土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較
2022年1月6日
昆虫病原性真菌コロニーは、 テネブリオ 餌、 ガレリア 餌、ならびに選択的人工培地、すなわちクロラムフェニコール、チアベンダゾール、およびシクロヘキシミドを添加した酵母抽出物で富化したジャガイモデキストロース寒天(CTC培地)を用いて熱帯土壌サンプルから単離される。
昆虫病原性真菌の単離は、バイオ農薬の開発にとって重要であり、この特定のグループの多様性、分布、および生態学を研究するのに役立ち得る。昆虫病原性真菌を単離するために昆虫餌を使用することは、低コストで非常に効率的な方法と考えられている。クロラムフェニコール、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、人工培地はドジンを使用せず、土壌サンプルプロセスでより少ないスペースを必要とします。
重要なステップには、1〜2週間後にCTCプレートを調査して、他の真菌が発達中の昆虫病原性真菌を狭小化させないようにすること、およびマクロ形態およびミクロ形態に基づいて昆虫病原性真菌コロニーを同定することが含まれる。小さなシャベルを使って800グラムの土を10センチメートルの深さまで集めることから始めます。実験開始まで室温でポリプロピレン袋にサンプルを保管する。
昆虫病原性真菌は根圏能力を有することが知られているので、小さな根も採取することができる。クロラムフェニコール、チアベンダゾール、シクロヘキシミド、またはCTC選択的人工培地を用いた真菌の単離のために、根の有無にかかわらず土壌サンプルの重量0.35グラムを計量する。このサンプルを1.5ミリリットルのマイクロチューブに入れます。
バイオセーフティキャビネット内で作業しながら、1ミリリットルの滅菌0.01容量%ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート水性懸濁液を土壌を含むマイクロチューブに加え、チューブを30秒間渦巻きます。完了したら、上清の50マイクロリットルをCTC培地でペトリプレートの中央にピペットで取り除いた。次いで、直径6ミリメートルの滅菌ドリガルスキヘラを使用して、懸濁液を培地の表面に均質に分散させる。
プレートを気候室で摂氏25度、暗所で最低80%の相対湿度でインキュベートします。7日、14日、および21日間のインキュベーション後、真菌コロニーの成長のためのプレートを観察した。表面消毒したガレリア・メロネッラおよびテネブリオ・モリター後期幼虫を昆虫餌として用いて真菌を単離した。
幼虫を0.5%次亜塩素酸ナトリウムに1分間浸漬して滅菌する。その後、幼虫を滅菌水で2回洗浄する。集められた土250グラムを含む蓋に直径10ミリメートルの10個の小さな穴があるプラスチック製の鍋に餌を組み立てる。
1日おきに土壌を均質化して、幼虫と土壌との最大の接触を可能にし、毎日鉢を分析し、死んだ昆虫を探します。死んだ昆虫を鍋から取り除いた後、0.5%の次亜塩素酸ナトリウムで昆虫を1分間表面的に殺菌する。真菌症を優先するために、滅菌昆虫を相対湿度80%および摂氏25度の湿気の多い部屋に7日間置く。
真菌症では、昆虫表面から分生子を収穫し、微生物学的ループの助けを借りて、実体顕微鏡下で0.05%クロラムフェニコールまたはPDAC培地を含むジャガイモデキストロース寒天培地上に分生子を置く。別の方法として、感染した幼虫全体をPDAC培地上に置く。そして、先に説明したように培養プレートを気候チャンバー内でインキュベートする。
14日間のインキュベーション後、原稿に記載されているように、プレート上の真菌培養物のマクロ形態学的特徴を分析することによってEPF種を同定する。次に、空中分生子をスライド培養物に移し、相対湿度80%、摂氏25度で3日間培養します。3日後、スライドをラクトフェノールブルーで染色し、顕微鏡的特徴を観察した。
光学顕微鏡で、分生子の配置、分生子、形状、大きさなどの真菌構造を400倍で観察し、EPF同定を確認します。この研究では、メタリシウムおよびビーベリア種の51種のEPF株を524の土壌サンプルから単離した。代表的な分析は、メタリジウム種およびビーベリア種のいくつかの分離株の微形態学的特徴を示す。
24の土壌サンプルにおけるEPFの発生を、3つの異なる単離方法を用いて研究した。ガレリアメロネラ餌は単離においてより効率的であることが証明され、続いてテネブリオモリター餌およびCTC培地が続いた。同じ24の土壌サンプルはビーベリア種の回収を示さず、メタリシウムのみを示した。
覚えておくべき最も重要なことは、顕微鏡の特徴を観察し、形態学的キーを使用して昆虫病原性真菌の同定を確認するために、空中分生子をスライドコートに移すことです。追加の方法には、ドジンなどの汚染物質の増殖を減少させるための特定の化学物質を有する他の選択的人工媒体の使用が含まれる。優れたバイオ防除形質を有する新しい真菌分離株を探すことは、節足動物 - 害虫防除における真菌の有効性を高め、無脊椎動物の病理学分野におけるさらなる疑問を探求するために極めて重要である。
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概要
本研究では、昆虫ベイトを用いて熱帯地域の土壌から昆虫病原性真菌を分離し、さまざまな手法の効率性を検討しています。この分離により、真菌の多様性に関する理解を深め、生物農薬の開発に寄与することを目指しています。
研究の主要構成要素
研究分野
- 昆虫病原性真菌
- 土壌微生物学
- 生物農薬の開発
背景
- 昆虫病原性真菌を分離するための低コストな手法。
- 生態学的研究における土壌サンプルの評価の重要性。
- 効率的な真菌分離のための選択培地の活用。
使用方法
- 昆虫ベイト（Galleria mellonellaおよびTenebrio molitor）を用いた真菌の分離。
- 選択的な人工培地（CTC培地、ポテトデキストロース寒天培地）の使用。
- 真菌種の同定のための顕微鏡観察。
主な結果
- 524個の土壌サンプルから、Metarhizium属およびBeauveria属の51株を分離した。
- 菌類の分離において、Galleria mellonellaを用いたベイト法が最も高い効率を示した。
- 試験したサンプルからBeauveria属は回収されなかった。
結論
- 本研究は、昆虫病原性真菌の分離方法を効果的に実証しています。
- これらの知見は、生物学的防除の研究および潜在的な農業への応用に寄与します。
よくある質問
産業界における重要性
土壌から昆虫病原性真菌を分離することは、生物農薬探索における基礎的な工程であり、手法の効率性は標的の検証およびリード化合物の特定に直接的な影響を与えます。昆虫ベイト法と選択培地を比較することで、分離回収率を向上させ、偽陰性を減少させることができ、これにより初期段階の抗真菌候補物質のスクリーニングにおけるリスクを軽減することが可能です。これは、節足動物害虫管理プログラムにおける標的選択の予測精度の向上に寄与します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 土壌生態系における菌類の生物多様性を調査し、生物活性を持つ可能性のある新規のMetarhizium属およびBeauveria属の株を同定することを可能にする。
- 運用的価値： 昆虫ベイト法（Galleria mellonella、Tenebrio molitor）は、CTC培地よりも高い分離効率を提供し、後続の特性評価に向けた標的生物へのアクセスを向上させる。
- 実用的価値： 分離された株は、形態学的および分子生物学的同定を通じて、表現型的な病原性と遺伝的同一性を結びつけることで、メカニズム面でのリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：節足動物への病原性と宿主範囲の特異性を標的としたアッセイ開発のために、検証済みの真菌分離株を提供します。
- 実用的価値：昆虫ベイトを用いた標準化された分離プロトコルにより、土壌サンプルバッチ間での真菌回収の再現性とスケーラビリティが向上します。
- アッセイへの適用性：分生子採取およびスライドベースの形態学的確認のための純粋培養の調製を可能にし、一貫した表現型スクリーニング入力をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患関連システム： 分離されたEPF菌株は、生物制御製剤の開発に合わせて、害虫に対する病原性を評価するための前臨床モデルとして機能します。
- 予測の信頼性： 分離株の種レベルでの分子同定により、標的に対する信頼性が高まり、製剤研究のための菌株選定がサポートされます。
- 継続性： 確立された分離ワークフローにより、農地土壌における菌の存在を長期的に追跡することが可能となり、耐性管理や菌株の輪作戦略に寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この分離法は、回収されたEPF株を病原性と宿主特異性の表現型スクリーニングへと進め、生物農薬の開発パイプラインにおけるリード化合物の同定に役立てるという、初期の探索ワークフローに適しています。
- 発見生物学：複雑な土壌マトリックスからEPFを回収することを可能にし、菌類の生態学および病原性に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：昆虫宿主を用いたハイスループットな病原性アッセイのために、標準化された菌類調製物を生成します。
- 分析：形態学的および分子生物学的な同定結果により、菌株の比較および選定のための定量的および定性的なデータが提供されます。
- トランスレーショナルリサーチ：MetarhiziumおよびBeauveriaにおける保存された病原性メカニズムを通じて、環境分離から前臨床評価までを繋げます。
- 企業での再利用：昆虫ベイトを用いた分離プロトコルは、施設や土壌の種類を問わず標準化でき、将来のスクリーニングキャンペーンに向けた拡張可能な菌株バンクの構築を可能にします。
運用および組織への影響
- 科学的価値： 生物農薬開発におけるEPF標的選択の標的多様性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： 昆虫ベイト法は、選択培地よりも収量が高く、技術的なばらつきが少ないため、分離成功率を向上させる。
- 戦略的価値： 環境サンプルから強毒性分離株へのアクセスを増やすことで、菌株の優先順位付けにおける判断（go/no-go決定）の精度を高める。
- ポートフォリオへの影響： 形態および同一性が確認され、特性解析されたEPF菌株のプールを拡大することで、リスク調整済みの開発推進を支援する。
実施上の検討事項
- 誘引剤の調製および分生胞子の回収には、昆虫の取り扱い、菌類形態学、および無菌操作に関する専門知識が必要です。
- 菌の増殖および菌症誘導のため、25°Cかつ湿度80%を維持できる温度・湿度管理機能付きインキュベーションチャンバーが必要です。
- チーム間での標準化には、誘引剤の滅菌、土壌の均質化、および菌症後の処理スケジュールの統一が必要です。
- 異なる土壌タイプに適応させる場合、自生するEPFの普及率に基づいて、誘引剤の曝露時間および土壌量の調整が必要になる場合があります。
- 制限事項として、幼虫の生存率への依存や、プロトコルで記載されている加湿チャンバーの使用および表面滅菌ステップに影響される環境条件などが、菌症誘導の成功率に影響を及ぼすことが挙げられます。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:07
Soil Sampling and Isolation Methods for Entomopathogenic Fungi (EPF)
4:29
Identification of Entomopathogenic Fungi (EPF): Metarhizium and Beauveria Species
5:21
Results: Micromorphological Characteristics and Occurrence of Entomopathogenic Fungi in Various Soil Samples
6:16
Conclusion
