Name: in vitroで薬物誘発性肝毒性を評価するためのヒト肝臓微小生理学的システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶ 薬物誘発性肝毒性評価法：ヒト肝臓微小生理学的システムを用いて、4週間にわたり機能的な肝微小組織を維持し、新規化合物の安全性を正確に予測する前臨床試験手法です。

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CN Bio Innovations Ltd.がこの研究に資金を提供しました。

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<li>Li, F., Cao, L., Parikh, S., Zuo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spheroids+with+primary+human+liver+cells+and+differential+roles+of+kupffer+cells+in+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spheroids with primary human liver cells and differential roles of kupffer cells in drug-induced liver injury.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (6), 1912-1923 (2020).</li>
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<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministically+patterned+biomimetic+human+iPSC-derived+hepatic+model+via+rapid+3D+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+united+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Deterministically patterned biomimetic human iPSC-derived hepatic model via rapid 3D bioprinting.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the united States of America. 113 (8), 2206-2211 (2016).</li>
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<li>Rowe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfused+human+hepatocyte+microtissues+identify+reactive+metabolite-forming+and+mitochondria-perturbing+hepatotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Perfused human hepatocyte microtissues identify reactive metabolite-forming and mitochondria-perturbing hepatotoxins.</a> Toxicology in Vitro. 46, 29-38 (2018).</li>
<li>Rubiano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+reproducibility+in+using+a+liver+microphysiological+system+for+assaying+drug+toxicity%2C+metabolism%2C+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Characterizing the reproducibility in using a liver microphysiological system for assaying drug toxicity, metabolism, and accumulation.</a> Clinical and Translational Science. 14 (3), 1049-1061 (2021).</li>
<li>Tsamandouras, N., Kostrzewski, T., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Hughes, D. J., Cirit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+population+variability+in+hepatic+drug+metabolism+using+a+perfused+three-dimensional+human+liver+microphysiological+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of population variability in hepatic drug metabolism using a perfused three-dimensional human liver microphysiological system.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 360 (1), 95-105 (2017).</li>
<li>Ortega-Prieto, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+microfluidic+liver+cultures+as+a+physiological+pre-clinical+tool+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D microfluidic liver cultures as a physiological pre-clinical tool for hepatitis B virus infection.</a> Nature Communications. 9 (1), 682(2018).</li>
<li>Kostrzewski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+perfused+human+in+vitro+model+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional perfused human in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 23 (2), 204-215 (2017).</li>
<li>Kostrzewski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microphysiological+system+for+studying+nonalcoholic+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">A microphysiological system for studying nonalcoholic steatohepatitis.</a> Hepatology Communications. 4 (1), 77-91 (2020).</li>
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<li>Long, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+therapeutic+antibody-small+molecule+drug-drug+interactions+using+a+three-dimensional+perfusable+human+liver+co-culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Modeling therapeutic antibody-small molecule drug-drug interactions using a three-dimensional perfusable human liver co-culture platforms.</a> Drug Metabolism and Disposition. 44, 1940-1948 (2016).</li>
<li>Bai, J., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+and+microphysiological+systems%3A+New+tools+for+ophthalmic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Organoids and microphysiological systems: New tools for ophthalmic drug discovery.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 407(2020).</li>
<li>Ribeiro, A. J. S., Yang, X., Patel, V., Madabushi, R., Strauss, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+microphysiological+systems+for+predicting+and+evaluating+drug+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Liver microphysiological systems for predicting and evaluating drug effects.</a> Clinical Pharmacology & Therapeutics. 106 (1), 139-147 (2019).</li>
<li>Clark, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microphysiological+system+model+of+therapy+for+liver+micrometastases+hhs+public+access%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">A microphysiological system model of therapy for liver micrometastases hhs public access.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1170-1179 (2014).</li>
<li>Qosa, H., Ribeiro, A. J. S., Hartman, N. R., Volpe, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+commercially+available+line+of+iPSC+hepatocytes+as+models+of+hepatocyte+function+and+toxicity+for+regulatory+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of a commercially available line of iPSC hepatocytes as models of hepatocyte function and toxicity for regulatory purposes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 110, 107083(2021).</li>
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すべての著者はCN Bio Innovations Limitedの従業員です。

MPSは、ヒト臓器の機能単位を in vitroで 再現するように設計されており、従来の3D細胞培養モデルの限界に対処するために開発されました27。肝臓はMPSを用いた最もモデル化された臓器の一つであり、多種多様なシステムが開発されています。ヒトの肝臓は、薬物代謝および毒性薬物代謝物の生成に関与しており、その機能は、化合物28のDILI責任の評価を含む、医薬品開発のモデルにとって重要な要素である。ここでは、肝臓MPSを使用してDILIを評価するための新しい方法を紹介しました。このプロトコルにより、アッセイされた各化合物について機構的な洞察を求め、DILIがどのように引き起こされるかを判断することができ、高感度で堅牢なアッセイでもあります。肝臓微小組織は、PHHとHKCの共培養であるMPSプレートで形成され、標準的な in vitro 肝臓モデルと比較して、高レベルのアルブミンおよび尿素産生および高いCYP3A4活性を備えた高機能です20。
ここで説明するDILIモデルは、医薬品開発プロセスにおける前臨床試験の後期段階で有用なツールとして機能しますが、いくつかの制限もあります。現在市場で入手可能なMPSの大部分として、それは低スループットプラットフォームであり、したがって、大規模な薬物スクリーニング活動に使用することはより困難です。PHHとHKCの共培養によって形成された微小組織で構成されるDILIモデルも、ヒト肝臓の複雑さを完全に捉えることができず、異なる種類の細胞(免疫細胞など)を組み込むことによるさらなる最適化は、既存のモデルに付加価値を与えるのに有益です。この単一臓器MPSは、共通の培地を共有し、細胞レベルまたは内分泌レベルで臓器クロストークを可能にし、肝臓自体に限定されない毒性の機構的洞察をよりよく理解するのに役立つ他の臓器プラットフォームと組み合わせることもできます。さらに、比較的新しいテクノロジーと同様に、コストがかかり、アクセスが制限されていると見なされる可能性があります。
MPSは、単一または複数のヒト組織の有機型モデルを開発するために使用されるプラットフォームです。システムは、コントローラ、アンビリカルケーブル、およびプレートが挿入されるMPSドライバで構成されています(図5A)。各肝臓MPSプレートには、操作された足場上で初代肝細胞を3Dで培養するための12個の独立したオープンウェルがあります。要約すると、システムはQCチェックされ、プレートは-1日目にプライミングされ、PHHとHKCはゼロ日目にプレートに播種されます(図5B、1を参照)。埋め込まれたマイクロポンプは、足場を通る細胞培養培地の循環を促進し、3D微小組織の形成を促進します(図5B、2を参照)。形成された微小組織は4日目にQCされ、48時間ごとに4日間異なる濃度の各化合物を投与され、8日目にエンドポイントバイオマーカーについてアッセイされます(図5C)。MPSプレートにおけるDILIアッセイの実験タイムラインを 図5Dに示す。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig05.jpg"> 図5:標準的なDILIアッセイの微小生理学的システムと実験タイムライン。 (A)マイクロ生理学的システムとそのコンポーネント:コントローラー(1)、アンビリカルケーブル(2)、ドッキングステーション(3)、MPSドライバー(4)、LC12プレート(5)。(B)1日目にLC12プレートにPHHとHKCを播種し(1)、埋め込まれたマイクロポンプにより、足場に播種された3D微小組織を通る調整可能な流速で細胞培養培地の循環が容易になります(2)。(C)研究の最後に足場を降ろす。(D)実験のタイムライン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
プロトコルを実行する際には、起動前に堅牢なシステムQCチェックを実行し、システムが空気圧で正しく機能していることを確認し、消耗プレートを効率的に検査してプライミングして、すべてのウェルで均一な機能を確認することが重要です。このプロトコルには高品質の初代ヒト細胞が不可欠であり、肝細胞は細胞培養実験で一貫して接着し、3D相互作用を形成することが知られています。これらの細胞の融解も重要なステップであり、初代肝細胞は急速に細胞死につながる可能性があるため、ピペッティング作用によって再懸濁されるべきではありません。大量の細胞破片が3D微小組織の形成を妨げるため、播種を成功させるには85%を超える細胞生存率を持つことが重要です。4日目に形成された肝臓微小組織のQCチェックも重要であり、範囲外のパラメータは質の悪い組織形成を示し、簡単なトラブルシューティングを可能にする可能性があるため、ユーザーはLDHと尿素の許容レベルが測定されていることを確認する必要があります。最後に、細胞培養培地に使用されるヒドロコルチゾンは、肝細胞の代謝機能を維持するために必要であるため、細胞培養機能に影響を与える可能性のある望ましくない分解を防ぐために、使用日に新鮮に調製する必要があります。
非常に複雑であるにもかかわらず、肝臓MPSはヒト肝臓のすべての細胞型を含むわけではありません。生理学的関連性を高めるためにモデル24、29にさらに細胞型を追加することは可能ですが、これらは使用の文脈に対する明確な正当化とともにのみ追加されるべきです。DILIを研究するためには、PHHが重要な細胞型であり、このモデルにHKCを組み込むことで、いくつかの免疫学的応答を決定することができます。また、ヒトの肝臓から単離されたPHHおよび市販の凍結保存されたPHHは、ロットごとにいくつかのばらつきを示す傾向があることにも注意する必要があります。ここでは、このプロトコルを高品質の細胞調製物とともに使用すると再現性のある結果が得られることを実証しました。ただし、ロット間の変動が予想され、これは複数のドナーのプールされたロットを使用することでさらに克服できます。これらの制限は、PHHsの多くの機能特性を再現し、医薬品開発プロセスで使用されてきたiPS細胞から分化した肝細胞様細胞を使用することによって克服することができた30。HKCはまた、ロット間の変動性が高く、解凍時に高レベルの活性化を示します。したがって、HKCのドナーは、実験的細胞培養(検証済みのPHHとの共培養)で使用する前に社内で事前に検証されており、解凍後の活性化のレベルが低い必要があります。これは、バイオマーカーIL-6およびTNF-αを測定することによって評価されます(補足資料を参照)。
ここに示されているデータは、アッセイがDILIを正確に検出できることを確認しており、2D10,11、さらには一部の3Dモデルでは検出されない可能性のある肝毒性物質を特定するのに役立ちます。MPSから生成されたデータは、サイト間の再現性を含むプロセスの標準化と調和が不足しているため、規制当局への提出や薬物スクリーニングの目的で製薬業界によって標準としてまだ使用されていません20。ここで示されているデータと実験的アプローチはこれに対処し、肝臓モデルをDILIスクリーニングで日常的かつ堅牢に使用して、新規化合物の責任を正確に予測できることを示しています。
さまざまなエンドポイントを測定して「肝毒性のシグネチャー」を生成することにより、さまざまなレベルのDILI懸念を持つ化合物(他のin vitro方法では検出できない化合物を含む)とその毒性メカニズムを特定するのに役立ちます。この技術は、従来の細胞培養と動物モデル、およびヒト臨床試験との間のギャップを埋めることができ、医薬品開発プロセスの一環として肝毒性の前臨床評価のためのヒト生物学的条件のシミュレーションに向けて前進します。

DILIは、米国とヨーロッパで急性肝不全の最も一般的な原因であり、医薬品開発プロセスにおける化合物の消耗の主な原因です1。ほぼすべてのクラスの薬物が肝毒性を引き起こす可能性があり、中枢神経系の薬剤と抗生物質は、患者にDILIを引き起こす最も一般的な治療法です2。薬物誘発性肝毒性は、遺伝的要因、非遺伝的要因、および環境要因の複雑な相互作用によって引き起こされ、肝細胞および胆管細胞および内皮細胞を含む他の肝細胞タイプの死につながります1,3。
DILI原因物質は2つの方法で分類できます:予測可能な用量依存性肝障害を引き起こすもの、またはまれで薬物用量、経路、または投与期間とは無関係に発症する特異体質DILIを引き起こすものの、米国のすべての急性肝不全の最大6分の1の原因となります4。残念ながら、DILIは、医薬品が医薬品開発プロセスの臨床段階に達するまで検出されないことがよくあります。薬物誘発性肝障害ランク(またはDILIrank)は、DILIを引き起こす可能性に応じて4つのクラスに分けられる1,000を超えるFDA承認薬で構成されており、患者での使用を注意深く監視する必要があります5。
薬物肝毒性のメカニズムの研究は依然として非常に困難であり、したがって、DILIのメカニズムを探索するために多くの前臨床モデルが開発されています。前臨床開発におけるDILIの予測に使用される現在のin vitroおよびin vivoモデルには、生体内の複雑で多面的な相互作用に関する洞察を提供する上でいくつかの制限があります。2Dで培養された癌性肝細胞株(すなわち、HepG2、HepaRG)は、候補化合物の毒性を評価するために、医薬品開発の初期段階で依然として使用されています6。それでも、これらの細胞株は単一ドナーからのものであり、異常なレベルの肝機能を示し、DILI 7,8の検出に対して常に高い感度を示すとは限りません。癌性肝細胞株の代替として、PHHは、in vitroで適切に培養すればヒトの肝臓生理機能をよりよく表しますが、薬物との短いインキュベーション時間、比較的短い寿命、肝遺伝子発現の喪失、薬物代謝機能の変化など、培養にはいくつかの制限があります9,10,11。.PHHは、標準的な2D細胞培養プレートの細胞外マトリックスタンパク質上で培養できますが、欠点として、機能が急速に低下するため、DILI予測に対する感度が低い(<50%)12。
一方、動物モデルでの試験は時間がかかり、費用がかかり、予測を人間に外挿するには種間の翻訳が必要です。新しく開発された医薬品のほとんどは承認を得ることができず、このプロセスには費用とリスクが伴います5。さらに、新しいヒト特異的モダリティを試験する場合、動物モデルは、遺伝子配列または免疫学的応答がヒトと異なるため、あまり適していません13。
その結果、より高度な3次元(3D)in vitro肝臓モデルへの関心が指数関数的に高まっています。PHHを、吊り下げドロップまたは超低付着面での重力凝集によって生成された回転楕円体構造として培養することは、複合負債を評価するためのハイスループットな方法を表しています14。PHHスフェロイドは、疾患の背景(脂肪症や胆汁うっ滞など)におけるDILIの評価に使用されています15。間質線維芽細胞16を有する肝細胞の播種マイクロパターン共培養16、3Dバイオプリントされた肝臓組織17、肝非実質細胞を有するまたは伴わない3Dスフェロイド培養15を含むように、多種多様なモデルが開発されている。ただし、これらの方法にはまだ欠点があり、より生理学的に関連する微小環境でPHHを培養することで、潜在的な肝毒性物質への長期曝露の調査を可能にするために、長期間にわたってより高いレベルの機能を提供できる可能性があります。さらに、任意の高度なインビトロPHH培養の翻訳関連性を改善するために、臨床的に関連する機能エンドポイントまたは毒性出力バイオマーカーを利用して、データをインビボまたは臨床シナリオで比較できるようにする必要があります18。
この研究では、臓器チップ(OOC)としても知られるMPSのin vitro肝臓モデルを使用して、肝毒性の詳細なメカニズムの側面を理解できるかどうかを評価しました。MPSは、高機能な3D肝臓微小組織をフロー下で最大4週間維持することが以前に示されています19。このシステムは最近FDAによってテストされ、薬物毒性、代謝、および細胞内蓄積を行う際に高い再現性を有することが示されている20。さらに、スフェロイドおよびサンドイッチ培養と比較すると、このシステムは、いくつかの薬物の毒性を検出する際に、より安定した機能とより高い感度を有していました20。現在まで、MPSはADME 21、疾患モデリング(HBV 22、NAFLD23、24、25)、および薬物間相互作用26をカバーする幅広いアプリケーションで使用されており、急性および慢性DILIの評価に非常に適している可能性があります。ここで紹介する技術は、従来の細胞培養と動物モデル、およびヒト臨床試験との間のギャップを埋めるための代替手段を提供し、医薬品開発プロセスの前臨床段階での候補化合物の肝毒性の評価をサポートするために、ヒト生物学的条件のシミュレーションに向けて前進します。

<table><tbody><tr><td>24ウェル細胞培養クラスタープレート 平底</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル透明アッセイプレート、平底透明プラスチック</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート 黒 平底</td><td>Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル ホワイト/クリアボトムプレート、TC 表面</td><td>ThermoScientific</td><td>165306</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM (1x)</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td>細胞培養培地。</td></tr><tr><td>AssayMax アルブミン ELISA キット</td><td>AssayPro</td><td>EA3201-1</td><td>希釈 1:250.タイムポイント 4、6、8 日目。</td></tr><tr><td>Cell Maintenance Cocktail B, (Primary Hepatocyte Maintenance Supplements)</td><td>Gibco</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9682</td><td>希釈 1:1.タイムポイント:8日目。</td></tr><tr><td>クロルプロマジン HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8138</td><td></td></tr><tr><td>クロマコールブルーの蓋、9 mm オートサンプラー バイアル スクリュー スクリュー キャップ</td><td>ThermoScientific</td><td>9-SCK(B)-ST1</td><td>ガラス バイアル</td></tr><tr><td>クロマコール バイアル、9 mm 透明ガラス スクリュー スクリュー バイアル</td><td>ThermoScientific</td><td>2-SVW</td><td></td></tr><tr><td>クラス 2 微生物学的安全キャビネット - Trimat2 1500 排気</td><td>封じ込め エア ソリューション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ 50 mL</td><td>Greiner</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>凍結保存肝細胞回収培地 (CHRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Gibco CM7000</td><td></td></tr><tr><td>凍結保存された初代ヒト肝細胞</td><td>BioIVT Europe</td><td>Lot.RAS</td><td></td></tr><tr><td>CytoTox 96 Cytotoxicty (LDH) Assay Kit</td><td>Promega</td><td>G1781</td><td>希釈 - なし。時点 4日目、6日目、8</td></tr><tr><td>日目>グラフとEC:50曲線を生成するために使用したデータ分析モデルは、非線形回帰(カーブフィット)非対称シグモイド、5PL、Xはlog(濃度</td><td>GraphPad プリズム9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てPESフィルターユニット 500mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>15913307</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てピペットベイスン 50ml</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12369175</td><td></td></tr><tr><td>DMSO(ジメチルスルホキシド)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>シグマ D2650</td><td></td></tr><tr><td>ダルベコS Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ (D-PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Easy Reader 円錐形ポリプロピレン遠心分離チューブ 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11889640</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Human ALT ELISA Kit</td><td>Abcam</td><td>&nbsp;ab 234578</td><td>希釈 1:5。タイムポイント:6日目と8日目。</td></tr><tr><td>人間の凍結保存されたKupffer細胞</td><td>ロンザヨーロッパ</td><td>ロット190088KC</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>メルク</td><td>H0888-1G</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーターモデル:ニューブランズウィック州&nbsp;ギャラクシー170 S、ニューブランズウィック&nbsp;Galaxy 170 RおよびCellXpert&reg;C170です。</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>オールは毎年サービスを受けており、ご要望に応じて書類作成も可能です。</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ライカ DMIL LED</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPS は Organ-on-a-Chip (OOC)</td><td>CN Bio Innovations Ltd.</td> として知られています。<td></td><td></td></tr><tr><td>MPS LC-12プレート</td><td>CN Bio Innovations Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー改良型Cチップ使い捨て血球計算盤(2チャンネル)</td><td>ケンブリッジバイオサイエンス</td><td>DHC-N01-50</td><td></td></tr><tr><td>P450-GLO CYP3A4アッセイおよびスクリーニングシステム</td>プロ<td>メガ</td><td>V9002</td><td>希釈-なし。時点:8日目</td></tr>:<tr><td>PhysioMimix MPSプラットフォーム</td><td>CN Bio Innovations Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピオグリタゾン</td><td>MedChemExpress Tocris</td><td>HY-13956/CS-1700</td><td></td></tr><tr><td>クォンティクロム尿素アッセイキット &ndash;バイオアッセイシステム</td><td>バイオアッセイシステム</td><td>DY970-05</td><td>希釈率 1:2 初期読み取り値が高すぎる場合。時点:4日目、6日目、8日目。</td></tr>すべての<tr><td>グラフの分析と生成に使用した</td>シリカゲルSigma-Aldrich S7625<td></td>ソフトウェアは、GraphPad Prism 9 <td></td><td></td></tr><tr><td>Stripettes 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11839660</td><td></td></tr><tr><td>Stripettes 25 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11839181</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Thawing plate Cocktail A, (Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements)Gibco CM3000 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Troglitazone</td><td>MedChemExpress Tocris</td><td>97322-87-7</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー ソリューション、0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>チューブ 1.5 mL</td><td>Greiner</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>計量天秤 - モデル PA214C および AV213C</td><td>Ohaus Corp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitroで薬物誘発性肝毒性を評価するためのヒト肝臓微小生理学的システム

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

DILIは医薬品開発における消耗の主な原因であり、1000を超えるFDA承認薬がヒトにDILIを引き起こす可能性があることが知られています。残念ながら、DILIは医薬品が臨床段階に達するまで検出されないことが多く、患者の安全を危険にさらし、製薬業界に大きな損失をもたらします。標準的な2DモデルにはDILIの検出に制限があることを考慮すると、データの翻訳可能性を向上させるために、より予測性の高いin vitroモデルを開発することが不可欠です。DILIの因果関係と機構を詳細に理解するために、ヒト初代肝実質細胞と非実質細胞(NPC)で構成され、灌流下で操作された足場上の3D微小組織で培養されたヒト肝臓MPSが開発されました。凍結保存された初代ヒト肝細胞(PHH)とクッパー細胞(HKC)をMPSプラットフォームで微小組織として最大2週間共培養し、目的の各化合物を7つの試験濃度で肝臓の微小組織に最大4日間繰り返し投与しました。肝機能を評価するために、機能的な肝臓特異的エンドポイント(アラニンアミノトランスフェラーゼ、ALTなどの臨床バイオマーカーを含む)を分析しました。さまざまなDILI重症度の化合物への急性および慢性曝露は、単回投与および複数回投与された微小組織に対する反応を比較することによって評価できます。.この方法論は、重度で軽度の肝毒性化合物の幅広いセットで検証されています。ここでは、肝不全を引き起こすために市場から撤退した有名な肝毒性化合物であるピオグリタゾンとトログリタゾンのデータを示します。全体として、肝臓MPSモデルは、DILIとその肝機能の変化との関連を評価するための有用なツールになり得ることが示されています。このモデルはさらに、新規化合物が異なる患者のサブセットでどのように振る舞うか、および毒性プロファイルが肝疾患の状態(ウイルス性肝炎、脂肪肝疾患など)によってどのように影響を受けるかを評価するために使用できます。

原稿には、DILIの評価に使用される肝臓MPSモデルが記載されています。MPSは、フロー下で最大4週間高機能を維持する3D肝臓微小組織の生成を容易にします。PHH / HKCは、コラーゲンでコーティングされた足場に播種されて肝臓の微小組織を形成し、成長培地で灌流され、QCチェックに合格した後、化合物が投与されます。ここでは、構造的に類似しているがDILI重症度が異なる2つの化合物であるトログリタゾンとピオグリタゾンのデータを示します。
4日目に、薬物投与の前に、形成された肝臓微小組織のQCチェックが評価され、LDH放出と尿素合成で構成されます(図1A)。QCは、肝臓MPSが非常に一貫性があり機能する肝臓微小組織を生成することを確認することを目的としています。ここに示されているデータは3つの実験から生成され、研究内および研究間の変動性が低く、良好なレベルの再現性を示しています。8日間の培養後、複数の健康および肝臓の指標(アルブミン、尿素、CYP3A4、ATP)が評価され、対照の微小組織は高レベルの肝機能と再現性を示します(図1B、C)。肝臓微小組織の造影顕微鏡およびIF染色( 補足資料を参照)は、足場のマイクロチャネル全体で高い播種一貫性を示し、PHH微小組織におけるHKCの分布を明らかにします(図1D)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig01.jpg"> 図1:肝臓MPSは、再現性の高いデータと一貫した微小組織を生成します。 (A)4日目の3D肝臓微小組織QCメトリック、および8日目の研究終了時の機能評価-(B)アルブミンと尿素、(C)CY3A4とATP)。データは3つの実験から収集されます。各実験では、3つの車両制御の反復がありました。示されているデータは平均±SD、N = 9です。(D)DILIを評価するための肝臓MPSプラットフォームでPHHとHKCを共培養することによって生成された3D肝臓微小組織の位相差顕微鏡(10倍および20倍)およびIF。HKCを可視化するために、HKCを播種する前に、eGFPを発現するアデノウイルスベクターで形質導入した( 補足資料を参照)。代表的な顕微鏡写真を示す。形質導入およびイメージングは、細胞局在を実証するための単独の実験として実施され、記載されたDILIプロトコルでは行われなかった。HKC細胞は、実験的な細胞培養で使用する前に社内で事前に検証されており、解凍後の活性化レベルが低い必要があります。これは、バイオマーカーIL-6およびTNF-αを測定することによって評価される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
トログリタゾンは重度のDILIを引き起こすことが知られています。2型糖尿病の治療のためのライセンスに続いて、その使用に関連する肝障害の頻度のために、市場で3年後にFDAによって撤回されました。現在まで、発表された動物実験では、トログリタゾンが重度の肝障害を引き起こす可能性を予測できませんでした。.この化合物の毒性は、標準的な in vitro 2D肝臓アッセイ14においても検出されなかった。
MPSの肝臓微小組織にトログリタゾンを96時間投与し、トログリタゾンへの急性曝露後、約15 x C maxでALTおよびLDH放出およびアルブミンおよび尿素産生の急速な減少によって検出された急性毒性反応、Cmax駆動を引き起こしました(図2A)。96時間曝露後にサンプリングされた細胞エンドポイント(ATP含量)およびCYP3A4活性(代謝生体内変化を評価するため)は、トログリタゾンおよびEC:50値によって引き起こされる毒性をさらに確認し、他のエンドポイントと非常に同等であった(図2B)。MPSで8日間培養した後に撮影された明視野顕微鏡画像は、ポジティブコントロールとトログリタゾンで処理された反復で見られる一般的な組織の死/分解とは対照的に、足場全体に均一に播種された健康な肝臓微小組織を明らかにします(図2C)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig02.jpg"> 図2:複数の肝毒性エンドポイントを使用したトログリタゾンのDILIリスクの決定。 肝臓微小組織を7つの試験濃度のトログリタゾンに96時間曝露し、(A)LDH放出、ALT放出、アルブミン産生、尿素合成、CYP3A4活性、およびATP含有量を比較しました。青い線 - 48時間のばく露(メディアエンドポイントのみ)、赤い線 - 96時間のばく露。陽性対照は100μMクロルプロマジンであった。すべてのエンドポイントは、同じ肝臓MPS培養から測定されます。示されているデータはSD±平均値であり、N=3である。(B)データから生成されたE:50番号の要約。N.D. = データはプロットできません。ライン=アッセイされていません。(C)8日間培養後の肝臓微小組織の代表的な明視野顕微鏡(倍率10倍)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ピオグリタゾンへの曝露後の肝毒性も調査されました。.ピオグリタゾンは、DILIの懸念が低いことが知られている化合物であり4、古典的な2D初代肝細胞培養物、さらにはいくつかのより高度な3Dモデルでも肝毒性を発揮しませんでした10,11。軽度の肝毒性効果は、両方の試験時点で観察されました(図3)。LDH または ALT の放出は検出されませんでした。しかし、48時間後、アルブミンと尿素の生成の穏やかな減少が観察され、約25x Cmaxでした(図3A)。ATP含量のごくわずかな減少も高ピオグリタゾン濃度で観察されたが、これは有意ではなかった。用量反応曲線から生成されたEC:50値を図3Bに示します。顕微鏡検査では、2つの最高試験濃度でピオグリタゾンに96時間曝露した後、わずかな微小組織の変化が明らかになりました(図3C)。結果は、軽度のDILI懸念のある化合物の毒性を検出する肝臓MPSの能力を示しています。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig03.jpg"> 図3:複数の肝毒性エンドポイントを使用したピオグリタゾンのDILIリスクの決定。 肝臓微小組織を7つの試験濃度のピオグリタゾンに96時間曝露し、(A)LDH放出、ALT放出、アルブミン産生、尿素合成、CYP3A4活性、およびATP含有量を比較しました。青い線 - 48時間のばく露(メディアエンドポイントのみ)、赤い線 - 96時間のばく露。陽性対照は100μMクロルプロマジンであった。すべてのエンドポイントは、同じ肝臓MPS培養から測定されます。示されているデータはSD±平均値であり、N=3である。(B)データから生成されたEC:50番号の要約。N.D. = データはプロットできません。ライン=アッセイされていません。(C)8日間培養後の肝臓微小組織の代表的な明視野顕微鏡(倍率10倍)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
in vivoまたは臨床シナリオ(LDH放出、尿素合成、アルブミン産生、CYP3A4活性、ATP含量、ALT放出)を表す可能性のあるすべての機能エンドポイントおよび毒性出力バイオマーカーを評価し、48時間および96時間の7点用量範囲で投与された両方の試験化合物について生成されたデータを裏付けることにより、「肝毒性の署名」をもたらすヒートマップが生成されました。 さまざまなレベルのDILI懸念を持つ化合物の特定に役立ちます(図4)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63389/63389fig04.jpg"> 図4:肝臓MPSによる「毒性の兆候」の決定。 7点線量範囲への48時間および96時間の曝露後の6つの機能的肝臓特異的エンドポイント(LDH放出、尿素合成、アルブミン産生、ALT放出、CYP3A4活性、およびATP含有量)からのトログリタゾンおよびピオグリタゾンのヒートマップ。各値は平均、N = 3として生成され、対照サンプルに正規化されます。カラーバーの値は、ベースラインコントロールに対する倍率の増加を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/63389fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足資料:微小組織の蛍光顕微鏡イメージングと細胞の事前認定評価。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63389/Supplementary%20Material-63389R1.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

薬物誘発性肝障害(DILI)は、薬物不全の主な原因です。肝臓微小生理学的システム(MPS)を使用して化合物のDILI負債を正確に予測するためのプロトコルが開発されました。肝臓モデルは、初代肝細胞と翻訳関連エンドポイントの共培養を使用して、治療に対する細胞応答を評価します。

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is ...

このプロトコルでは、高機能で代謝的に活性な肝微小組織を最大4週間維持できる微生物学的システムを使用して、in vitroで薬物誘発性肝障害を評価する方法を説明しています。このアプローチは、新規化合物に対する薬物誘発性肝障害責任を正確に検出するためのヒト特異的細胞培養モデルであり、単純な2D培養またはさらに複雑な3D培養よりも予測的です。この手法は、化合物が臨床開発を開始しても安全かどうかを判断するための一連の前臨床安全性試験の一部として使用できます。さまざまなモダリティをテストできます。コントローラーを細胞培養インキュベーターのドッキングステーションハウスに接続して、肝臓の微小生理学的システムのセットアップを開始します。コントローラーの背面にある乾燥剤ジャーに新しい乾燥剤が追加されていることを確認してください。ボートロッカースイッチを押してコントローラーの電源を入れた後、システムが安定して圧力に達するまで5分間待ちます。各プレートをパッケージから取り出します。次に、500マイクロリットルの予め温めた播種高度DMEM培地をリザーバ側に添加して各ウェルをプライミングする。ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに置きます。完了したら、液体がフィルターサポートを通過するまで、コントローラー画面でプライムプログラムを選択します。表面チャネルを覆うために、すべてのウェルに1.1ミリリットルの播種高度DMEM培地を充填します。プレート付きのドライバーを摂氏37度と5%の二酸化炭素のインキュベーターに入れた後、ドッキングステーションを接続し、インキュベートプログラムを実行します。PHHおよびHJCのバイアルを摂氏37度の水浴に保持して、氷のわずかなスライバーだけが残るまで解凍します。解凍したら、最大2本のPHHバイアルを、事前に温めた凍結保存された肝細胞回収培地であるCHRM培地のチューブに直接静かにピペットで入れます。次に、1ミリリットルのCHRMを使用して、クライオチューブから残りの細胞を洗い流します。HKCをクライオチューブから50ミリリットルの遠沈管内の10ミリリットルの氷冷播種アドバンスドDMEM培地に穏やかにピペットで入れます。その後、両細胞型を別々に室温で100倍Gで10分間遠心分離する。遠心分離後、上清を除去し、チューブに添加した細胞のバイアルあたり1ミリリットルを使用して、温かい播種高度DMEM培地および氷冷播種高度DMEM培地中のHKCsにPHHを再懸濁します。穏やかな揺動作用で細胞を再懸濁してから、氷の上に置きます。懸濁したら、細胞を数え、生存率を記録します。細胞の生存率は85%以上でなければなりません次に、ドライバーをドッキングステーションから外し、ドライバーを微生物学的安全キャビネットまたはMBSCに入れます。次に、培地を足場の上から停止点、チャネル、およびリザーバーまで吸引し、培養ウェルに0.2ミリリットルのデッドボリュームを残し、足場のすぐ上に到達します。400マイクロリットルの高度なDMEM培地をウェルチャンバーに追加してから、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、培地交換プログラムを3分間実行します。3 分後、ドッキング ステーションからドライバを取り外し、MBSC に戻します。上記の足場から各ウェルの停止点およびリザーバー端まで培地を吸引し、続いてチューブを穏やかに揺らしてPHHを再懸濁し、必要量の細胞懸濁液を各培養ウェルに追加します。細胞懸濁液を慎重にピペットでピペッティングし、プレート足場全体に細胞が均一に分散するようにします。HKCを注意深く再懸濁し、細胞懸濁液を各培養ウェルに追加します。すべてのウェルに両方の細胞タイプが含まれたら、物理的に接続せずにマイクロ生理学的システムまたはMPSドライバーをインキュベーター内のドッキングステーションに配置して1時間静置します。1時間が経過したら、ドライバーをドッキングステーションに接続し、シードプログラムを実行します。プログラムが2分で自動的に一時停止したら、インキュベーターからドライバーを取り外し、1, 000マイクロリットルの播種高度DMEM培地をチャネルにゆっくりと加えて、総容量1.4ミリリットルを達成します。その後、プレートをインキュベーターに移動し、残りのシードプログラムを8時間実行します。4日目に、コントローラーのプログラムを一時停止し、ドライバーとプレートをドッキングステーションから外します。それらを MBSC に転送します。ピペットを使用して各ウェルから約1ミリリットルの培地を手動で収集し、足場に触れて細胞培養を妨げることなく可溶性バイオマーカー分析を行います。採取した培地を4日目のサンプルとしてラベル付けし、乳酸デヒドロゲナーゼおよび尿素アッセイを品質管理チェックとして実行して、播種が成功したことを確認します。次に、培地交換を行ってプレート計画に従って各ウェルを投与する。完了したら、ドライバーをインキュベーターのドッキングステーションに戻し、インキュベートプログラムを実行します。6日目に、ドライバーとプレートをドッキングステーションから外し、MBSCに転送します。ピペットを使用して各ウェルから約1ミリリットルの培地を収集し、投与後48時間のサンプルとしてラベル付けし、後のアッセイのためにサンプルを摂氏マイナス80度で保存します。8日目に、ピンセットを使用してプレートから足場を取り外し、微小組織を乱すことなく、各ウェルにカルシウムとマグネシウムを含まない500マイクロリットルのDPBSを含む24ウェルプレートに足場を置きます。各足場のスナップショットを倒立光学顕微鏡で10倍の倍率で撮影します。4日目には、薬物投与の前に、形成された肝臓微小組織の品質管理チェックがLDH放出および尿素合成で実施されました。8日目に、アルブミン、尿素、CYP 3 A 4、ATPなどの複数の健康および肝臓の指標を評価して、微小組織における高レベルの肝機能と再現性を確認しました。肝微小組織における造影相顕微鏡およびIF染色により、PHH微小組織におけるHKCの均一な分布が明らかになった。肝臓微小組織のトログリタゾンへの急性曝露は毒性を引き起こし、これはアラニンアミノトランスフェラーゼまたはALTによって検出され、LDH放出およびアルブミンおよび尿素産生の急速な減少を引き起こした。ATP含量およびCYP3A4活性はトログリタゾンによる毒性を確認し、EC50値は他の評価項目と同程度であった。MPSで8日間培養した後に撮影された明視野顕微鏡画像は、ビヒクルコントロールの足場全体に均一に播種された健康な肝臓微小組織を明らかにします。組織死または分解は、ポジティブコントロールおよびトログリタゾンで処理した反復物において見られた。さらに、ピオグリタゾンへの曝露後の肝毒性も調査されました。.LDHまたはALTの放出は検出されなかったが、48時間後にアルブミンおよび尿素産生の軽度の減少が観察された。ATP含有量のわずかな減少は、高ピオグリタゾン濃度で観察された。EC50値は、用量反応曲線から生成した。顕微鏡検査では、テストされた2つの最高濃度でピオグリタゾンに96時間曝露した後、わずかな微小組織の変化が明らかになりました。この研究では、85%を超える品質と生存率の高い細胞の使用は、微小生理学的システムで高機能で健康な3D微小組織を生成するために不可欠です。この手順に続いて、非アルコール性デルタ肝炎や非アルコール性脂肪性肝疾患モデルなどの疾患モデルで、肝実質細胞と非実質細胞のトリプル培養を使用したアデニンと薬物間相互作用および薬物誘発性肝障害を評価できます。

human-liver-microphysiological-system-for-assessing-drug-induced

Research

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Biology

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