Name: マウス中枢神経系の組織学的解析のための重力供給経心筋灌流法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 学ぶマウス中枢神経系の重力供給経心筋灌流法による組織学的解析。パーキンソン病モデルでリン酸化α-シヌクレインの免疫蛍光検出を実証し、費用対効果の高い組織固定プロトコルを提供する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、Xiaowen Wang、Liam Coyne、Jason Grullonに、このプロトコルの開発における彼らの支援に感謝している。この研究は、NIH助成金AG061204およびAG063499によって支援された。

<ol><li>Tao-Cheng, J. H., Gallant, P. E., Brightman, M. W., Dosemeci, A., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+synapses+after+delayed+perfusion+fixation+in+different+regions+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Structural changes at synapses after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 501 (5), 731-740 (2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>McFadden, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+in+brain+banking%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation in brain banking: a systematic review.</a> Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 146(2019).</li>
<li>Lamberts, R., Goldsmith, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+fine+structure%2C+and+immunostaining+for+neuropeptides%3A+perfusion+versus+immersion+of+the+neuroendocrine+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (3), 389-398 (1986).</li>
<li>Adickes, E. D., Folkerth, R. D., Sims, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+perfusion+fixation+for+improved+neuropathologic+examination%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+and+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of perfusion fixation for improved neuropathologic examination.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 121 (11), 1199-1206 (1997).</li>
<li>Giasson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+alpha-synucleinopathy+with+severe+movement+disorder+in+mice+expressing+A53T+human+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein.</a> Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).</li>
<li>Martin, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+alpha-synuclein+transgenic+mice+develop+neuronal+mitochondrial+degeneration+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death.</a> Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).</li>
<li>Fujiwara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+is+phosphorylated+in+synucleinopathy+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions.</a> Nature Cell Biology. 4 (2), 160-164 (2002).</li>
<li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li>
<li>Anderson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+Ser-129+is+the+dominant+pathological+modification+of+alpha-synuclein+in+familial+and+sporadic+Lewy+body+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).</li>
<li>Kahle, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+and+insolubility+of+alpha-synuclein+in+transgenic+mouse+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes.</a> EMBO Reports. 3 (6), 583-588 (2002).</li>
<li>Mattson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+arterial+blood+pressure+in+different+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice.</a> American Journal of Hypertension. 14, 405-408 (2001).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

この研究は、経心膜灌流を行うための重要なステップを説明する。灌流装置(プロトコルセクション1)を構築する場合、止血によって完全に閉塞されるのに十分な柔軟性を有するチューブを使用することが重要である。一部の硬いチューブは、止血剤によって十分に閉塞されない可能性があり、最初のPBS灌流中にPFAがメインラインに漏れる可能性があります。4%PFA溶液を調製するときは、pHが生理学的であることを確認することが重要です(7.4)。PFA溶液の調製には65°Cに加熱する必要があるため、pHを測定する前に溶液を25°Cまで冷却する必要があります。
腹部への最初の切開を行うときは、腹部器官の裂傷を避けるために注意を払わなければならない(プロトコルセクション2)。横隔膜に向かって優位に解剖するときは、肝臓が前腹壁と密着するのが一般的であるため、肝臓の裂傷を避けることが重要です。これを克服するために、肝臓を横隔膜に向かって切開を続ける前に、前壁から慎重かつ鈍く解剖する。横隔膜を通って胸腔に入るとき、心臓、大きな血管、および肺の裂傷を避けることが重要です。これを避けるために、はさみの先端は表面的にそして胸郭と鋭角に保たれる。
心臓を露出させるための最初の解剖は、最初の切開から約2分かかる。この間、蝶の針の先端にいくらかの空気が入ったことが予想されます。マウスの循環にこの空気を導入すると、質の悪い灌流が得られます。したがって、心臓のカニューレの直前にメインラインを開き、PBSを針を通してフラッシュして気泡を除去することが重要です。理想的には、LVを穿刺するときに空気が完全に存在しないことを保証するために、小さなPBSトリクルが針先を通って流れる間、心臓はカニューレされる。
針がLVに入るとき、針先を右心室(RV)に導入するほど深く行ってはなりません。RVまたは僧帽弁を超えて針を配置すると、灌流が開始されたときに肺の即時の「膨張」が生じる。これは望ましくなく、LVの配置を確実にするために針を少し引き抜く必要があります。針が適切に置かれると、肺は灌流を通して平らに保たれます。灌流が開始されると、透明な液体が動物の開いた口から出てくることが時々観察される。これは通常、灌流圧が高すぎるか、心臓内の針の配置ミスによるものです。著者らは、灌流圧の上昇が動脈毛細血管床からの灌流液の溢血と、気管支樹を介したPBSの食道および口腔への逆行性流をもたらすと推測している。
灌流圧力は、PBSボトル内のPBSのレベルを低下させるか、PBSボトルの高さを下げることによって低下しなければならない。あるいは、針が左心室に深く入りすぎると、僧帽弁を通って左心房に灌流液を送達することがある。これは、上述のように、肺静脈を通る逆行性流および細動脈への灌流液の溢血をもたらし得る。PBSによる循環器系からの血液の徹底的なクリアランスは、その後の固定剤灌流時に血管閉塞をもたらす血液成分の固定剤誘発架橋を避けるために特に重要である。クリアランスは、腹側尾部基部の切開部からの肝臓およびPBS流の色変化によって効果的に評価される。血液クリアランスは、一般に、PBSによる灌流の3分によって完了する。しかし、クリアランスの視覚的徴候がより短い時間で起こる場合、固定液は3分より早く導入される。より長いクリアランス時間は、遅延固定灌流がCNS微細構造1のアーチファクトをもたらすので推奨されない。
PFAを投与するときは、PFAボトル内のPFA溶液のレベルを監視することが重要です。PFAのレベルがPFAボトルの口から4cm未満まで下がった場合は、PFAボトルをいっぱいにします。灌流が完了した後、灌流装置を蒸留水で十分にすすいでいなければならない。これは、メインライン内の残留PFAがPFAで初期PBS灌流を汚染し、質の悪い灌流をもたらすため重要です。最後に、25Gのバタフライニードルは、20〜30gの範囲の平均サイズの成体マウスに一般的に推奨されます。しかしながら、より大きくまたはより小さいマウスは、最適な流速を提供するために固定剤ボトルの調整に加えて、わずかに大きいまたはより小さいゲージ針を必要とし得る。
CNS解剖およびOCT埋め込み(プロトコルセクション3)の場合、脊髄組織が30%スクロース中に完全に沈み込まないのが一般的である。したがって、これらの組織は、沈むかどうかにかかわらず、スクロース中に2日間放置され、次いでOCTに埋め込まれる。OCTで組織を凍結させると、冷却された2-メチルブタンに入れたときに特定の組織が割れる可能性があります。これは脳でより一般的であり、通常、あまりにも多くのOCTが組織に置かれたときに起こる。これを避けるには、即時凍結の前に組織表面を覆うのに十分なOCTのみを配置してください。一部のプロトコルでは、OCTに完全に浸漬されているにもかかわらず、クラッキングはあまり一般的ではありません。これは通常、ドライアイス冷却された 2-メチルブタンを使用したり、ドライアイスのブロック上にクライオモルドを直接配置したりする場合など、凍結速度が遅いためです。液体 - 窒素冷却2-メチルブタンは、凍結速度が実質的により速く、遅い凍結法よりも組織形態をよりよく保存する可能性があるため、この研究において好ましい。
組織を凍結切除する場合(プロトコルセクション4)、複数回の凍結融解サイクルを避けることが重要です。したがって、単一のOCTブロックからすべての切片を切断して、選択した領域を解凍および再凍結するのではなく、分析用の特定の脳領域を取得することが最適である。これが実行可能でない場合は、いくつかのセクションを取得した後、ユーザーはOCTブロックを再凍結し、将来の使用のために-80°Cのディープフリーザーに1〜2回以上保管することができます。
灌流液のより伝統的なポンプまたは空気圧送達に対するこの方法の主な利点は、以下の通りである:(1)灌流装置の低コストおよびアクセス性。(2)ユーザーは、灌流全体を通して灌流装置内の圧力を手動で維持する必要はない。(3)シリンジ送達を介した灌流のための他の低コストの代替手段よりも低く、より一貫した灌流圧力。ベルヌーイの式を用いて、ここで構築された重力供給灌流装置は、灌流瓶を針に対して1mの標高に置いたときに、約73mmHgの灌流圧力を維持すると計算される。これがこれらの動物の収縮期血圧を有意に下回っていることを考えると、この灌流圧は血管破裂12を回避するのに十分低い可能性が高い。
著者らはこれまでに、この灌流システムを使用して、パーキンソン病のマウスモデルにおけるリン酸化α-シヌクレインの存在を検出することに成功している。この間、この灌流法ではポンプ灌流送達法には存在しないという重大な制限に遭遇していない。この技術の主な制限は、灌流対滴固定の時間のかかる性質です。この技術は、灌流がCNS構造への固定液のより深い浸透をもたらすように固着を落とすことが好ましい。この技術の2番目の制限は、胸腔への入り口に続いて心臓を素早くカニューレにしなければならないため、実行するために何らかの外科的スキルが必要であることである。しかし、経験上、訓練を受けたユーザーは、腹部への最初の切開から1分以内に心臓を日常的にカニューレートすることができる。

マウス中枢神経系(CNS)における病理の組織学的特徴付けは、神経変性の研究に使用される日常的な技術である。ニューロン組織は死後急速に分解するため、パラホルムアルデヒドなどの化学固定剤をCNS組織に送達してその形態を保存するのが一般的である1,2。化学固定は、固定液による全身灌流、または組織の単離および固定液への浸漬(「滴固定」と呼ばれる)のいずれかによって行うことができる。灌流は固定液送達の好ましい方法であり、滴下固定は深部CNS構造3、4、5への固定液の迅速な浸透を可能にしない可能性がある。さらに、椎骨柱から未固定の脊髄を除去することは困難であるため、灌流による固定液の送達は、脊髄の顕微鏡的および肉眼的解剖学のin situ保存を可能にし、組織を硬化させて除去中の損傷を最小限に抑える。
固定に必要な緩衝液および固定液の送達は、一般に、市販のポンプまたは空気圧を用いて行われる。灌流液の重力送達は、以下の理由により、ポンプ送達の代替として役立ち得る:(1)ポンプまたは空気圧送達は、場合によっては、灌流全体を通してシステム内の圧力を手動で維持することを必要とする場合がある。灌流液の重力送達は、ユーザの介入なしに維持することができる。(2)重力式灌流装置は、標準的な科学ベンダーから入手可能な材料を入手することにより、ユーザに低コストで構築することができる。本研究は、洗浄瓶とビニール管を用いた単純な重力灌流装置の構築方法を解説する。この研究は、パーキンソン病のマウスモデルを用いて、凍結切片化のために単離する前に脳および脊髄組織を灌流する上でのこのシステムの有効性を実証した。この研究は、動物から固定組織を解剖し、組織を急速に凍結/埋め込みおよび凍結切除し、間接免疫蛍光顕微鏡を介して脳と脊髄の両方におけるリン酸化α-シヌクレインの存在を検出するために必要なすべてのステップ、技術、および材料を包括的に記述している。

<table><tbody><tr><td>2-メチルブタン(認定ACS)、フィッシャーケミカル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03551-4</td><td></td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.Tコンパウンド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC1029572</td><td></td></tr><tr><td>アートマンインスツルメンツ4.5 "ストレートCastroveijoスプリングアクションはさみアマゾン</td><td></td><td>B0752XHK2X</td><td>"ファインハサミ"</td></tr><tr><td>BD一般使用およびPrecisionGlide皮下注射針、18 g</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-826-5D</td><td></td></tr><tr><td>BD ジェネラルユースおよびPrecisionGlide 皮下注射針、22 G</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-826B</td><td></td></tr><tr><td>コーニング PES シリンジフィルター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-754-29</td><td></td></tr><tr><td>Cytiva HyClone リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、10x</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>SH30258</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 50 mL 円錐形遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーバイオ試薬ウシ血清アルブミン(BSA)プロテアーゼフリーパウダー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド湾曲ミディアムポイント汎用鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>16-100-110</td> <td>"湾曲穴鉗子"</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド湾曲超微細精密先端鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>16-100-123</td> <td>"湾曲した細い鉗子「</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド使い捨て目盛り付きトランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド高精度ストレートテーパー超微細ポイントピンセット/鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-000-122</td><td>」ストレートファイン鉗子」</td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランド 丸みを帯びた端のマイクロスパチュラ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>21-401-5</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド磁器ブフナー漏斗固定穴あきプレート</td><td>付きフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB966J</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランドプレミアムカバーガラス、24 x 50</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドプレミアム組織鉗子1X2歯5インチ。ドイツスチール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>13-820-074</td><td>「皮膚鉗子」</td></tr>フィ<tr><td>ッシャーブランド再利用可能なヘビーウォールフィルターフラスコフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィアサイエンティフィ</td>ック<td>FB3002000</td><td></td></tr>フィ<tr>ッシャーサイエンティフィックスタンダードディス<td>セクションハサミ</td>フィッシャー<td>サイエンティフィック</td><td>08-951-20</td><td>「解剖ハサミ」</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド使い捨て滅菌シリンジ</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-955-464</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド ストレート ロッキング止血剤</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>16-100-115</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド スーパーフロスト プラス 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド ビニール チューブおよびコネクタ キット、1/4 インチ。</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-174-1C</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド湿式強化定性的濾紙サークルフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>09-790-12F</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドYコネクタ、1/4インチ。ID - ポリプロピレン - QC</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-000-686</td><td></td></tr><tr><td>ガーベイエコノミー シングルエッジカッターブレード</td><td>アマゾン</td><td>B001GXFAEQ</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG(H + L)二次抗体、DyLight 488</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35552</td><td></td></tr><tr><td>理想クランプスタント高圧クランプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-198-5A</td><td>「ホースクランプ」</td></tr><tr><td>アイメブ株式会社 さくらアキュエッジ ロープロファイル ミクロトームブレード 使い捨て</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9822467</td><td></td></tr><tr><td>川澄 25ゲージ 標準翼付き採血セット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>22-010-137</td> <td>「バタフライニードル」</td></tr> <tr><td>キンバリークラークプロフェッショナル キムテックサイエンス キムワイプ デリケートタスクワイパー 1プライ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>分子プローブ ProLong Diamond 退色防止剤 DAPI</td><td>付き Fisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Narrow-Mouth Right-to-Know LDPE Wash Bottles</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2425-0506</td> <td>"buffer bottles"</td></tr> <tr><td>PAP pen</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Granular</td><td>Electron Microscopy Systems</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Glass Drying皿、34.9 x 24.9 x 6 cm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-242D</td><td></td></tr><tr><td>組換え抗アルファ-シヌクレイン (リン酸化 S129) 抗体 [EP1536Y]</td><td>abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-2.5kg</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼飲用カップ 18-oz</td><td>アマゾン</td><td>B0039PPO9U</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学用スクロース CAS: 57-50-1</td><td>米国 生物学的</td><td>S8010</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>US Biological</td><td>T8655</td><td></td></tr><tr><td>Vetone Fluriso Isoflurane USP</td><td>MWI 動物衛生</td><td>502017</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス中枢神経系の組織学的解析のための重力供給経心筋灌流法

A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System

マウスから単離された脳および脊髄標本の組織学的解析は、このモデル系における病理の評価のための一般的な慣行である。これらの繊細な組織の形態を維持するために、麻酔動物における心臓のカニューレ(経心経心灌流)を介してパラホルムアルデヒドなどの化学固定剤を投与することが日常的である。マウス心臓の経心経灌流は、伝統的に、このプロセスに必要な生理食塩水および固定液の両方を提供するために、蠕動ポンプまたは空気圧の使用に依存してきた。これらの方法に代わる容易にアクセスできる代替手段として、この研究は、ほとんどのハードウェア店で入手可能な材料を使用する重力供給式灌流送達方法の使用を実証する。 
この新しい灌流法を検証するために、この研究は、脳と脊髄の両方におけるリン酸化α-シヌクレインの高感度検出に必要なすべての後続のステップを実証する。これらのステップには、固定された脳および脊髄組織の解剖、組織の急速凍結/埋め込みおよび凍結切除、および免疫蛍光染色が含まれる。この方法は、固定液の全身送達をもたらすように、組織学的分析のために他の非ニューロン組織を調製するためにも使用され得る。

高品質の灌流は、肝臓、脊髄、および深部CNS構造に血液がないことによって示される(図4C および 図5G、H)。硬膜の下(例えば、静脈洞内)または硬膜と頭蓋骨との間に保持された血液は、この血液が脳実質内にないため、問題にならなかった。 図4A に見られる血液は、頭蓋骨と硬膜物質の間に位置するため、質の悪い灌流の問題や示唆にはなりません。新鮮な脳と脊髄は非常に柔らかく、取り扱い中に簡単に損傷します。適切に固定された組織は、比較して、しっかりしている。本研究は、この灌流法による組織の質と形態の保存を評価するため、ヒトA53T α-シヌクレインを発現する15ヶ月齢マウスと7ヶ月齢マウスの中脳および腰椎脊髄におけるリン酸化α-シヌクレインの検出を実証する(図6)。
A53T変異は、常染色体優性パーキンソン病(PD)の患者において過大評価されている。さらに、A53T変異を有するヒトα-シヌクレインは、マウス6、7で発現させた場合にヒトPDの特徴の多くを再現することができる。セリン129残基におけるα-シヌクレインのリン酸化は 、インビボ および インビトロで α-シヌクレイン凝集を誘導することが示されている8。ルーイ体は、PDまたはルーウィー体認知症9の患者に存在する古典的な組織学的所見である。Lewey体に存在するα-シヌクレインの大部分は、セリン12910、11でリン酸化されている。その結果、リン酸化α-シヌクレインの蓄積は、PD病態の組織学的重症度のマーカーとして使用される。本研究は、リン酸化α-シヌクレインが、ヒトA53T-α-synucleinを発現する7ヶ月齢の無症候性マウスと比較して、15.5ヶ月齢の症候性マウスにおいて有意に高いレベルで蓄積することを見出した。これは、脊髄の前角およびこれらのマウスの中脳における細胞病理学の富化を説明する報告と一致している。6この ことから、ここで説明する単純化された灌流法は、下流の組織学的特徴付けのためにCNS組織の高品質の固定を提供すると結論付けられる。
<img alt="蛍光顕微鏡;α-シヌクレインA53T、中脳、腰椎;DAPI、PS129染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63386/63386fig06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図6:パーキンソン病のマウスモデルからの中脳および腰椎脊髄組織におけるリン酸化α-シヌクレインの標識。 加齢(15.5ヶ月齢)の末期麻痺マウスを、7ヶ月齢の健康なマウスと比較する。両方のマウスは、パーキンソン様病理を誘導するヒトα-シヌクレインのミスフォールディングを起こしやすい変異変異体(A53T)を発現する。スケールバー = 100 μm (上部パネル) および 50 μm (下部パネル)。略語:α-シヌクレインのsyn-A53T=A53T変異体α;DAPI=4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;PS129=α-シヌクレインのリン酸化セリン129。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63386/63386fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

マウス中枢神経系の組織学的分析のための便利な重力供給灌流法が提示される。リン酸化α-シヌクレインの免疫蛍光検出は、パーキンソン病のマウスモデルにおいて実証されている。この研究はまた、経心経灌流、解剖、組織凍結/埋め込み、および凍結切片化ステップを包括的に記述している。

The histologic analysis of brain and spinal cord specimens isolated from mice is common practice for the assessment of pathology in this model system. To ...

このプロトコルは、マウスにおける固定液灌流の簡単な方法を提供し、多額の投資なしにCNS組織の組織学的研究を可能にする。ここで提示された重力灌流法の主な利点は、輸液装置が容易に入手可能な部品で構成できることである。この手順を実演するのは、Xin Jie Chen博士の研究室のMD-PhD学生であるArnav Ranaです。まず、鋭利なカミソリの刃を使用して、2本の500ミリリットルの洗浄ボトルから内側のストローをキャップのネジの内側に切り取ってトリミングします。各バッファーボトルの底に4×4センチメートルの正方形の穴をあけ、次に各ボトルの底に別の小さな穴を開けて、曲がったステンレス製のマイクロヘラを通過させます。次に、マイクロヘラにS字型の曲がりを作成し、バッファボトルを吊るすためのフックとして使用できるようにします。曲がったマイクロヘラをバッファーボトルの適切な開口部に挿入します。次に、長さ25センチメートルの2本のチューブを外側のボトルストロー出口にしっかりと接続し、これらのチューブの端をYコネクタと結合してから、長さ2メートルのチューブをYコネクタの自由端に接合します。1ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外した後、最初にカミソリの刃でプラスチックを採点し、次にシリンジプラスチックを鋭くスナップして、シリンジを先端から約6センチメートル離して切断する。シリンジの切断面をプラスチックチューブの自由端に十分な深さまで挿入し、しっかりとしたシールを確保します。次に、1 つのバッファー ボトルを PFA としてラベル付けし、もう 1 つを PBS としてラベル付けします。ボトルの開口部から約1/3の長さを測定し、この時点でボトルの円周の周りに線を引き、灌流液の適切な充填レベルを示します。大きなペーパークリップをまっすぐにした後、チューブの円周の周りに収まることができるループを作成し、このループをチューブの周りにシリンジのすぐ近くに配置し、適切なサイズの発泡スチロールブロックをガラストレイに置き、ペーパークリップの端を発泡スチロールブロックに入れてチューブを貼り付け、ペーパータオルを使用して、 ガラストレイの前端を約 2 cm 持ち上げます。1リットルのビーカーを蒸留水ですすぎた後、約800ミリリットルの18ミリオームの分子生物学グレードの水で満たします。ビーカーを電子レンジで3分間または水温が摂氏65度に達するまで加熱し、その後、ヒュームフードに保管された加熱または攪拌プレートの上に置きます。次に、攪拌棒を蒸留水ですすぎ、ビーカーに入れます。スターラーを起動し、ホットプレートを中火に回し、水温が摂氏70度を超えないようにします。サージカルマスク、手袋、および白衣を着用した後、40グラムのPFA粉末を測定し、それを加熱水に加え、次いでトランスファーピペットを使用して、溶液に数滴の5モル水酸化ナトリウムを加える。粉末を完全に溶解させる。粉末が完全に溶解していない場合は、必要に応じて水酸化ナトリウムをさらに加えます。すべてのPFAがほぼ溶解したら、攪拌と加熱を停止し、すぐに100ミリリットルの10x PBSを加え、18ミリオームの分子生物学グレードの水を使用してビーカーを1リットルのマークまで補充します。ビーカーをプラスチックラップで覆い、溶液が室温に達するまでマイナス20°Cの冷凍庫に入れます。適切な標準物質を使用してpHメーターを較正した後、ビーカーを攪拌プレート上に置いた状態で溶液のpHを測定する。pHが7.4に達するまで塩酸を加える。pHが低すぎる場合は、5モルの水酸化ナトリウムを加えてpHを上げます。次に、真空フラスコを真空に接続し、フラスコ内にろ紙を入れたクリーンセラミックブフナー漏斗を置きます。真空をオンにした後、4%PFA溶液を充填したトランスファーピペットを使用してろ紙を濡らし、次いで、すべての溶液が濾過されるまで濾紙上に溶液をゆっくりと注ぐ。ろ過後、使用時まで溶液を摂氏4度の光で保護された容器に保管してください。ヒュームフードに、発泡スチロール解剖ブロックをガラストレイに入れます。解剖ブロックに、手術中にマウスを拘束するための5〜6本の短い針と、灌流チューブを支えるための2本の長い針があることを確認してください。次に、灌流装置を蒸留水ですすいでください。すべての水が排水されたら、灌流する動物の1メートル上に豊富なボトルを吊り下げ、分子生物学グレードの水で希釈した10x PBSを使用して非滅菌の1x PBSを調製します。止血装置を使用して灌流装置のメインラインをクランプし、PFAラインを別の止血剤でクランプします。バッファー容器にPBSを充填した後、灌流装置のシリンジ端部をビーカーに入れ、廃バッファーを回収し、メインラインを閉塞する止血剤を除去する。PBSがラインを通って流れる間、チューブの壁を激しく叩いて閉じ込められた空気を取り除きます。バッファとメインラインからすべての空気が取り除かれたら、メインラインにヘモスタットを配置して流れを遮断します。次に、PFAラインから止血剤を除去し、PFAライン内の気泡を叩き出しながら、PBSをPFAボトルまで逆行的に流動させる。PBSがボトルの開口部のすぐ上に見えるまでPFAラインにPBSを入れ続け、次にPFAラインを止水で塞いでPFAボトルへのPBSの流れを止めます。次に、バタフライ注入針を灌流シリンジに接続し、メインライン止血剤を開いてPBSをラインを通してフラッシュし、灌流シリンジから気泡を除去する。気泡が取り除かれたら、メインライン止血剤を閉じます。PBS ボトルが約 1/3 PBS でいっぱいになっていることを確認します。必要に応じて、PBS をメインラインからフラッシュするか、PBS をバッファ ボトルにフル容量の 1/3 まで充填します。PBS、PFA、およびメインラインからすべての気泡が除去されたら、PFAボトルに4%PFA溶液を室温で充填し、ボトルの黒いマークまで充填します。次に、まず必要な器具を水で洗浄し、次に70%エタノールで洗浄して、生存しない手術の準備をします。麻酔をかけたC57 black 6Jマウスを発泡スチロールブロックに固定した後、皮膚鉗子で腹部皮膚を持ち上げ、大きなはさみで腹壁を切断して手術を開始します。腹部切開を肝臓に向かって優位に続け、次に肝臓を前腹壁から切り離し、横隔膜に向かって優位に初期切開を続ける。切開部が横隔膜に到達したら、細かく解剖するはさみを使用して、横隔膜に穴を開け、マウスの右側の肋骨を右腋窩のほぼ半分に切り込み、横隔膜の左側を通って左腋窩までほぼ完全に同様の、しかしより長い切開を行う。胸壁を反射し、発泡スチロールブロックに固定します。左心室を特定した後、細かく湾曲した鉗子を使用して、軽い圧力で心臓を安定させ、PBSが針を通って流れるようにメインライン止血剤を開き、直ちに左心室を針で突き刺す。針が心室に0.5センチメートル以内に挿入されていることを確認してください。次に、2本の大きな18ゲージの針で発泡スチロールで作られたXの上にバタフライチューブを置きます。肝臓から出る下大静脈を特定し、細かく解剖するハサミを使用してトランセクトします。下大静脈から流出した液体が無血になるまでPBS灌流を続け、その後迅速に働き、PBSラインを止血剤で閉塞し、PFAラインを開く。尾部がカールし始めるまで、PFA が数分間灌流するのを許します。尾がカールし始めたら、50分のタイマーを開始します。50分後、止血で本線を閉塞し、左心室から針を引き抜く。次に、マウスを4°CのPFA溶液の標識容器に一晩置く。高品質の灌流は、肝臓、脊髄および深部中枢神経系構造に血液がないことによって示される。脳内で観察される血液は頭蓋骨と硬膜の間に位置しているため、質の悪い灌流の問題や示唆にはなりません。この灌流法に続くα-シヌクレインの検出は、リン酸化α-シヌクレインが、ヒトA53Tα-シヌクレインを発現する7ヶ月齢の無症候性マウスと比較して、15.5ヶ月齢の症候性マウスにおいて有意に高い蓄積を示す。この結果は、脊髄の前角およびこれらのマウスの中脳における細胞病理学の富化を記載する報告と一致している。胸腔にアクセスするときに腹部器官が切断されないことが重要です。さらに、灌流針は左心室内に深く置きすぎてはならない。

a-gravity-fed-transcardial-perfusion-method-for-histologic-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は経心臓的マウスの灌流、脳の除去と切片だけでなく、免疫ペルオキシダーゼ染色、樹脂の埋め込み、および脳切片の切片極薄のためのプロトコルについて説明します。これらの手順が完了すると、免疫染色の材料は、透過型電子顕微鏡による検査のための準備ができています。...

免疫電子顕微鏡のためのマウスの脳組織の準備

出典:Schönherr, S., et.al. は、マウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力特異的配置を調べるために、光遺伝学的免疫標識と凍結骨折レプリカ免疫標識を組み合わせました。J. Vis.

マウス脳組織の凍結破砕標本における神経膜タンパク質の免疫標識

成人老化マウスからの単一ニューロンの活性は、特定の脳領域のニューロンを解離し、蛍光膜電位色素イメージングを用いて研究することができる。グルコースの変化に対する応答を試験することによって、この手法は、成体腹内側視床下部ニューロンのグルコース感受性を研究するために使用することができる。...

グルコース感知を勉強する成体マウス由来の膜視床下部腹内側部のニューロンの電位色素イメージング

初期の脳の腫瘍微小環境を入力する免疫細胞の数および活性化状態に対する時間依存の定量的データをもたらす神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析のための簡単​​な方法は、ここに提示しました。...

神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

このプロトコールは、成体マウス中枢神経系におけるマクロファージ亜集団のフローサイトメトリーによる分析を提供し、これらの細胞によって発現される複数のマーカーの研究に有用である。...

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

透過型電子顕微鏡と子宮内で伝達の組み合わせは、開発中に神経系の細かい微細構造の形態学的変化を研究するための強力なアプローチです。これらの併用は、神経可塑性の地形表現に関しての基になる構造の詳細の変更への深い洞察をことができます。...

子宮内開発のマウスの脳および脊髄の伝達の後の微細構造神経可塑性パラメーターの評価

マウスの脳や脊髄から取り出した異なる細胞の種類を同時に同定するためのフローサイトメトリー法を提示する。この方法は、神経変性疾患における純粋な細胞集団を単離または特徴付けたり、ウイルスベクターまたはナノ粒子の生体内投与を標的とする細胞の程度を定量化するために利用され得る。...

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

プロトコルは、膀胱、前立腺、性器、骨、筋肉および足の皮膚を含むマウス下半身の上皮灌流に記載されている。...

マウスにおける下腹部および後肢の脳閉回路灌流における確立

前向き灌流法により、高品質のマウスの心臓細胞を単離するためのシンプルe...

マウスからの心筋細胞分離のための前向きの灌流法

このプロトコルは、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳組織学的研究のための効率的で再現可能なアプローチを記述する。...

マウス脳のフリーフローティング免疫染色

この研究は、単離された脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いた全体的なヒストン修飾の定量化のためのプロトコルについて説明しています。この研究には、データ収集に使用されたミクログリア分離プロトコルも含まれています。...

単離マウス脳ミクログリアにおける核内フローサイトメトリーを用いたグローバルヒストン翻訳後修飾の定量化

学ぶマウス中枢神経系の重力供給経心筋灌流法による組織学的解析。パーキンソン病モデルでリン酸化α-シヌクレインの免疫蛍光検出を実証し、費用対効果の高い組織固定プロトコルを提供する。

マウス中枢神経系の組織学的解析のための重力供給経心筋灌流法

さらに動画を探す