後、ミクロスフェアを室温で20分間インキュベートし、10分ごとに穏やかな渦を巻き起こす。インキュベーション後、ミクロスフェアを前述のように50ミリモルのMESまたはカップリングバッファー(pH5.0)で2回洗浄します。洗濯を2回繰り返します。完了したら、磁気分離器からチューブを取り出し、ビーズを100マイクロリットルのカップリングバッファーで30秒間ボルテックスで再懸濁し、続いて直ちに所望の量のタンパク質をチューブに加える。カップリングバッファーで全容量を150マイクロリットルにし、ボルテックスによる反応を30秒間混合する。その後、チューブを室温で回転させて2時間インキュベートする。インキュベーション後、ミクロスフェアをPBSクエンチバッファーで2回洗浄し、洗浄したミクロスフェアをボルテックスによる0.05%アジ化ナトリウムを含む100マイクロリットルのクエンチバッファーに30秒間再懸濁する。自動セルカウンターを使用して回収されたミクロスフェアの数をカウントし、観察されたビーズ濃度を記録します。アッセイ性能のために、結合されたミクロスフェアを渦によって30秒間再懸濁し、60〜90秒間超音波処理する。次に、各ビーズコロイドの必要量を各チューブから取り出し、ビーズコロイドを新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに結合させる。次に、チューブを磁気分離器に挿入し、60秒間分離させます。チューブを磁気分離器に入れたまま、ビーズペレットを乱すことなく上澄み液を除去します。ビーズを分離器から除去した後、ビーズを100マイクロリットルのアッセイバッファーに再懸濁する。チューブを磁気分離器に60秒間入れる前に30秒間ボルテックスし、ビーズを分離した。洗濯を2回繰り返します。次に、適切な量のアッセイバッファーを添加して3プレックス作業ミクロスフェア混合物の濃度を調整し、各ターゲットについて1マイクロリットルあたり100マイクロスフェアの最終濃度を生成する。25マイクロリットルのミクロスフェア混合物を96ウェルプレートの各ウェルにアリコートする。血漿または血清検体をアッセイバッファーで500倍希釈し、所望する滴定に従って標準検体を調製する。ブランクサンプルとして25マイクロリットルのアッセイバッファーを加え、希釈した検体または標準品のそれぞれを96ウェル検体プレートの各指定されたウェルに加えます。完了したら、プレートをアルミシールまたはホイルで覆い、毎分700回転に設定したプレートシェーカー上で室温で1時間インキュベートする。原稿に記載されているように、アッセイバッファーを用いて、抗ヒト検出抗体または二次抗体溶液を1マイクロリットルあたり4マイクログラムで調製する。プレートを磁気分離器の上に置き、素早く洗浄してから、プレートをバイオハザード容器の上に強制的に反転させてウェルから液体を除去します。プレートを反転させたまま、厚い紙の束にプレートを強制的に叩きます。次いで、各ウェルを100マイクロリットルのアッセイ緩衝液で洗浄し、バイオハザード容器上で強制的に反転させて液体を除去する。洗浄を2回繰り返します。最後の洗濯の後、使用済みの紙の束をすべてバイオハザード容器に捨てます。次に、25マイクロリットルの二次抗体作用溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加え、プレートをアルミ箔で覆い、プレートシェーカー上で毎分700回転でインキュベートする。30分間のインキュベーション後、先に実証したように、プレートのウェルをアッセイバッファーで2回洗浄する。次いで、96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルのアッセイバッファーを加える。プレートをアルミホイルで覆い、室温でプレートシェーカーで5分間インキュベートする。60マイクロリットルのサンプルを、システムマニュアルに従って計器分析器で分析します。検体キャプチャインキュベーション時間を最適化するために、プレートを30分、60分、および120分の持続時間インキュベートします。インキュベーション後、60マイクロリットルのアッセイ混合物を分析装置上で分析する。1:5の連続希釈系列に基づく7点標準曲線を、スパイクS1、膜抗体、およびヌクレオカプシドについて評価した。アッセイ内精度試験をプレート上で実施し、変動パーセント係数、標準偏差、および平均として計算されたアッセイ精度を評価した。アッセイ間の精度のために、ビーズセットの3つの異なるバッチをアッセイごとに調製した。標準およびヒト血漿サンプルを用いたアッセイの精度変数を計算した。インキュベーションの120分における平均蛍光強度値の中央値は、スパイクS1、メンブレン、およびヌクレオカプシド抗体に対するIgG力価に対して最適であり、速い一次抗体結合動態を示す。デュアルチャネル性能における二次抗体濃度の最適化は、すべての濃度の線形測定において広範囲のシグナルを実証した。二次抗体の異なる時間インキュベーションから観察されたシグナルと、すべてのインキュベーション時間におけるシグナル変化の詳細がここに示されている。デュアルチャネルアッセイの特異性評価では、ブランクチャネルとシングルレポーターチャネルとの間にごくわずかな交差シグナル汚染が観察された。COVID 19 ワクチン接種後の血清変換イベントの図では、観察されたスパイク S1 IgA および IgM 値は、IgG アイソタイプ力価よりも約 40 倍低かった。この方法は、免疫不全の個体におけるワクチンに対する応答をモニターするのに重要な意味を有する。これにより、これらの患者が本当にこれらのワクチン接種によって保護されているかどうかを判断することができます。

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