Name: eGFPタグ付きタンパク質を用いた ショウジョウバエ 光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶ ショウジョウバエ光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの非侵襲的解析法。eGFPタグ付きタンパク質と深層擬瞳孔イメージング、水浸顕微鏡法を用いて、遺伝性失明の分子基盤を解明する。

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私たちは長年にわたる学生研究者に感謝したいと思います。特に、ニーナ・マイヤー、シビル・メイヤー、ジュリアン・カイム、ローラ・ジャギーは、そのデータが代表的な結果としてこのプロトコルで利用されています。ここで紹介する私たちのグループの研究は、ドイツ連邦共和国(Hu 839/2-4, Hu 839/7-1)からArmin Huberへの助成金によって資金提供されました。

<ol><li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration.+9%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).</li>
<li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li>
<li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li>
<li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration%3A+lessons+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li>
<li>Bähner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li>
<li>Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li>
<li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).</li>
<li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li>
<li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li>
<li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+ph%C3%A9nom%C3%A9nes+de+pseudopupille+dans+l%27oeil+compose+de+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kybernetik%22%5BJournal%5D)">Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li>
<li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li>
<li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li>
<li>Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2005).</li>
<li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li>
<li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li>
<li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925(2015).</li>
<li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li>
<li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070(2020).</li>
<li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578(2015).</li>
<li>Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2007).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li>
<li>Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li>
<li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4%2C5+bisphosphate+%28PIP2%29+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

蛍光タンパク質の適用性とDPPイメージングおよび網膜水浸漬顕微鏡によるスクリーニングの単純さは、多くのグループによって成功していることが証明されています12。ここに提示されたものと同様の戦略は、Rh1::eGFP 17、18、19、20、21の助けを借りて、ロドプシン発現レベル、恒常性、網膜組織、または細胞完全性の欠陥を検出するために、いくつかの遺伝子スクリーニングで使用されている。上で説明したように、TRPL::eGFPのような転座融合タンパク質は、例えば突然変異誘発スクリーニングにおいて、ラブドミアとの間のタンパク質輸送プロセスが損なわれているかどうかを検出するために使用され得る。一方、TRP::eGFPのような永久的なラブドメラ融合タンパク質は、ラブドメアの形態...

原形質膜との間でタンパク質を送達および除去することにより、ニューロンにおける膜タンパク質の輸送は、受容体およびイオンチャネルを有する原形質膜装置を制御し、その結果、ニューロン機能を調節する。タンパク質の輸送における調節ミスや欠陥は、通常、細胞に有害な影響を及ぼし、ニューロン変性をもたらす。ヒトでは、これはアルツハイマー病およびパーキンソン病または網膜色素変性症1などの神経変性疾患を引き起こし得る。ショウジョウバエの複眼における光受容体は、膜タンパク質のトラフィッキングを研究するためのin vivoモデル系となっている2。これは、効果的な遺伝子スクリーニングを可能にするショウジョウバエの遺伝的汎用性に起因するだけでなく、光吸収感光体膜のすべての必須成分が非常に詳細に特徴付けられ、フライアイに適用できる効率的な顕微鏡技術が利用可能であるためでもある。これらの手法は、この記事の焦点です。
ショウジョウバエの視細胞では、頂端原形質膜は、横紋と呼ばれる細胞の片側に沿って微絨毛の密集したスタックを形成する。視細胞R1-6のラブドメアは特徴的な台形パターンで配列され、視細胞R7およびR8はこの台形3の中心に単一のラブドメアを形成している。膜タンパク質のトラフィッキングは、ラブドーム内のこれらの光導入タンパク質の適切な量を保証するために、ロドプシンおよび光活性化TRP(一過性受容器電位)およびTRPL(TRP様)イオンチャネルなどのラブドメラ膜タンパク質の調節された代謝回転に必要である。光受容体膜タンパク質は小胞体で合成され、ゴルジ体を介して横紋岩に輸送される。光によるロドプシンの活性化に続いて、ロドプシン分子は、第2の光子の吸収によって不活性化されるか、またはクラスリン媒介性エンドサイトーシスによってラブドメアから除去され得る。エンドサイトーシスされたロドプシンは、リソソーム中で分解されるか、またはラブドミア4、5に戻ってリサイクルされる。イオンチャネルTRPLはまた、光伝達カスケードの活性化に続いて内在化され、ラブドミア(ハエが暗闇に保たれているときに位置する場所)と細胞体内のER富化貯蔵区画(照明時に数時間以内に輸送される)との間の光依存性転座を受ける6,7,8,9,10 .エンドサイトーシスされたロドプシンとは対照的に、少量のTRPLのみがエンドリソソーム経路を介して分解され、大部分は代わりに細胞内に貯蔵され、暗順応時にラブドミアにリサイクルされる6。したがって、TRPLは、原形質膜タンパク質の光トリガー輸送を分析するために使用することができる。ショウジョウバエの視細胞は、神経細胞の変性を研究するためにも使用されている。視細胞変性は、変性プロセスの結果として崩壊するラブドメアの構造を評価することによって頻繁に決定される5。
視細胞または視細胞変性におけるTRPLおよびロドプシンの細胞内局在を研究するために、ここでは分析速度および分解能に関して異なる2つの蛍光顕微鏡法が適用されてきた。遺伝子スクリーニングに使用できるが空間分解能が限られている非常に高速で非侵襲的な方法は、深い偽瞳孔(DPP)における蛍光の検出である。DPPは節足動物複眼の光学現象であり、その幾何学的起源は197111年にFranceschiniとKirschfeldによって詳細に説明されている。要するに、網膜オーバーレイの下のいくつかの光学面上に、隣接するオンマチジアからのラブドメアの画像が観察され得る。眼の湾曲の中心を通る焦点面上で、これらの重畳された投影は、わずか桁大きい単一のオンマチジウム内のラブドメアの台形レイアウトに似た画像を形成する。この現象は、蛍光タンパク質の外因性発現(例えばTRPL::eGFP8)とは無関係に観察することもでき、それにもかかわらずDPPの検出が容易になる(図1A-A'')12。第2の非侵襲的方法は、眼の視光学装置を水で光学的に中和した後、蛍光標識されたタンパク質を画像化することに依存する水浸漬顕微鏡法である(図1B-C'')12。水浸漬法を用いて、横筋腫または細胞体中のTRPL::eGFPの相対量を、個々の視細胞について定量的に評価することができる。さらに、非転座蛍光タグ付きタンパク質は、ここに記載されるように、横紋体の完全性を評価し、潜在的な変性の経時変化を定量的に決定するために利用することができる。
DPPの記録は、これらの方法の中で最も簡単で最速ですが、生成されるデータの空間分解能は限られています。さらに、DPPが存在しない理由は数多くありますが、DPPイメージング自体では必ずしも識別できません。DPPはいくつかのオンマチジアの総和を表すので、個々の細胞に関する情報は失われる。したがって、低解像度のDPPイメージングは、多数のハエをスクリーニングする上で重要な機能を果たすが、一般に、水浸漬顕微鏡による高解像度の記録が続くべきである。水浸漬顕微鏡写真は、個々の細胞、発生欠陥、眼の形態、タンパク質の誤局在化または網膜変性、ならびにこれらの影響の定量化に関する解釈を可能にする。このプロトコルでは、これら 2 つの手法について詳しく説明します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> 図1:この議定書に提示されたショウジョウバエ眼の顕微鏡検査のバリエーションの概要。(A−A'')蛍光深部擬似瞳孔(DPP)画像化、(B−B'')蛍光ラブドメアの致死水浸漬顕微鏡、および(C−C'')蛍光ラブドメアの非致死水滴顕微鏡の概略表現および例示的な顕微鏡写真。スケールバー(A ́'):100μm。スケールバー(B''-C''):10μm。この図は参考文献13から修正されている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL遠心分離管</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CO2 麻酔フライパッド</td><td>Flystuff</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>コールドライトランプ (KL 1500 LCD)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVランプ、カメラ、フィルターセット、ソフトウェア付き蛍光顕微鏡 (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blueedition)</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光管(Lumilux T8、L 30W / 840、4000 K、G13) [1750ルクス、E e 470nm= 298 & micro;W cm-2、Ee590nm = 215 &micro;W cm-2] および [760 ルクス、Ee470nm = 173 &micro;W cm-2、Ee590nm = 147 &micro;W cm-2]</td><td>Osram</td><td>4050300518039</td><td></td></tr><tr><td>ラボラトリーピペット (20-200 &micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Object slide</td><td>Roth</td><td>0656.1</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (94 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ (200 &micro;L)</td><td>Labsolute</td><td>7695844</td><td></td></tr><tr><td>Plasticine (Blu-Tack)</td><td>Bostik</td><td>30811745</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope (SMZ445)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

egfpタグ付きタンパク質を用いた ショウジョウバエ 光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの研究

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

膜タンパク質のトラフィッキングは、原形質膜への受容体およびイオンチャネルの取り込みおよび除去を調節する。このプロセスは、ニューロンの細胞機能および細胞完全性にとって根本的に重要である。 ショウジョウバエ の視細胞は、膜タンパク質の輸送を研究するためのモデルとなっている。照明時に感光膜から内在化して分解されるロドプシンの他に、 ショウジョウバエ の一過性受容器電位様(TRPL)イオンチャネルは、横紋体視細胞膜(暗所に位置する)と感光細胞体(照明時に輸送される)との間に光依存性の転座を示す。TRPLのこの細胞内輸送は、eGFPタグ付きTRPLを視細胞で発現させることによって、単純かつ非侵襲的な方法で研究することができる。eGFP蛍光は、その後、深い擬似瞳孔内または水浸漬顕微鏡によって観察することができる。これらの方法は、無傷の眼における蛍光の検出を可能にし、したがって、TRPL転座に欠損した ショウジョウバエ 変異体のハイスループットアッセイおよび遺伝子スクリーニングに有用である。ここでは、ハエの調製、顕微鏡的手法、ならびにTRPLのこの光誘発転座を研究するために使用される定量化方法が詳細に説明される。これらの方法は、他の ショウジョウバエ の感光体タンパク質、例えばロドプシンのトラフィッキング研究にも適用することができる。加えて、eGFPタグ付きラブドメラルタンパク質を使用することにより、これらの方法は、視細胞の変性を評価するために使用することができる。

ロドプシン1プロモーターの制御下でTRPL::eGFP融合タンパク質を発現するトランスジェニックショウジョウバエが生成されている。これらのハエでは、TRPL::eGFPは複眼の視細胞R1-6に発現し、照明依存的な局在を示す。ハエが暗闇の中で飼われると、TRPL::eGFPは外側のラブドメアに組み込まれます。数時間の照明の後、TRPLは細胞体に転移し、そこでER濃縮コンパートメントに貯蔵される。8,10 TRPL::eGFPがラブドメアに位置する場合、その蛍光はDPPにおいて観察され得る。しかしながら、横紋体蛍光は、TRPL::eGFPの転座の結果として光の中で消失する(図11A、B)。これは、TRPL::eGFPのインターナリゼーションに欠損した変異体について遺伝子スクリーニングを行うために用いられた(図11C,D)...

ここでは、eGFP蛍光を用いた ショウジョウバエ 複眼における視細胞膜タンパク質の局在化および網膜変性の評価について、非侵襲的方法について説明する。

eGFPタグ付きタンパク質を用いた ショウジョウバエ 光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの研究

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

GFPタグ付き光受容体タンパク質は、イオンチャネルTRPL GFPと同様に、非侵襲的技術を用いてニューロンにおけるタンパク質輸送を研究することを可能にする。この方法は、感光体の変性を監視するためにも使用することができる。したがって、ヒトの失明をもたらす遺伝性疾患の分子基盤をショウジョウバエの眼で研究することができる。GFPタグ付きタンパク質の細胞局在は、深い偽瞳孔における蛍光を観察することによって、または水浸漬顕微鏡によって評価することができる。どちらの方法も、視覚タンパク質の局在を迅速に決定し、視細胞の変性によるラブドメアの構造欠陥を観察することを可能にする。高品質の画像を得るために、最も重要な側面はフライアイの向きです。このテクニックを実行している間、人は目の末梢に向かってわずかに位置するオンマチジアに焦点を当てるべきです。DPPイメージングの手順を実演し、水浸漬顕微鏡を用いた2つの手法は、同僚のクリスティーナ・ワグナー博士と、私たちのグループの博士課程の学生であるマティアス・ゼーガーによって実証されます。深い偽瞳孔(DPP)のイメージングを開始するには、生後1〜3日のハエを麻酔し、左目または右目のいずれかが対物レンズに正確に放射状に向くように、顕微鏡対物レンズの中央にそれらの1つを横に置きます。目全体にフィットするように倍率を上げ、目の中央のオンマチディアを中央に配置します。可能であれば、二重虹彩絞りを浅い設定に調整して、顕微鏡の被写界深度を下げます。次に、顕微鏡のUVランプを最大強度でオンにします。そして、眼に発現する蛍光タンパク質に応じて顕微鏡の蛍光フィルターセットを選択し、顕微鏡搭載カメラに向かう光路を設定した。ソフトウェア内のライブイメージング機能を使用して、露光時間とゲイン値を上げて、目からの特定の信号のみを検出する設定に画像の明るさを調整します。顕微鏡の焦点を眼に再調整して、DPPの重畳画像を生成します。次に、蛍光DPPのスナップショットを撮ります。致命的なバリエーションでフライを準備するには、プラスティシンの一部をオブジェクトのスライドに接着し、別の部分をペトリ皿の中心に接着します。氷冷した蒸留水といくつかの氷のフレークでペトリ皿を満たします。次に、氷麻酔フライ1匹を実体顕微鏡下でプラスティックコーティングされた物体スライドの上に置きます。フライを背中に回し、胸郭の中心に昆虫のピンを突き刺します。プラスティシンでコーティングされたオブジェクト スライドにピンを水平に固定し、フライの左目または右目を上向きにします。次に、プラスティックを含まない側をペトリ皿で下に向けてオブジェクトスライドを慎重に固定し、フライヘッドの回転を防ぎます。フライアイが水で覆われていることを確認してください。あるいは、致死的ではない変動でフライを準備するには、まず氷麻酔をかけたフライヘッドを200マイクロリットルのピペットチップに移し、圧縮空気でフライを先端に向かって慎重に押します。次に、メスを使って頭のすぐ前のピペットチップを切り落とし、ピンセットを使ってフライを数ミリ丁寧にピペットチップに押し込みます。ピペットチップを再び切断し、フライの頭部のみがピペットチップから突出するように、圧縮空気でフライを先端に向かって押し戻します。プラスティシンをオブジェクトスライドに貼り付けた後、左目または右目が上を向くようにピペットチップを押し込みます。顕微鏡下で目が正しい方向を向いていることを確認します。画像を取得するには、水没入対物レンズを選択します。致死的ではない変動の場合は、実験用ピペットを使用して、水浸漬目標の下側に大量の冷水を付着させます。準備したフライでオブジェクトスライドを顕微鏡ステージに慎重に置きます。次に、水面に触れるか、フライの目が水滴に触れるまで、水浸漬対物レンズを手動で下げます。そして、顕微鏡カメラに向けて光路を切り替え、ライブ画像を生成する。カメラの焦点を再調整し、目が顕微鏡の対物レンズを放射状に向かわなければならないことを考慮して、目の向きを評価します。ルックアップテーブルソフトウェアを使用して、過飽和を検出します。色素沈着していないハエの場合は、最も明るいピクセルがすべての画像の彩度制限のすぐ下になるように露光時間を調整します。画像を記録し、それを生ファイルとして保存して、記録の対応するすべてのメタデータをアーカイブします。次に、画像を tif 形式でエクスポートします。水浸漬顕微鏡写真の横紋体における相対的なeGFP蛍光を定量化するには、[分析]、[測定値の設定]をクリックしてImageJ設定を調整し、[平均グレー値]のボックスのみをオンにします。[ファイル]をクリックしてtifイメージをインポートし、[開く]をクリックします。ピントが合っている画像の代表的な領域を選択し、Ctrlキーを押しながら一緒に繰り返して200〜300%に拡大します。次に、楕円形ツールを選択し、Shift キーを押しながら、1 つの蛍光横紋筋よりも大幅に小さい円形の選択範囲を画像内に生成します。次に、ImageJメインウィンドウのツールバーの下に表示される正確なサイズを探します。円形選択範囲内の蛍光強度を測定するには、キーボードの矢印キーで円を最初のラブドミアに移動し、「分析」をクリックしてから「測定」をクリックします。測定されたグレー値を一覧表示する結果ウィンドウがポップアップ表示されます。ラブドメア2~6本の測定を続け、バックグラウンド信号も測定します。色素沈着していないハエの場合、対応する細胞体領域の追加測定を行う。さらに2つのオンマチジアの蛍光を測定し、3つの技術的反復をもたらす。鉛筆ツールを使用して分析されたオンマチディアにマークを付け、この画像をドキュメント用に保存します。結果表示ウィンドウから測定されたグレー値を選択してコピーし、スプレッドシートソフトウェアに貼り付けてさらに計算します。蛍光強度値を起源に応じて横紋岩、細胞体、バックグラウンドのカテゴリにソートし、各カテゴリから平均強度を計算します。次に、非色素沈着眼については第1の式、色素沈着眼については第2の式を用いてラブドミア中に存在するeGFPの相対量を計算する。あるいは、水浸漬顕微鏡写真におけるeGFP蛍光によって眼形態を定量化し、焦点が合っている画像の代表領域において隣接する3つのオンマチジアを選択する。選択範囲の18個のラブドメアを、周囲のバックグラウンド信号に対するeGFP強度、エッジシャープネス、およびコントラストに従って個別に評価します。最後に、はっきりと見えるラブドメアを値2、週ごとに見えるラブドメアを1の値で、存在しないラブドメアをゼロの値でスコア付けして、変性指数を生成します。eGFP TRPL融合タンパク質を発現するトランスジェニックショウジョウバエにおいて、eGFP TRPLの転座により横紋体蛍光が光で消失する。これにより、eGFP TRPLのインターナリゼーションにおいて欠損した変異体を同定するための遺伝子スクリーニングを行うことができる。対照ハエにおいて、eGFP TRPLは、16時間の照明後にラブドメアから細胞体内にトランスロケーションし、暗適応状態と比較してラブドメラ蛍光の有意な減少をもたらす。2回目の暗黒インキュベーションは、ラブドメラ蛍光を初期値に向かって再び上昇させる。しかしながら、TRPL転座欠損変異体vps35MH20では、蛍光パターンは、16時間の照明およびその後の24時間の暗順応後も劇的に変化しない。この定量化方法により、統計的に有意性の高いリサイクル欠陥を検出することができる。白い目のハエは、ラブドミアと細胞体の両方からの蛍光シグナルの検出を可能にします。対照的に、赤い目のハエでは、蛍光シグナルはラブドメアでのみ検出可能であり、細胞体では検出できない。網膜変性の定量化に関しては、eGFP TRP蛍光を数週間にわたって評価することができる。12時間の明暗サイクルで2週間保持すると、変性指数は変異ハエでは低下したが、対照ハエでは低下しなかった。このプロトコルでは、色素沈着した目と色素沈着していない目を区別する必要があります。色素沈着は蛍光シグナルに影響を与えるため、定量的な水浸漬顕微鏡は両方のケースで個別に最適化されています。DPPイメージングと水浸漬顕微鏡は、解像度が限られている高スループットの方法です。細胞内局在を調べるには、組織切片の免疫蛍光顕微鏡検査をお勧めします。変性表現型の詳細な分析のために、電子顕微鏡検査を行うことができる。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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出典:Wagner, K. et al., Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-tagged Proteins. J. Vis. Exp.

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生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

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ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

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ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

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気孔系譜細胞における膜輸送事象を研究するための画像ベースの手法

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蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

学ぶ ショウジョウバエ光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの非侵襲的解析法。eGFPタグ付きタンパク質と深層擬瞳孔イメージング、水浸顕微鏡法を用いて、遺伝性失明の分子基盤を解明する。

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