マウス中枢神経系の組織学的解析のための重力供給経心筋灌流法
2022年1月21日
マウス中枢神経系の組織学的分析のための便利な重力供給灌流法が提示される。リン酸化α-シヌクレインの免疫蛍光検出は、パーキンソン病のマウスモデルにおいて実証されている。この研究はまた、経心経灌流、解剖、組織凍結/埋め込み、および凍結切片化ステップを包括的に記述している。
このプロトコルは、マウスにおける固定液灌流の簡単な方法を提供し、多額の投資なしにCNS組織の組織学的研究を可能にする。ここで提示された重力灌流法の主な利点は、輸液装置が容易に入手可能な部品で構成できることである。この手順を実演するのは、Xin Jie Chen博士の研究室のMD-PhD学生であるArnav Ranaです。
まず、鋭利なカミソリの刃を使用して、2本の500ミリリットルの洗浄ボトルから内側のストローをキャップのネジの内側に切り取ってトリミングします。各バッファーボトルの底に4×4センチメートルの正方形の穴をあけ、次に各ボトルの底に別の小さな穴を開けて、曲がったステンレス製のマイクロヘラを通過させます。次に、マイクロヘラにS字型の曲がりを作成し、バッファボトルを吊るすためのフックとして使用できるようにします。
曲がったマイクロヘラをバッファーボトルの適切な開口部に挿入します。次に、長さ25センチメートルの2本のチューブを外側のボトルストロー出口にしっかりと接続し、これらのチューブの端をYコネクタと結合してから、長さ2メートルのチューブをYコネクタの自由端に接合します。1ミリリットルのシリンジからプランジャーを取り外した後、最初にカミソリの刃でプラスチックを採点し、次にシリンジプラスチックを鋭くスナップして、シリンジを先端から約6センチメートル離して切断する。
シリンジの切断面をプラスチックチューブの自由端に十分な深さまで挿入し、しっかりとしたシールを確保します。次に、1 つのバッファー ボトルを PFA としてラベル付けし、もう 1 つを PBS としてラベル付けします。ボトルの開口部から約1/3の長さを測定し、この時点でボトルの円周の周りに線を引き、灌流液の適切な充填レベルを示します。
大きなペーパークリップをまっすぐにした後、チューブの円周の周りに収まることができるループを作成し、このループをチューブの周りにシリンジのすぐ近くに配置し、適切なサイズの発泡スチロールブロックをガラストレイに置き、ペーパークリップの端を発泡スチロールブロックに入れてチューブを貼り付け、ペーパータオルを使用して、 ガラストレイの前端を約 2 cm 持ち上げます。1リットルのビーカーを蒸留水ですすぎた後、約800ミリリットルの18ミリオームの分子生物学グレードの水で満たします。ビーカーを電子レンジで3分間または水温が摂氏65度に達するまで加熱し、その後、ヒュームフードに保管された加熱または攪拌プレートの上に置きます。
次に、攪拌棒を蒸留水ですすぎ、ビーカーに入れます。スターラーを起動し、ホットプレートを中火に回し、水温が摂氏70度を超えないようにします。サージカルマスク、手袋、および白衣を着用した後、40グラムのPFA粉末を測定し、それを加熱水に加え、次いでトランスファーピペットを使用して、溶液に数滴の5モル水酸化ナトリウムを加える。
粉末を完全に溶解させる。粉末が完全に溶解していない場合は、必要に応じて水酸化ナトリウムをさらに加えます。すべてのPFAがほぼ溶解したら、攪拌と加熱を停止し、すぐに100ミリリットルの10x PBSを加え、18ミリオームの分子生物学グレードの水を使用してビーカーを1リットルのマークまで補充します。
ビーカーをプラスチックラップで覆い、溶液が室温に達するまでマイナス20°Cの冷凍庫に入れます。適切な標準物質を使用してpHメーターを較正した後、ビーカーを攪拌プレート上に置いた状態で溶液のpHを測定する。pHが7.4に達するまで塩酸を加える。
pHが低すぎる場合は、5モルの水酸化ナトリウムを加えてpHを上げます。次に、真空フラスコを真空に接続し、フラスコ内にろ紙を入れたクリーンセラミックブフナー漏斗を置きます。真空をオンにした後、4%PFA溶液を充填したトランスファーピペットを使用してろ紙を濡らし、次いで、すべての溶液が濾過されるまで濾紙上に溶液をゆっくりと注ぐ。
ろ過後、使用時まで溶液を摂氏4度の光で保護された容器に保管してください。ヒュームフードに、発泡スチロール解剖ブロックをガラストレイに入れます。解剖ブロックに、手術中にマウスを拘束するための5〜6本の短い針と、灌流チューブを支えるための2本の長い針があることを確認してください。
次に、灌流装置を蒸留水ですすいでください。すべての水が排水されたら、灌流する動物の1メートル上に豊富なボトルを吊り下げ、分子生物学グレードの水で希釈した10x PBSを使用して非滅菌の1x PBSを調製します。止血装置を使用して灌流装置のメインラインをクランプし、PFAラインを別の止血剤でクランプします。
バッファー容器にPBSを充填した後、灌流装置のシリンジ端部をビーカーに入れ、廃バッファーを回収し、メインラインを閉塞する止血剤を除去する。PBSがラインを通って流れる間、チューブの壁を激しく叩いて閉じ込められた空気を取り除きます。バッファとメインラインからすべての空気が取り除かれたら、メインラインにヘモスタットを配置して流れを遮断します。
次に、PFAラインから止血剤を除去し、PFAライン内の気泡を叩き出しながら、PBSをPFAボトルまで逆行的に流動させる。PBSがボトルの開口部のすぐ上に見えるまでPFAラインにPBSを入れ続け、次にPFAラインを止水で塞いでPFAボトルへのPBSの流れを止めます。次に、バタフライ注入針を灌流シリンジに接続し、メインライン止血剤を開いてPBSをラインを通してフラッシュし、灌流シリンジから気泡を除去する。
気泡が取り除かれたら、メインライン止血剤を閉じます。PBS ボトルが約 1/3 PBS でいっぱいになっていることを確認します。必要に応じて、PBS をメインラインからフラッシュするか、PBS をバッファ ボトルにフル容量の 1/3 まで充填します。
PBS、PFA、およびメインラインからすべての気泡が除去されたら、PFAボトルに4%PFA溶液を室温で充填し、ボトルの黒いマークまで充填します。次に、まず必要な器具を水で洗浄し、次に70%エタノールで洗浄して、生存しない手術の準備をします。麻酔をかけたC57 black 6Jマウスを発泡スチロールブロックに固定した後、皮膚鉗子で腹部皮膚を持ち上げ、大きなはさみで腹壁を切断して手術を開始します。
腹部切開を肝臓に向かって優位に続け、次に肝臓を前腹壁から切り離し、横隔膜に向かって優位に初期切開を続ける。切開部が横隔膜に到達したら、細かく解剖するはさみを使用して、横隔膜に穴を開け、マウスの右側の肋骨を右腋窩のほぼ半分に切り込み、横隔膜の左側を通って左腋窩までほぼ完全に同様の、しかしより長い切開を行う。胸壁を反射し、発泡スチロールブロックに固定します。
左心室を特定した後、細かく湾曲した鉗子を使用して、軽い圧力で心臓を安定させ、PBSが針を通って流れるようにメインライン止血剤を開き、直ちに左心室を針で突き刺す。針が心室に0.5センチメートル以内に挿入されていることを確認してください。次に、2本の大きな18ゲージの針で発泡スチロールで作られたXの上にバタフライチューブを置きます。
肝臓から出る下大静脈を特定し、細かく解剖するハサミを使用してトランセクトします。下大静脈から流出した液体が無血になるまでPBS灌流を続け、その後迅速に働き、PBSラインを止血剤で閉塞し、PFAラインを開く。尾部がカールし始めるまで、PFA が数分間灌流するのを許します。
尾がカールし始めたら、50分のタイマーを開始します。50分後、止血で本線を閉塞し、左心室から針を引き抜く。次に、マウスを4°CのPFA溶液の標識容器に一晩置く。
高品質の灌流は、肝臓、脊髄および深部中枢神経系構造に血液がないことによって示される。脳内で観察される血液は頭蓋骨と硬膜の間に位置しているため、質の悪い灌流の問題や示唆にはなりません。この灌流法に続くα-シヌクレインの検出は、リン酸化α-シヌクレインが、ヒトA53Tα-シヌクレインを発現する7ヶ月齢の無症候性マウスと比較して、15.5ヶ月齢の症候性マウスにおいて有意に高い蓄積を示す。
この結果は、脊髄の前角およびこれらのマウスの中脳における細胞病理学の富化を記載する報告と一致している。胸腔にアクセスするときに腹部器官が切断されないことが重要です。さらに、灌流針は左心室内に深く置きすぎてはならない。
概要
この研究は、マウスの中枢神経系の組織学的分析のための便利な重力による灌流法を提示します。このプロトコルは、パーキンソン病のマウスモデルにおけるリン酸化α-シヌクレインの免疫蛍光検出を実証し、経心臓灌流、組織解剖、凍結、埋め込み、および断片化のステップを詳細に説明しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 組織学
- パーキンソン病研究
背景
- 組織学的研究は中枢神経系疾患の理解に不可欠です。
- 効果的な組織保存技術は免疫蛍光検出を向上させます。
- 重力による灌流法は機器コストを削減できます。
研究目的
- マウスのための簡単で費用対効果の高い灌流法を提示すること。
- 中枢神経系組織の組織学的分析を可能にすること。
- パーキンソン病モデルにおける免疫蛍光染色を実証すること。
使用された方法
- この研究は一般的な実験室材料を使用した重力灌流法を詳細に説明しています。
- パーキンソン病のマウスモデルがプロトコルに使用されています。
- 主要なステップには、灌流液の調製、装置の組み立て、および組織の取り扱いが含まれます。
- 重要なタイムラインには、PFA溶液の調製と灌流の実行のための特定のプロセスが含まれます。
主要な結果
- この方法は免疫蛍光分析のための中枢神経系組織の効果的な固定を可能にします。
- リン酸化α-シヌクレインの検出が成功裏に実証されました。
- 結果は神経変性疾患のメカニズムを研究するためにこの方法を使用する可能性を強調しています。
結論
- この研究は中枢神経系組織の組織学的研究のための信頼できるプロトコルを提供します。
- 結果はパーキンソン病における主要なバイオマーカーを分析する能力を向上させます。
- 疾患の文脈における神経メカニズムの理解への影響は重要です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This gravity-fed perfusion method provides a cost-effective, accessible approach for preparing mouse CNS tissues for histologic analysis, supporting target validation and biomarker detection in neurodegenerative disease models. By enabling reliable fixation and subsequent immunofluorescent staining of phosphorylated α-synuclein, the method enhances predictive confidence in preclinical studies of Parkinson's disease pathology. The technique supports early discovery workflows by reducing equipment barriers while maintaining tissue integrity for downstream analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through sensitive detection of phosphorylated α-synuclein as a disease biomarker.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing consistent tissue fixation for reproducible immunohistochemical analysis.
- Predictive Value: Facilitates target confidence by allowing comparison of pathology between symptomatic and asymptomatic disease models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream immunofluorescent screening applications.
- Reproducibility: Delivers standardized tissue fixation enabling quantitative and comparable readouts across experiments.
- Platform Utility: Uses accessible components to support scalable and reusable perfusion setups in discovery laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with Parkinson's disease models by enabling detection of cytopathology in spinal cord and midbrain regions.
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation through consistent histologic preparation.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides histologic evidence to inform go/no-go decisions in target validation cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supporting histologic preparation for target validation, assay development, and preclinical evaluation of neurodegenerative disease mechanisms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through reliable CNS tissue preservation.
- Screening: Enables assay readiness by delivering fixed tissues suitable for immunofluorescent staining and imaging.
- Analytics: Generates quantitative histologic outputs that allow comparison of biomarker expression across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via consistent tissue preparation for biomarker analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable perfusion capability using low-cost, widely available materials.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by enabling sensitive detection of disease-associated biomarkers.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through a simple, gravity-driven perfusion system.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by supporting early, mechanistically informative histologic analysis.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing histologic evidence of target engagement and pathology progression.
Implementation Considerations
- Requires basic laboratory skills in solution preparation, tubing assembly, and animal handling.
- Needs standard lab equipment including glass trays, tubing, connectors, syringes, and temperature control for PFA preparation.
- Demands cross-team standardization of perfusion timing, fixative volume, and needle placement for consistent results.
- Involves adaptation considerations for different mouse strains, ages, and fixation durations based on target antigen stability.
- Includes practical limitations such as the need to avoid excessive needle depth in the left ventricle and prevent abdominal organ damage during thoracic access.
