Name: 土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 学ぶ昆虫病原性菌類の分離法。Galleria mellonellaを餌とする手法と選択培地を用い、熱帯土壌からMetarhizium属51株を分離する効率的な方法を解説。バイオ農薬開発と生態学研究に貢献します。

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この研究は、ブラジルのCoordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)、財務コード001、Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)(プロジェクト番号E-26/010.001993/2015)、ブラジルのConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico(CNPq)によって部分的に資金提供されました。

本研究がブラジルの遺伝遺産にアクセスしたため、この研究は、AA47CB6コードの下で、遺伝遺産および関連伝統的知識の管理のための国家システム(Sisgen)に登録されました。
1. 土壌サンプリング
<ol><li>小さなシャベルを使用して、800gの土壌(二次植物の根の有無にかかわらず)を10cmの深さまで集める。実験開始まで室温でポリプロピレン製袋に保管してください。 注:EPFが根圏能力を有すると報告されているため、小さな根も採取することができる。サンプルの処理が速いほど、真菌の胞子は時間の経過とともに生存率が低くなる可能性があるため、より良いです。本研究では、サンプルは、収集後7日以内に分析された。</li>
	<li>GPS を使用して、収集されたサンプルの位置を緯度と経度で識別し、土壌の種類 (草原、原生の熱帯雨林、湖畔、耕作地など) に従って収集された領域を分類します。</li>
</ol>2. 昆虫病原性真菌の単離方法
<ol><li>CTC選択的人工培地を用いた単離。<ol>
<li>CTC培地[ジャガイモデキストロース寒天に酵母エキス(PDAY)を加えたものにクロラムフェニコール0.5g/L、チアベンダゾール0.001g/L、シクロヘキシイミド0.25g/Lを添加]を調製するには、すべての試薬を個別に計量し、蒸留水で混合し、培地をオートクレーブで滅菌する。バイオセーフティキャビネットに、培地23mLを60mm×15mmのペトリプレートにプレートする。 注意: CTC 試薬の重量を量るときは、シクロヘキシミドとクロラムフェニコールは有毒であるため、白衣、マスク、手袋、ゴーグルを使用してください。</li>
		<li>各土壌サンプルの重量0.35±0.05g(根の有無にかかわらず)を計量し、1.5mLのマイクロチューブに入れます。</li>
		<li>バイオセーフティキャビネットに、滅菌0.01%(vol/vol)ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート水性懸濁液1mLを土壌および渦を含むマイクロチューブに30秒間加える。</li>
		<li>50 μLの上清を除去し、CTC培地でペトリプレートの中央にピペットでピペットします。滅菌ドリガルスキヘラ(直径6mm)を用いて懸濁液を培地の表面に均質に分散させる。 注: 土壌サンプルごとに少なくとも 3 回の反復を準備する必要があります。</li>
		<li>プレートを気候室(25±1°C、相対湿度≥80%)で暗所でインキュベートし、7、14、および21日間のインキュベーション後の真菌コロニーの成長を観察した。</li>
		<li>EPFを求める真菌コロニーのマクロ形態およびミクロ形態を観察する。純粋な培養物が得られるまで、EPF培養物を0.05%クロラムフェニコール(PDAC)を加えたジャガイモデキストロース寒天培地に移す。 注: EPF コロニーの識別には、ステップ 3 で以下に示した説明キーを使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>昆虫餌を用いた隔離<ol>
<li>表面消毒されたG. メロネラ および T.モリター 後期幼虫を使用する。幼虫を0.5%次亜塩素酸ナトリウムに1分間浸漬して滅菌する。滅菌水を使用して幼虫を2回洗浄する。 注:第4段階からの G.メロネラ 幼虫を本研究に使用した。 T.モリター 幼虫期は標準化されなかった。</li>
		<li>餌を組み立てるためにプラスチック製の鍋を使用してください。集めた土250gを各プラスチックポットに加えます(幅98mm×高さ47mm×長さ142mm)。各種の15匹の幼虫(T.モリトール と G.メロネラ)を分離し、プラスチックポットあたり5匹の幼虫を堆積させる。ポットを25±1°C、相対湿度≥80%の暗所に保管してください。 メモ: ポットの蓋に 10 個の小さな穴 (直径 2 mm) をあけて、換気できるようにします。鋭利な加熱された鉄の装置を使用して穴をあけることができます。</li>
		<li>幼虫と土壌との最大の接触を可能にするために、1日おきに土壌を均質化する。 注:水分は幼虫の真菌感染をサポートするために重要です。土壌中の水分を維持するために、必要に応じて土壌表面に滅菌蒸留水を噴霧する。土壌サンプルを水に浸さないでください。</li>
		<li>死んだ昆虫を求めて毎日鍋を分析してください。 注:昆虫が感染していないことを確認するために、無脊椎動物の病理学的徴候についてコロニー内の残りの幼虫を毎日観察してください。別の方法として、昆虫の幼虫の健康状態をチェックするために、滅菌土壌を有する対照ポットを研究に含めることができる。</li>
		<li>死んだ昆虫を取り除き、表面的には0.5%次亜塩素酸ナトリウムで1分間殺菌する。昆虫病原性真菌(真菌症)の外在化を促進するために、滅菌昆虫を25≥1°Cで湿ったチャンバー(相対湿度±80%)に7日間置く。</li>
		<li>真菌症の際には、昆虫の表面から分生子を収穫する。微生物学的ループを使用して、実体顕微鏡下でPDAC培地上に分生子を配置する。別の方法として、感染した幼虫全体をPDAC培地上に置く。培養プレートを25±1°Cおよび相対湿度80%の気候チャンバー≥インキュベートする。</li>
		<li>プレート上の真菌コロニーのマクロ形態および微形態を観察し、EPFの同一性を確認する。純粋な真菌コロニーが得られるまでPDAC上で培養を繰り返す。 注: EPF コロニーの識別には、ステップ 3 で以下に示した説明キーを使用します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. EPF(メタリシウム 属および ボーベリア 属)の同定
<ol><li>プレート上の真菌培養物のマクロ形態学的特性(すなわち、コロニーの表面および逆、それらの形状、縁、増殖速度、色、質感、拡散性色素、滲出液、および空中分生子)を、25±1°Cおよび相対湿度≥80%で14日後に分析する。</li>
	<li>空中分生子をスライド培養(マイクロカルチャー技術)16に移し、25±1°Cおよび相対湿度≥80%で3日間、ラクトフェノールブルーで染色し、顕微鏡的特徴(すなわち、分生子の配置、分生子、分生子の形状、およびサイズ)17、18、19、20を観察した。</li>
	<li>光学顕微鏡を用いて顕微鏡で微視的な真菌構造を観察し、EPF同定を確認した。 注:EPFの形態学的鍵は、Bischoffら、Rehnerら、Seifertら、およびHumber17,18,19,20による報告に記載されている。真菌コロニーのマクロおよびミクロ形態は、属レベルで糸状真菌を同定するために使用される最も頻繁な基準である。EPFの属に応じて、これらの形態学的特徴は変化するであろう。ハンバー20は、真菌性昆虫病原体の主要属への同定鍵を提示する。メタリシウム属コロニーは、例えば、通常、円形であり、粉末状であり、緑色の様々な色合いを呈し、かつ滲出液を提示することができる。微視的には、これらのコロニーは、広枝状の分生子上に頂端の分生子細胞を有し、密集した絡み合った分生子がコンパクトなハイメニウムを形成し、円筒形から楕円体状の分生子を平行な鎖状にして柱または板状の塊を形成する。ボーベリア属のコロニーは、通常、白色、粉末状、または綿状である。それらは、ジグザグ方向に頂端的に延びる拡張基底部分を有する分生細胞を示す。ボーベリア分生子は、地球形の分生子の密集したクラスターを形成する。種レベルでのEPFの同定には分子分析が必要です。</li>
	<li>分離株の分子解析を行い、種レベルで分類学的同定を行う。本研究で単離されたEPF株、すなわちメタリジウム属およびボーベリア属について、Bischoff et al.17およびRehner et al.18の報告に基づいて分子解析を行う。</li>
	<li>分離株がEPFであることを確認した後、分離株を真菌培養物の集合体に寄託する。本研究では、分離株は、リオデジャネイロ連邦農村大学の微生物制御研究所(LCM)からの昆虫病原性真菌培養コレクションに寄託された。</li>
</ol>

<ol><li>Roberts, D. W., St. Leger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metarhizium+spp.%2C+cosmopolitan+insect-pathogenic+fungi%3A+Mycological+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metarhizium spp., cosmopolitan insect-pathogenic fungi: Mycological aspects.</a> Advances in Applied Microbiology. 54, 1-70 (2004).</li>
<li>do Nascimento Silva, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cost-effective+bioconversion+process+of+palm+kernel+cake+into+bioinsecticides+based+on+Beauveria+bassiana+and+Isaria+javanica%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">New cost-effective bioconversion process of palm kernel cake into bioinsecticides based on Beauveria bassiana and Isaria javanica.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (6), 2595-2606 (2018).</li>
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<li>Garrido-Jurado, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+endophytic+colonization+of+melon+plants+by+entomopathogenic+fungi+after+foliar+application+for+the+control+of+Bemisia+tabaci+Gennadius+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Transient endophytic colonization of melon plants by entomopathogenic fungi after foliar application for the control of Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae).</a> Journal of Pest Science. 90, 319-330 (2016).</li>
<li>Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entomopathogenic+fungi+in+Portuguese+vineyards+soils%3A+suggesting+a+%27Galleria-Tenebrio-bait+method%27+as+bait-insects+Galleria+and+Tenebrio+significantly+underestimate+the+respective+recoveries+of+Metarhizium+%28robertsii%29+and+Beauveria+%28bassiana%29%5BTitle%5D)+AND+%22MycoKeys%22%5BJournal%5D)">Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: suggesting a 'Galleria-Tenebrio-bait method' as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana).</a> MycoKeys. 38, 1-23 (2018).</li>
<li>Riddell, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+stained+mycological+preparations+obtained+by+slide+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture.</a> Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).</li>
<li>Bischoff, J., Rehner, S. A., Humber, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multilocus+phylogeny+of+the+Metarhizium+anisopliae+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">A multilocus phylogeny of the Metarhizium anisopliae lineage.</a> Mycologia. 101 (4), 512-530 (2009).</li>
<li>Rehner, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+and+systematics+of+the+anamorphic%2C+entomopathogenic+genus+Beauveria%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Phylogeny and systematics of the anamorphic, entomopathogenic genus Beauveria.</a> Mycologia. 103 (5), 1055-1073 (2011).</li>
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<li>Keyser, C. A., De Fine Licht, H. H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+within+the+entomopathogenic+fungal+species+Metarhizium+flavoviride+associated+with+agricultural+crops+in+Denmark%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark.</a> BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).</li>
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著者には利益相反はありません。

自然土壌と農業土壌の生息地は、EPF22の典型的な環境であり、優れた自然の貯水池です。本研究では、昆虫餌対選択的培地を用いたEPF単離の2つの方法が取り組まれた。単離のための最初のステップは、土壌サンプルの収集である。土壌サンプルの適切な保管と同定は非常に重要です。緯度、経度、土壌タイプ、バイオームに関する情報は、疫学的、モデリング的、および地理空間的主題を含む研究に不可欠である23,24。収集後、これらの土壌サンプル中の分生子の生存率は最終的に低下する可能性があるため、サンプルをできるだけ早く(好ましくは7日以内に)処理することが推奨される。CTCを用いたEPF単離における重要なステップには、a)インキュベーション後1および2週間のCTCプレートの調査(後の段階で他の真菌コロニーがEPFの発生を狭める可能性があるため、最初の数週間が重要である)、およびb)マクロ形態および微形態に基づいてEPFコロニーを正確に同定することが含まれる。昆虫の餌を使用して隔離するには、土壌サン...

土壌は、昆虫病原性真菌(EPF)を含むいくつかの微生物の供給源である。真菌のこの特定のグループは、節足動物宿主、特に昆虫1をコロニー形成し、しばしば殺す能力によって認識される。単離、特性評価、毒性株の選択、および登録後、EPFは節足動物 - 害虫防除のために大量生産され、その経済的関連性を支持する2。したがって、EPFの単離は、バイオ殺有害生物剤の開発への第一歩と考えられている。ボーベリア属(Hypocreales:Cordycipitaceae)およびMetarhizium spp.(Hypocreales:Clavicipitaceae)は、節足動物 - 害虫防除に使用される最も一般的な真菌である3。EPFは、土壌、目に見える真菌症を有する節足動物、コロニー形成植物、および植物根圏4,5から首尾よく単離されている。
EPFの単離は、この特定のグループの多様性、分布、および生態学を研究するのにも有用であり得る。最近の文献は、EPFの使用が過小評価されていると報告し、植物の成長を改善する能力4、土壌から有毒な汚染物質を除去する能力、および薬6に使用されるEPFのいくつかの非従来型用途を引用している。本研究は、昆虫餌を用いた土壌からのEPFの単離効率を人工培養培地7、8、9と比較することを目的とする。Galleria mellonella L.(鱗翅目:Phyralidae)を昆虫の餌として使用することは、EPF単離の文脈でよく受け入れられている。これらの幼虫は、宿主-病原体相互作用を研究するための実験モデルとして、科学界によって世界中で使用されている10,11。Tenebrio molitor L. (鞘翅目:Tenebrionidae)幼虫は、この昆虫が低コストで実験室でまれにしやすいため、毒性を伴う研究およびEPFの単離のための別の昆虫モデルと考えられている7,12。
様々なPCR技術を用いるなどの培養に依存しない方法を適用して、土壌13、14を含むそれらの基質上のEPFを検出および定量することができる。それにもかかわらず、これらの真菌コロニーを適切に単離するためには、それらの基質を選択的人工培地9上で培養するか、または試料中に存在する真菌を感受性昆虫15を用いて餌付けすることができる。一方、CTCは、クロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天からなるドジンフリーの人工培地である。この培地はフェルナンデスらによって開発された。9は土壌からの天然に存在するボーベリア属およびメタリジウム属菌の回収率を最大化する。一方、G. mellonellaおよびT. molitor幼虫は、土壌からEPF分離株を得るための餌として首尾よく使用することもできる。それにもかかわらず、Sharma et al.15によると、これら2つの餌昆虫の併用と比較を報告した研究は少なかった。ポルトガルのブドウ畑の土壌は、メタリシウム・ロベルツィイ(Metscn)の大幅な回復を示した。ソロキンはTを用いた。 G.メロネラ幼虫と比較したモリター幼虫;対照的に、ボーヴェリア・バッシアナ(バルス・クライブ)ヴュイル単離は、G.メロネラ餌15の使用と関連していた。したがって、どのEPF単離方法(すなわち、G. mellonella-bait、T. molitor-baitまたはCTC培地)を使用するかの決定は、研究の目標および実験室インフラストラクチャに従って考慮されるべきである。本研究の目的は、土壌サンプルからEPFを単離するための昆虫餌と人工選択培地の使用の有効性を比較することである。

<table><tbody><tr><td>オートクレーブ</td><td>フェニックス ルフェルコ</td><td>9451</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>エアストリーム ESCO</td><td>AC2-4E3</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>クライメートチャンバー</td><td>Eletrolab</td><td>EL212/3</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>RBR</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Drigalskiへらマリ</td><td>エンフェルド</td><td>1800024</td><td></td></tr><tr><td>GPSアプリ</td><td>ジオロケーションアプリ</td><td>2005</td><td></td>年2月1</tr>日 <tr><td>ラクトフェノールブルーソリューション</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ツァイス アクシオスタープラス</td><td>1169 149</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カメラ</td><td>ツァイス アクシオカム 105色</td><td>426555-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡ソフト</td><td>Zen lite Zeiss 3.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Olen</td><td>k5-7105-1</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>ブランド</td><td>Z336769-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>ペトリプレート</td><td>Kasvi</td><td>K30-6015</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ</td><td>Vatten</td><td>VT-230-200C/VT-230-1000C</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>HTL - Labmatepro</td><td>LMP 200 / LMP 1000</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックポット</td><td>Prafesta descart&aacute;veis</td><td>8314</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン バッグ</td><td>Extrusa 38034273</td><td>/5561</td><td></td></tr><tr><td>ポテト デキストロース 寒天</td><td>Kasvi</td><td>K25-1022</td><td></td></tr><tr><td>プリズム ソフトウェア 9.1.2</td><td>グラフ パッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショベル</td><td>トラモンティナ</td><td>77907009</td><td></td></tr><tr><td>テネブリオ モリター</td><td>サファリ</td><td>QP98DLZ36</td><td></td></tr><tr><td>チアベンダゾール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T8904</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン80</td><td>ベテック</td><td>60REAVET003662</td><td></td></tr><tr><td>ボルテック</td><td>スバイオ</td><td>ミキサーQL-901</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>Kasvi</td><td>K25-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

本研究の目的は、土壌サンプルから昆虫病原性真菌(EPF)を単離するための昆虫餌と人工選択培地の使用の有効性を比較することである。土壌は微生物の豊かな生息地であり、特に節足動物の害虫を調節できる メタリシウム 属および ボーベリア属に属するEPFを含む。真菌に基づく生物学的製剤は、主に農業節足動物有害生物防除のために市場で入手可能である。それにもかかわらず、高い固有種の生物多様性にもかかわらず、世界中の市販のバイオ製品に使用されている株はごくわずかです。本研究では、524の土壌サンプルを、クロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシイミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天培地(CTC培地)上で培養した。真菌コロニーの成長を3週間観察した。すべての メタリジウム および ボーベリア EPFは、属レベルで形態学的に同定された。さらに、いくつかの分離株は種レベルで分子的に同定された。これら524の土壌サンプルのうち24個は、昆虫餌法(Galleria mellonella および Tenebrio molitor)を用いてEPFの発生についても調査された。合計51のEPF株(41の メタリシウム 属および10 種のボーベリア 属)を524の土壌サンプルから単離した。すべての真菌株は、耕作地または草原のいずれかから単離された。比較のために選択された24サンプルのうち、91.7%が ガレリア 餌を用いたEPFに対して陽性であり、62.5%が テネブリオ 餌を用いて、および41.7%がCTCを用いて陽性であった。我々の結果は、昆虫餌を使用して土壌からEPFを単離することが、CTC培地を使用するよりも効率的であることを示唆した。EPFの同定と保全に加えて、分離方法の比較は、生物多様性に関する知識にプラスの影響を与えます。EPFコレクションの改善は、科学の発展と技術革新を支援します。

ブラジルのリオデジャネイロ州で、2015年から2018年の間に、家畜牧草地(165サンプル)、原生熱帯林(90サンプル)、湖畔(42サンプル)、耕作地/耕作地(227サンプル)の合計524の土壌サンプルが草原から収集されました。EPF陽性のサンプルの地理座標の詳細は、 補足表1に示されている。
524の土壌サンプルのうち、500サンプルをCTC培地のみを用いて分析し、24サンプルを3つの形態の単離(ガレリア餌、 テネブリオ餌、および選択的CTC培地)を用いて同時に分析したので、これらの方法の相対効率を評価することができた。合計51のEPF株を524のサンプル(41の メタリジウム 属および10 個のボーベリア 属)から単離した。(図1)。いくつかの分離株のミクロ形態学的特徴を 図2に示す。全ての真菌株を草原または耕作地から単離した(補足表1</...

昆虫病原性真菌コロニーは、 テネブリオ 餌、 ガレリア 餌、ならびに選択的人工培地、すなわちクロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天(CTC培地)を用いて熱帯土壌サンプルから単離される。

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

昆虫病原性真菌の単離は、バイオ農薬の開発にとって重要であり、この特定のグループの多様性、分布、および生態学を研究するのに役立ち得る。昆虫病原性真菌を単離するために昆虫餌を使用することは、低コストで非常に効率的な方法と考えられている。クロラムフェニコール、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、人工培地はドジンを使用せず、土壌サンプルプロセスでより少ないスペースを必要とします。重要なステップには、1〜2週間後にCTCプレートを調査して、他の真菌が発達中の昆虫病原性真菌を狭小化させないようにすること、およびマクロ形態およびミクロ形態に基づいて昆虫病原性真菌コロニーを同定することが含まれる。小さなシャベルを使って800グラムの土を10センチメートルの深さまで集めることから始めます。実験開始まで室温でポリプロピレン袋にサンプルを保管する。昆虫病原性真菌は根圏能力を有することが知られているので、小さな根も採取することができる。クロラムフェニコール、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、またはCTC選択的人工培地を用いた真菌の単離のために、根の有無にかかわらず土壌サンプルの重量0.35グラムを計量する。このサンプルを1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れます。バイオセーフティキャビネット内で作業しながら、1ミリリットルの滅菌0.01容量%ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート水性懸濁液を土壌を含むマイクロチューブに加え、チューブを30秒間渦巻きます。完了したら、上清の50マイクロリットルをCTC培地でペトリプレートの中央にピペットで取り除いた。次いで、直径6ミリメートルの滅菌ドリガルスキヘラを使用して、懸濁液を培地の表面に均質に分散させる。プレートを気候室で摂氏25度、暗所で最低80%の相対湿度でインキュベートします。7日、14日、および21日間のインキュベーション後、真菌コロニーの成長のためのプレートを観察した。表面消毒したガレリア・メロネッラおよびテネブリオ・モリター後期幼虫を昆虫餌として用いて真菌を単離した。幼虫を0.5%次亜塩素酸ナトリウムに1分間浸漬して滅菌する。その後、幼虫を滅菌水で2回洗浄する。集められた土250グラムを含む蓋に直径10ミリメートルの10個の小さな穴があるプラスチック製の鍋に餌を組み立てる。1日おきに土壌を均質化して、幼虫と土壌との最大の接触を可能にし、毎日鉢を分析し、死んだ昆虫を探します。死んだ昆虫を鍋から取り除いた後、0.5%の次亜塩素酸ナトリウムで昆虫を1分間表面的に殺菌する。真菌症を優先するために、滅菌昆虫を相対湿度80%および摂氏25度の湿気の多い部屋に7日間置く。真菌症では、昆虫表面から分生子を収穫し、微生物学的ループの助けを借りて、実体顕微鏡下で0.05%クロラムフェニコールまたはPDAC培地を含むジャガイモデキストロース寒天培地上に分生子を置く。別の方法として、感染した幼虫全体をPDAC培地上に置く。そして、先に説明したように培養プレートを気候チャンバー内でインキュベートする。14日間のインキュベーション後、原稿に記載されているように、プレート上の真菌培養物のマクロ形態学的特徴を分析することによってEPF種を同定する。次に、空中分生子をスライド培養物に移し、相対湿度80%、摂氏25度で3日間培養します。3日後、スライドをラクトフェノールブルーで染色し、顕微鏡的特徴を観察した。光学顕微鏡で、分生子の配置、分生子、形状、大きさなどの真菌構造を400倍で観察し、EPF同定を確認します。この研究では、メタリシウムおよびビーベリア種の51種のEPF株を524の土壌サンプルから単離した。代表的な分析は、メタリジウム種およびビーベリア種のいくつかの分離株の微形態学的特徴を示す。24の土壌サンプルにおけるEPFの発生を、3つの異なる単離方法を用いて研究した。ガレリアメロネラ餌は単離においてより効率的であることが証明され、続いてテネブリオモリター餌およびCTC培地が続いた。同じ24の土壌サンプルはビーベリア種の回収を示さず、メタリシウムのみを示した。覚えておくべき最も重要なことは、顕微鏡の特徴を観察し、形態学的キーを使用して昆虫病原性真菌の同定を確認するために、空中分生子をスライドコートに移すことです。追加の方法には、ドジンなどの汚染物質の増殖を減少させるための特定の化学物質を有する他の選択的人工媒体の使用が含まれる。優れたバイオ防除形質を有する新しい真菌分離株を探すことは、節足動物 - 害虫防除における真菌の有効性を高め、無脊椎動物の病理学分野におけるさらなる疑問を探求するために極めて重要である。

comparison-methods-for-isolating-entomopathogenic-fungi-from-soil

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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土壌のサンプリングと昆虫病原線虫の分離（Steine​​rnematidae、Heterorhabditidae）

ここでは、農業における害虫防除のための「最良適合」昆虫病原菌、 Metarhizium anisopliaeの単離、同定、スクリーニング、および選択を含む、効果的な除草剤の知識ベース開発に関わる様々な段階を報告する。...

開発<em&gt; Metarhizium anisopliae</em&gt; Mycoinsecticideとして：分離から畑作まで

ここでは、土壌サンプルから病原性真菌(EPF)を単離・選択するために用いたミミズ(テネブリオモリター)-ベイトシステムに基づくプロトコルを提示する。有効なコニディア数(ECN)式は、現場での害虫微生物制御のための生理学的特性に基づいて高い耐ストレスEPFを選択するために使用される。...

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このプロトコルは、わずか7日間で大量の土壌サンプルから酵母とカビ アスペルギルス フミガーツス を培養する効果的で迅速な方法です。この方法は、実験に必要なさまざまなインキュベーション培地と温度に対応するように簡単に変更できます。...

土壌からの培養酵母・カビの分離による菌群構造調査

ここでは、土壌生物多様性をスクリーニングして、不本意な物質の分解に関与する真菌株を探すためのプロトコルを提示する。まず、フミン酸またはリグノセルロース上で増殖することができる真菌株が単離される。その後、それらの活性は酵素アッセイと炭化水素やプラスチックなどの汚染物質の両方でテストされます。...

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森林ウッドボーラーからの昆虫病原性真菌の分離、行動同定、および病原性評価

がくからパッチクランプの静電容量の録音のための方法

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の14日齢の苗の組織からのプロトプラストの単離シロイヌナズナ</em

フラスコに細胞の付着の速度に基づいて、筋骨格系の軟部組織から成体幹細胞を単離する。...

ソフト筋骨格組織から幹細胞を単離する

学ぶ昆虫病原性菌類の分離法。Galleria mellonellaを餌とする手法と選択培地を用い、熱帯土壌からMetarhizium属51株を分離する効率的な方法を解説。バイオ農薬開発と生態学研究に貢献します。

土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較

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